で産生された組換えジスルフィド豊富な毒タンパク質に印加される高スループット定量的発現スクリーニングおよび精製 E.大腸菌の

次の手順の全体的な目標は、ハイスループット発現スクリーニングプロトコルを使用して、自動液体ハンドリングロボットを使用して大腸菌の可溶性タンパク質のレベルを定量することです。これは、最初に接種することによって達成されます96。ターゲット融合タンパク質をコードするプラスミドで形質転換した細胞を用いたウェルプレカルチャー 翌日、自動誘導培地を充填した24ウェルプレートに一晩プレカルチャーを接種して発現を創出します。

収穫後の培養物および発現培養物からの可溶性タンパク質の凍結は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製されます。最終的には、各インタクトターゲット融合の溶解度を測定して、タンパク質産生と成功したターゲットの生成に最適な発現条件を決定できます。効率が向上した従来の方法のこの技術の利点から、バッチへの制限されたバッチ放射線と、この方法の視覚的なデモンストレーションとデータ処理と追跡のシンプルさが重要です。

自動化された手順は、テキストが手順の迅速さや単純さを伝えていないため、テキスト形式では理解しにくく、理解しにくいように見える場合があります。バクテリアの形質転換後、ロボットグリッパーを使用して最初の24ウェルLB寒天プレートの蓋を脇に置くことから始めます。次に、8チャンネルのリキッドハンドリングアームを使用して混合し、96ウェルのトランスフォームプレートから50マイクロリットルのトランスフォームミックスを吸引します。

リキッドハンドリングアームの最初の4つのチャネル内の形質転換ミックスをLB寒天プレートの最初のカラムに分注し、最後の4つのチャネル内の形質転換をLB寒天プレートの2番目のカラムに分注し、分注後にすべてのチップを完全に洗浄し、96ウェルプレートからLB寒天プレートの次の4列のすべてのウェルに形質転換ミックスを移し続けます。そのプレートが完成しました。最初のプレートへの移動が完了したら、蓋を元に戻し、次のプレートの移動を開始します。すべてのトランスフォームを播種したら、すべてのプレートを1200 RPMで1分間振とうして、トランスフォーメーションミックスの均一な分布を生成します。

次に、混合後、96マルチチャンネルアームを使用して、残りの形質転換混合物の60マイクロリットルを96ウェルプレートから吸引し、LBブロスを含むディープウェル96プレートに混合物を分注します。深井戸96のプレカルチャーを通気性のある接着フィルムで密封して培養空気の曝気を可能にし、プレートを摂氏37度の振とうインキュベーターに一晩最高速度で置きます。培養前をインキュベーターに入れたら、LB寒天プレートをフードに入れ、蓋を外した状態で約10分間駆動します。

次に、37°Cのプレートインキュベーターでプレートを反転させます。翌日、リキッドハンドリングアームを使用して、一晩のプレカルチャーの100マイクロリットルを深いウェル96プレートに吸引し、発現カルチャーを1つの40分の1希釈で接種し、以前と同じスキームを使用して、プレカルチャーの各カラム間の洗浄ステーションでリキッドハンドリングアームを完全に洗浄します。接種が終了したら、発現培養物を摂氏37度の振とうインキュベーターに入れ、通気性のある接着剤で4時間密封します。

次に、温度を摂氏17度に下げて一晩インキュベーションします。翌朝、深井戸24プレートを3000Gで10分間遠心分離し、抗菌剤を含む廃棄物容器に上清を捨て、プレートを逆さまに吸収紙に叩いて残留培地を取り除き、培養物が正しく成長したことを確認します。深井戸にペレットが存在するかどうかを確認します。

次に、125マイクロリットルの溶解緩衝液を吸引し、緩衝液を深井戸24プレートの各ウェルに2回分注し、各ウェルに4つの先端を注入する。ペレットを再懸濁するための溶解緩衝液の最終容量1ミリリットルに達するには、プレートを1200RPMで5分間振とうします。ロボット上で、セル懸濁液を深井戸96プレートの適切なウェルに戻し、マイナス80°Cで密封されたプレートを最低1時間保管します。

このデモンストレーションでは、50マイクロリットルのニッケルビーズを使用したプロトコルを使用して、ターゲット融合タンパク質を精製します。まず、ディープウェル96プレートを水浴で約15分間解凍します。その後、細胞溶解物を振盪インキュベーターに最大速度でさらに10分間懸濁すると、培養物は粘性になるはずです。

次に、手動の8チャンネルピペットを使用して、DNAと硫酸マグネシウムの混合物をディープウェル96プレートの各ウェルに分注し、それぞれ10マイクログラム/ミリリットルと20ミリモルの最終濃度にします。密封されたプレートをさらに15分間振ると、培養物は非粘性になるはずです。精製中のフィルタープレートの目詰まりを防ぐためには、ライセートが粘性でなくなったことを注意深く目視で確認することが重要です。

リキッドハンドリングロボットでは、200マイクロリットルのワイドボアチップを使用して樹脂スラリーを完全に混合してから、200マイクロリットルのスラリーをライセートを含むディープウェル96プレートに移します。1400 RPMおよび室温で10分間深い井戸96の版を結合を可能にするために振盪し、次に広い穴の先端を使用して混合し、次に200マイクロリットルのアリコートの樹脂のlysateのスラリーの完全な1200マイクロリットルをフィルター版に移す。次に、真空を約30秒間オンにして、プレートを介してライセートをろ過し、深いウェルに流れを収集します。

96は、流れを含む深井戸96の下方をフィルタープレートの下から取り出し、実験終了までラックに収納する。次に、2回目の洗浄後に毎回800マイクロリットルの結合バッファーで樹脂を2回洗浄し、ロボットグリッパーを使用してフィルタープレートの下に新鮮で深い96プレートを配置し、50ミリモルIミダズウォッシュを収集します。150マイクロリットルの洗浄バッファーをフィルタープレートに加え、バッファーがディープウェル96を含むものを通過するまで再度真空を適用する。

洗浄液はフィルタープレートの下から取り出され、実験が終了するまでラックに保管されます。次に、結合バッファーで実証されたように、800マイクロリットルの洗浄バッファーでさらに2回洗浄した後、ロボットグリッパーを使用してマイクロプレートを作業テーブルに移し、SPEブロックとフィルタープレートをマイクロプレートの上に戻してエルーシアンを回収しました。次に、フィルタープレートの樹脂に190マイクロリットルのElucianバッファーを追加します。

3分後、バキュームを1分間適用して、すべてのバッファが通過できるようにします。Ellucianボリュームが正しいことをすばやく視覚的に確認します。最後に、Ellucian洗浄のブロックサンプルをプレートに流して、可溶性発現のレベルを定量化します。

最初にエルシアンプレートを分析し、必要な場合にのみ、関連する洗浄とフラクションのフローを確認します。これらのデータは、キャリパーラボチップシステムからの電気泳動結果を示しています。無傷の切断された融合タンパク質は上部のバンドで表され、切断されたタンパク質フラグメントは下部のバンドで表されます。

各標的タンパク質の融合収率は、1リットルあたり0.1〜2、2〜10、および10〜25マイクログラム/リットルの培養レベル内にあると決定されましたが、場合によっては検出されませんでした。各融合タンパク質フラグメント内に存在するディススルフィド結合の数によってタンパク質発現の成功を評価すると、試験したすべてのジスルフィド結合の数について妥当な成功が示され、最も低い成功レベルは66%でした6つのジスルフィド結合を含むターゲット。等電点と残基数に基づく発現成功の分布の解析では、発現に成功したターゲットと検出されなかったターゲットの両方がプロット全体に散在しているため、この手法に特にバイアスはないことが示されました。

融合物が検出されて切断されると、精製されたターゲットは、エレクトロスプレーイオン化、質量分析による品質管理を受けます。ここで示されている代表的なターゲットは、4つのジスルフィド結合を持つ5.7キロダルトンのジスルフィドリッチ毒タンパク質です。このスペクトルは、DTTで還元する前のタンパク質の結果と、さらなる介入なしでの切断および脱塩後のタンパク質の結果を示しています。

このスペクトルは、DTTで還元した後、余分なDTTを除去するための脱塩後のタンパク質を示しています。矢印は実験質量に対応するイオンを示し、各イオンの名称は緑色で示されています。これらのイオンについて計算された実験用親質量を表に示し、4つの酸化硫化ジアン結合に相当する8ダルトンの質量差に対応しています。

セットアップすると、完全なプロトコールを1週間以内に1,000を超える培養物で実行できます。このビデオを見れば、ハイスループット法を使用して可溶性タンパク質産生に必要な成功条件を特定するために、小規模の大腸菌培養を使用する方法を十分に理解できるはずです。