のための簡単なシート光顕微鏡を設定するトトでイメージングの C.虫開発
2014年5月5日
このプロトコルは、シート光顕微鏡のセットアップとCのin vivoイメージングのために、その実装について説明します虫の胚。
この手順の全体的な目標は、蛍光ライトシート顕微鏡を使用してCアラガンの開発を画像化することです。これは、まず、直立顕微鏡と小さな光機械要素のセットで構成されるライトシートベースの顕微鏡をセットアップしてライトシートを生成することによって達成されます。手順の2番目のステップは、胚をマウントすることです。
最後のステップは、ライトシートを胚に調整し、その発生を記録することです。その結果、CL eganの開発中に蛍光標識されたタンパク質のダイナミクスを、3Dおよびタイムラプスビデオの分析を通じて示すことができます。ライトシップ顕微鏡法が共焦点顕微鏡などの他の既存の方法よりも優れている点は、光毒性を抑えながらより高速なイメージングを可能にすることです。
第三に、この方法は、開発に対するシールについての洞察を提供することができます。また、リワールやゼブラフィッシュなどの他のシステムにも適用できます。手順のデモンストレーションが明確になります。
シェールズは私の研究室のエンジニアで、ポーリーン・リニアックはバンの研究室のエンジニアです。このセクションでは、セットアップアセンブリについて説明し、すべての実験で組み立てたままにしておくことができます。レーザー、フィルター、望遠鏡、潜望鏡をすべて光学テーブルに配置したら、シリンドリカルレンズを固定してライトシートを生成します。
ピントを合わせるためには、別のレンズを調整します。照明対物レンズの焦点は、検出対物レンズの物体の焦点と一致する必要があります。次に、ビームを壁またはスクリーンに投影し、投影の輪郭がシャープになるまで、照明対物レンズをビーム軸に沿って動かします。
クワッドライン蛍光フィルターとE-M-C-C-Dカメラを顕微鏡のセットアップに含めます。2 番目の手動移動ステージを最初のステージに垂直に固定します。アセンブリを既存の顕微鏡ステージにねじ込みます。
セットされたシリンドリカルレンズ照明対物レンズを取り外した後、アセンブリを顕微鏡に置き、照明セットをステージに戻します。照明光路と検出路の垂直交点にqveホルダーを取り付けます。次に、ライトシートを確認します。
ガラス製の獣医にフルオレセイン溶液を入れ、ステージ上のホルダーに入れます。ライトシートが見えているはずです。検出対物レンズに対して水平で中央に配置する必要があります。
次に、シリンドリカルレンズを取り外します。照明対物レンズの3D平行移動でライトシートを最適化し、画像を取得してライトシートの厚さを測定します。これは、対物レンズの絞りに依存します。
その後、必ずシリンドリカルレンズを交換してください。まず、厚さ1mmのガラスを10mm×20mmに切ります。ひし形のマーキングペンを使用します。
次に、20マイクロリットルのポリLリジンを片面に加え、乾いたら2枚目のスライドに並置します。固定位置に5%寒天を一滴加え、3枚目のスライドセットの重さで滑らかにします。寒天が乾いたら、3枚目のスライドを取り外し、ポリLリジンを含まないスライド上で残りの2つのスライドの端から3ミリメートルの寒天パッドをカットします。
次に、固定スライドを取り外し、寒天の張り出しを残します。寒天に20マイクロリットルのポリLリジンをコーティングし、乾燥させます。次に、Mナイン培地で満たされた時計のグラスにGRワームを解剖顕微鏡で入れます。
メスで外陰部までワームをカットし、卵を解放します。次に、目的の段階にある胚を特定し、マイクロキャピラリーピペットで収集します。胚を、寒天の境界ではなく、スライドの端のすぐ隣にある準備したスライドから張り出した寒天に移します。
次に、液体を除去しながら、胚をマイクロキャピラリーピペットで位置合わせします。吸引により、胚はポリオールリジンに付着します。良好な記録を得るためには、胚をしっかりと配置することが非常に重要であり、これには適切なアプチュアを持つ毛細血管が必要です。
小さすぎると、胚を放出するのが難しくなります。大きすぎると、漏れた流れをしっかりと制御し、胚を整列させることが難しくなりますので、スライドをペトリ皿にM nine培地で覆い、胚がまだ寒天に付着していることを確認します。次に、準備したスライドに胚を入れて、獣医に収まるサンプルホルダーに固定します。
ホルダーは、獣医にフィットするように設計された自社製のからくりです。次に、獣医をPizo電気ステージに固定し、明視野照明の下で胚を見つけます。次に、音響光学チューニング可能なソフトウェアパッケージを起動します。
カメラとステージをフィルタリングします。このソフトは社内で書いたものですが、micromanagerのフリーウェアでも使えます。まず、レーザーラインを選択します。
次に、ライトシートが最も明るくなるまで、x軸に沿ってステージを調整します。次に、信号対雑音比が最高になるまで、他の2つの次元(YとZ)を調整します。これは、各胚に対して繰り返す必要があるかもしれません。
この鍵は、信号と比率を最適化して、フリーステージの翻訳を行い、胚のousシミュレーションと最高のコントラストを得るだけの関係で、排除の目的とのサポートを得るための良好な記録を得るためのものです。次に、タイムラプス画像を取得し、胚の蛍光レベルと分析された生物学的プロセスの速度に応じて、レーザー出力の露出、時間ゲイン、およびイメージング間隔を設定します。ザックのために。
イメージングは、ヒストンGFPコンストラクトを発現するc elganでスライスとその開始位置および終了位置との間の距離を設定します。2時間のタイムラプスイメージングは、37秒ごとに20スライススタックを撮影して行われました。細胞分裂は、GFPに融合したチューブリンを発現する株ではっきりと見え、彼の結石をmチェリーに融合させた記録は、105秒ごとに16分間行われました。
3D レンダリングは 3 つの時点で表示されます。有糸分裂紡錘体と凝縮した染色体ははっきりと見え、細胞分裂を通じて簡単に追跡できます。GFPに融合した第3の株であるAPOリポタンパク質vit 2を、細胞膜のmCherry標識で画像化した。
13 分間で、27 秒ごとに 10 個のスライススタックが取得されました。動きの速いリポタンパク質粒子は追跡が容易でした。ここでは、より複雑な方法で形成されたライトシートを使用して製造します。
ライトシートは、空間分解能をさらに向上させるために実装される場合があります。
概要
このプロトコルは、線虫胚のin vivoイメージング用の光シート顕微鏡のセットアップとその実装について説明しています。この方法は、共焦点顕微鏡に比べてより速いイメージングと低い光毒性を実現します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物物理学
- 顕微鏡学
背景
- 光シート顕微鏡法は、生物学的サンプルのイメージングに独特のアプローチを提供します。
- この技術は特に生きた胚の観察に有用です。
- 光損傷を最小限に抑えながら、迅速なイメージングを可能にします。
- 応用範囲は線虫を超えてさまざまなモデル生物に及びます。
研究の目的
- 蛍光光シート顕微鏡法を用いて線虫胚の発達を視覚化すること。
- 発達過程における蛍光タグ付けされたタンパク質のダイナミクスを分析すること。
- 従来の方法に対する光シート顕微鏡法の利点を示すこと。
使用した方法
- 光学機械要素を用いた光シート顕微鏡のセットアップ。
- アガーパッド付きの準備されたスライドに胚を載せる。
- イメージングのための光シートの位置合わせの最適化。
- 発達プロセスを捉えるための胚のタイムラプスイメージング。
主な結果
- 線虫胚における細胞分裂とタンパク質ダイナミクスの成功したイメージング。
- 有糸分裂紡錘体と染色体の3Dレンダリングが得られました。
- 高速移動するタンパク質を追跡する能力を実証しました。
- この生物の発達プロセスに関する洞察を提供しました。
結論
- 光シート顕微鏡法はin vivoイメージングの強力なツールです。
- この方法は胚の発生の理解を深めます。
- 他のモデル生物にも適応可能です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Light sheet microscopy enables high-resolution, low-phototoxicity imaging of whole-organism development, supporting target validation in early discovery by providing quantitative, dynamic phenotypic data. This approach reduces biological uncertainty in preclinical models by allowing longitudinal tracking of cellular processes and protein dynamics in live systems. The method enhances predictive confidence in lead identification by delivering reproducible, scalable imaging outputs compatible with high-content screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through subcellular-resolution visualization of protein dynamics and cell divisions in developing embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible, quantitative readouts of developmental phenotypes under low-phototoxic conditions.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating longitudinal, multi-parameter datasets that correlate molecular perturbations with developmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, 3D time-lapse imaging with subcellular resolution, enabling reliable compound effect assessment in whole-organism contexts.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through precise light sheet alignment and stabilization, minimizing variability in longitudinal imaging sessions.
- Scalability: Compatible with multi-well observation chambers and automated stage control, supporting medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling consistent phenotypic assessment across model systems using standardized imaging protocols.
- Mechanistic De-risking: Allows direct observation of target engagement effects on developmental processes, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative thresholds for go/no-go decisions based on developmental toxicity and phenotypic normalization metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead optimization, offering a non-destructive, quantitative imaging modality for phenotypic screening and mechanistic studies in whole-organism models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time tracking of fluorescently labeled proteins and cellular structures during embryogenesis.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, light sheet characterization, and embryo mounting protocols that ensure imaging consistency.
- Analytics: Generates quantitative 3D and time-lapse readouts (e.g., mitotic spindle dynamics, protein trafficking) that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant phenotypic readouts in C. elegans, a validated model for conserved developmental pathways.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, left-assembled system on an optical table, enabling repeated use across projects with minimal recalibration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, longitudinal observation of protein dynamics and cellular behavior.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized opto-mechanical alignment, slide preparation, and embryo mounting procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of developmental toxicity, reducing late-stage attrition due to unidentified biological risks.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative, imaging-based phenotypic scores that inform advancement decisions across target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, fluorescence microscopy, and sample preparation for live imaging.
- Needs stable optical table, laser sources, objectives, translation stages, and EM-CCD or sCMOS camera for detection.
- Demands cross-team standardization of slide preparation, embryo staging, and imaging parameters to ensure reproducibility across users and sites.
- Adaptation considerations include embryo size, optical clearing, and mounting medium compatibility when extending to other model systems (e.g., zebrafish, Drosophila).
- Practical limitations include embryo immobilization efficiency and light sheet uniformity over large fields of view, which may require optimization for longer imaging sessions.
