のための簡単​​なシート光顕微鏡を設定する

この手順の全体的な目的は、蛍光ライトシート顕微鏡を用いて C Allergan の成長をイメージングすることです。まず、正立顕微鏡と、ライトシートを生成するための少数の光学機械部品で構成されるライトシート顕微鏡をセットアップします。手順の2番目のステップは、胚をマウントすることです。

最後のステップは、ライトシートを胚に合わせて調整し、その発育を記録することです。3Dおよびタイムラプスビデオの解析により、C. elegansの発育過程における蛍光標識タンパク質のダイナミクスを明らかにすることができます。共焦点顕微鏡などの他の既存の手法に対するライトシート顕微鏡の主な利点は、より低い光毒性で、より高速なイメージングが可能であることです。

第三に、この手法はアザラシの発生に関する知見を提供できます。また、マウスやゼブラフィッシュなどの他の系にも適用可能です。本手順を実演することで、詳細を明確に示します。

私の研究室のエンジニアであるShales氏と、van研究室のエンジニアであるPauline Linac氏です。このセクションではセットアップの組み立てについて説明しますが、これはすべての実験を通して組み立てたままにしておくことができます。レーザー、フィルター、望遠鏡、およびペリスコープをすべて光学定盤上に配置した後、円柱レンズを固定してライトシートを生成します。

別のレンズでフォーカスを調整します。照明用対物レンズの焦点は、検出用対物レンズの物体焦点と一致している必要があります。次に、ビームを壁またはスクリーンに投影し、投影された輪郭が鮮明になるまで、照明用対物レンズをビーム軸に沿って移動させます。

顕微鏡のセットアップに、クアッドラインエミッションフィルターとE-M-C-C-Dカメラを組み込みます。2番目の手動翻訳ステージを1番目のステージに対して垂直に固定します。このアセンブリを既存の顕微鏡ステージにネジで固定します。

設定済みの円柱レンズ照明対物レンズを取り外した後、アセンブリを顕微鏡上に配置し、照明セットをステージに戻します。照明光路と検出光路が垂直に交差する位置にqveホルダーを取り付けます。ここで、ライトシートを確認します。

ガラス製キュベットにフルオレセイン溶液を満たし、ステージ上のホルダーに設置します。ライトシートが見えることを確認してください。ライトシートは水平であり、検出対物レンズに対して中心に位置している必要があります。

次に、シリンダーレンズを取り外します。照明対物レンズを3次元的に移動させてライトシートを最適化し、画像を取得してライトシートの厚さを測定します。この厚さは対物レンズの開口数に依存します。

次に、必ずシリンダーレンズを交換してください。まず、厚さ1 mm、10 mm × 20 mmのガラス片を切り出します。ダイヤモンドカッターを使用してください。

次に、スライドの一方に20 µLのポリLリシンを加え、乾燥後、2枚目のスライドと接するように並べます。固定した状態で、5%アガーを1滴加え、3枚目のスライドを上に置いてその重みで平らにします。アガーが乾燥した後、3枚目のスライドを取り除き、ポリLリシンを塗布していない方のスライド上で、残りの2枚のスライドの端から3 mmの位置でアガーパッドをカットします。

次に、固定したスライドを取り出し、アガロースをはみ出させた状態にします。アガロースに 20 µL の poly L lysine を塗布し、乾燥させます。その後、解剖顕微鏡下で、M9 medium を満たした時計皿に GR 虫を入れます。

メスでvulvaの高さで虫体を切断し、卵を放出させます。次に、目的の段階にある胚を同定し、マイクロキャピラリーピペットで回収します。胚を、準備したスライドの端のすぐ隣にあるアガールのオーバーハング部分に転移させます。この際、アガールの境界線上にならないようにしてください。

次に、液体を除去しながら、マイクロキャピラリーピペットを用いて胚を整列させます。吸引することで、胚はポリリシンに付着します。良好な記録を得るためには胚を適切に配置することが非常に重要であり、そのためには適切な口径のキャピラリーが必要です。

サイズが小さすぎると、胚を放出させるのが困難になります。逆に大きすぎると、漏出フローの厳密な制御や胚の整列が困難になります。シャーレ内でスライドをM nine mediumで覆い、拡大鏡を用いて胚が依然としてアガーに付着していることを確認してください。次に、胚を準備したスライドを、veteに適合するサンプルホルダーに固定します。

ホルダーは、veteに適合するように設計された自作の器具です。次に、veteをPizo電動ステージに固定し、明視野照明下で胚を特定します。これで、acoustic optic tuneableを制御するソフトウェアパッケージを起動してください。

カメラとステージのフィルタリングを行います。ここで使用しているソフトウェアは自社製ですが、フリーウェアのMicroManagerを使用することも可能です。まず、レーザーラインを選択します。

次に、ライトシートが最も明るくなるまで、x軸に沿ってステージを調整します。その後、S/N比が最適になるまで、残りの2つの次元（YおよびZ）を調整します。この操作は、個々の胚ごとに行う必要がある場合があります。

良好な記録を得るためには、S/N比を最適化することが重要であり、ステージの自由移動をサポートし、目的の排除と調整を行うことで、胚の正確なシミュレーションと最高のコントラストを得ることができます。次に、タイムラプス画像を取得します。胚の蛍光レベルと解析する生物学的プロセスの速度に応じて、レーザー出力、露光時間、ゲイン、および撮影間隔を設定してください。Zackによる。

ヒストンGFP構築物を発現するc elganにおいて、スライス間の距離および開始・終了位置を撮影設定しました。2時間のタイムラプスイメージングを行い、37秒ごとに20枚のスライススタックを撮影しました。チューブリンGFP融合タンパク質およびヒストンmCherry融合タンパク質を発現する株では、細胞分裂が明確に観察されました。録画は105秒ごとに16分間行われました。

3つの時点における3Dレンダリングを示します。紡錘体と凝縮した染色体が明確に観察でき、細胞分裂を通じて容易に追跡できます。3番目の株では、GFPと融合させたAPOリポタンパク質vit2を、mCherryによる細胞膜の標識とともにイメージングしました。

13分間にわたり、27秒ごとに10スライスのスタック画像を取得しました。高速で移動するリポタンパク質粒子は容易に追跡できました。ここでは、より複雑な手法で形成されたライトシートを用いて作製します。

空間分解能をさらに向上させるために、ライトシートを導入することが考えられます。