Name: で産生された組換えジスルフィド豊富な毒タンパク質に印加される高スループット定量的発現スクリーニングおよび精製 E.大腸菌の (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: 学ぶ高スループット発現スクリーニング法により、大腸菌で組換えジスルフィド豊富な毒タンパク質の可溶性発現を定量化し、自動液体ハンドリングロボットを用いて最適な精製条件を効率的に探索する技術です。

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この作品はVENOMICSプロジェクト、第七フレームワーク·プログラム（FP7 HEALTH 2011年から2015年）を通じて278346°欧州プロジェクト無償Nでサポートされていました。 VENOMICSプロジェクトは、ヨーロッパのいくつかの研究機関や企業間のコラボレーションです。 AFMB、エクス·マルセイユ大学（フランス）、CEAサクレ（フランス）、NZYTech（ポルトガル）、SistemasGenomicos（スペイン）、大学·ド·リエージュ（ベルギー）、VenomeTech（フランス）、Vitamib（フランス）、ニュージーランドファーマ（デンマーク） この作品は、統合された構造生物学（FRISBI）ANR-10-INSB-05から01のためのフランスのインフラストラクチャによってサポートされていました。 著者はまた、ビデオの撮影のための準備を支援するために氏ジェレミーTurchettoに感謝したいと思います。

<ol><li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+and+solubility+screening+in+Escherichia+coli%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).</li>
<li>Correa, A., Oppezzo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+different+expression+parameters+to+achieve+soluble+recombinant+proteins+in+E.+coli%3A+advantages+of+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening.</a> Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5, 135-146 (2008).</li>
<li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+systematic+N-+and+C-terminal+deletions+to+promote+production+and+structural+studies+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins.</a> Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).</li>
<li>Bird, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+construction+and+small+scale+expression+screening+of+multi-tag+vectors+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 29-37 (2011).</li>
<li>Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fusion+protein+systems+designed+to+give+soluble+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli.</a> Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).</li>
<li>Kapust, R. B., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+maltose-binding+protein+is+uncommonly+effective+at+promoting+the+solubility+of+polypeptides+to+which+it+is+fused%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).</li>
<li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).</li>
<li>Marblestone, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SUMO+fusion+technology+with+traditional+gene+fusion+systems%3A+enhanced+expression+and+solubility+with+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).</li>
<li>Nozach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+identifies+disulfide+isomerase+DsbC+as+a+very+efficient+partner+for+recombinant+expression+of+small+disulfide-rich+proteins+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli.</a> Microb Cell Fact. 12, 37(2013).</li>
<li>Sachdev, D., Chirgwin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusions+to+maltose-binding+protein%3A+control+of+folding+and+solubility+in+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).</li>
<li>Smith, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+fusions+to+glutathione+S-transferase+for+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies.</a> Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).</li>
<li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32(2007).</li>
<li>Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+reducing+pathways+is+not+essential+for+efficient+disulfide+bond+formation+in+the+cytoplasm+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli.</a> Microb Cell Fact. 9, 67(2010).</li>
<li>de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+contributions+in+the+field+of+the+recombinant+expression+of+disulfide+bonded+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria.</a> Microb Cell Fact. 11, 129(2012).</li>
<li>Katzen, F., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+formation+in+periplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).</li>
<li>Klint, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+disulfide-rich+venom+peptides+for+structural+and+functional+analysis+via+expression+in+the+periplasm+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli.</a> PloS One. 8, e63865(2013).</li>
<li>Braud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+expression+system+suitable+for+high-throughput+fluorescence-based+screening+and+production+of+soluble+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins.</a> Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).</li>
<li>Douzi, B. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+system+for+expressing+recombinant+animal+toxins+in+E.+coli.+%28Collection+Rencontres+en+Toxicologie%2C+Publications+de+la+SFET%2C+Chatenay-Malabry%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+and+new+technologies+in+toxinology%22%5BJournal%5D)">A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry).</a> Advances and new technologies in toxinology. , 149-152 (2010).</li>
<li>Groisillier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARINE-EXPRESS%3A+taking+advantage+of+high+throughput+cloning+and+expression+strategies+for+the+post-genomic+analysis+of+marine+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact.%22%5BJournal%5D)">MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms.</a> Microb Cell Fact.. 9, 45(2010).</li>
<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 65-72 Forthcoming.</li>
<li>Xiao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-throughput+protein+sample+production+platform+of+the+Northeast+Structural+Genomics+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium.</a> Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).</li>
<li>Saez, N. J., Vincentelli, R. Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaez%2C+NJ+%22Structural+Genomics%3A+General+Applications+%3A+Methods+in+Molecular+Biology%22">Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology</a>. Chen, Y. W. 1091, Humana Press. 33-53 (2014).</li>
<li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+%28R%29+recombinational+cloning%3A+a+biological+operating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).</li>
<li>Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+expression+and+solubility+screening+of+His-tagged+proteins+in+96-well+format%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format.</a> Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).</li>
<li>Spencer, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+pharmacology+under+flow%3A+automation+via+well-plate+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).</li>
<li>Sala, E., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+optimized+protein+purification+protocols+by+coupling+small-scale+expression+and+mini-size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography.</a> Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).</li>
<li>Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synergistic+approach+to+protein+crystallization%3A+combination+of+a+fixed-arm+carrier+with+surface+entropy+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).</li>
<li>Zanier, K., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZanier%2C+K+%22Structural+basis+for+hijacking+of+cellular+LxxLL+motifs+by+papillomavirus+E6+oncoproteins%22">Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins</a>. 339, Science. New York, N.Y. 694-698 (2013).</li>
<li>Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P1%27+specificity+of+tobacco+etch+virus+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The P1' specificity of tobacco etch virus protease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).</li>
<li>Vincentelli, R., Romier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli%3A+becoming+faster+and+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).</li>
<li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152, 327-339 (2013).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).</li>
<li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li>
<li>van den Ent, F., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RF+cloning%3A+a+restriction-free+method+for+inserting+target+genes+into+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).</li>
<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+automated+refolding+screening+of+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

水溶性、折りたたまれた、機能的なタンパク質の発現のための単一のユニバーサルプロトコルがありません。 、コストと時間の効率的であると、複数のターゲットを扱うほとんどの研究室やタンパク質コア施設は、したがって、目標の大半を、可溶性の活性タンパク質を得るために、変数の最高の「一般的な」組み合わせを見つけるためのスクリーニングのハイスループットタンパク質発現を使用しています。私たちは、ジスルフィド豊富なペプチドおよびタンパク質11の可溶性発現のために一般的に適用可能な融合パートナーであるとのDsbCを同定した。 DsbCの融合およびハイスループット方法を用いて、一週間以内に複数の標的の可溶性発現が11で観察することができ、次いで、導入部で論じたものなどの追加の変数は、さらなる最適化を必要とするターゲットでその後のラウンドでスクリーニングすることができる。本明細書に記載されたプロトコルは、ジスルフィドに富むタンパク質およびペプチドの発現を目的としている。しかし、expに希望するユーザーのためのハイスループット様式でRESS非網目状タンパク質は、対応するプロトコルは、以前に公表されており、他の場所22,24見出すことができる。 高スループットのセットアップは（同時に可溶性発現または複数の標的遺伝子のための（様々な融合タグを含む）の発現構築物の多数のスクリーニングのための異なった多数のタンパク質のスクリーニングなど、多数のアプリケーションに最適ですまたは複数の発現が成功率を向上させるために）単一のターゲットの構築物。プラットフォームはまた、多数のターゲットに新しいプロトコルのベンチマークと検証のために使用することができる。他のアプリケーションは、単一の難しいターゲットの変異体のスクリーニング、 例えば 、全ての相同分子種または同じファミリーのメンバー、または1の実験では、単一の標的の変異体のパネルの生産の成功をテストするためにあります。また、このプロトコルは、共発現ベクター（ウィットと組み合わせて使用​​されているH 1は、プルダウン正しい複合体形成および化学量論33を確認するために、より徹底した生物物理学的分析を行ったタンパク質-タンパク質複合体の予備的な特性評価を可能にするために）タンパク質のみをタグ付けされた。精製されたタンパク質の量は、マイクロアッセイ（官能試験、タンパク質-DNA 34またはタンパク質-タンパク質相互作用アッセイ）のために時々に適している。ハイスループット発現スクリーニング戦略にはいくつかの利点がある：（i）多数のターゲットをテストする能力、または単一の実験で多数の変数と、（ii）限られたバッチ間のばらつき、（三）は深い井戸を使用してより小さな規模で働くのシンプルさと使いやすさ、（iv）の拡張性と再現性、より大きなスケールでは、自動化のための（V）の可能性、および（vi）の追跡のシンプルさとハンドリング（個々のチューブの無いラベル、少なく）を混合中の個々のチューブの取り扱いをよりプレートフォーマットを使用するか、クローンの交換時に導入されたミス。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;プロトコルのセクションで説明されていないが、以下に簡単に説明される実験の準備のため、いくつかの重要な考慮事項があります。より完全な議論についてはこれまでの出版物24を参照してください。最大効率のためには、ターゲットの多数のサブクローン作成を簡素化するために、ハイスループットクローニングに適したシステムを持っていることが有益である。 VENOMICSプロジェクトの初期段階のために、我々は週にクローンの数百のペースで任意のデスティネーションベクターにサブクローニングを可能にする汎用性の高いGateway組換えシステム25を利用する。 Gateway組換えクローニングのためのプロトコルは、Invitrogen社のウェブサイトでご覧になれます。ハイスループットクローニングのため他の選択肢は、37のクローンを作成ライゲーションに依存しないクローニング（LIC）35,36および制限フリー（RF）が含まれています。エントリークローンのコレクションから、鋳型DNAからPCRにより含め、表現のための標的遺伝子を得るために複数の方法があります。またはVENOMICSプロジェクト用に選択された戦略である合成遺伝子、。合成遺伝子は、遺伝子の両端に組換え部位に注文することができ、遺伝子合成は、（まれな大腸菌コドンを排除するために）標的遺伝子配列を容易にコドン最適化を可能にする。これはお勧めしますが、必須ではない。希少コドンの数が多い、ロゼッタ2（高度大腸菌内で発現されていない希少コドン用tRNAを運ぶ）（DE3）pLysSをが含まれているコドン最適化することなくターゲットの場合、BL21（DE3）pLysSをより良く適している。細胞質の通常還元環境でのジスルフィド結合の還元を制限可能な菌株があ ​​りますが、私たちの手で、彼らは、通常の大腸菌と同じくらい成功していない大腸菌は 11株。 分析スケールアフィニティー精製は、可溶性融合タンパク質を回収し、収率を定量化するために、試験発現培養物から行われる。定量的データは日に取得することができる培養物を100mg / L - 0.1の範囲内で発現された融合タンパク質の可溶性電子収量。ターゲットが可溶性でない場合、別の融合パートナーが追求される前に、別の発現および誘導温度、株または媒体を試験することができる。ジスルフィドが豊富なタンパク質の可溶性発現のために、我々は以前に細胞質発現のための11のDsbC&gt;のDsbA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX&gt; HIS-タグとして融合パートナーの効果をランク付けした。ペリプラズム発現は、ジスルフィドが豊富なターゲットの成功折りたたみを助けることができるもう一つの可能​​性である。ペリプラズムは、細胞質よりも低い還元環境で、ジスルフィド結合を支援するための有用な酸化還元シャペロンが含まれています。 DsbCは、DsbAの、およびMBPタンパク質は通常、彼らの周辺質のシグナル配列によってペリプラズムに局在している。これは折り畳みを助けるために、細胞膜周辺腔にジスルフィド豊富な目標を指示するために、これらのタグを活用する機会を提供する。難治性のターゲットでは、次のステップはPになります（これは、このプロトコルの範囲の外にあり、ここでは3 9で議論されることはありません）封入体からの不溶性Hisタグのターゲットをurify、可溶化し、リフォールディング。これは、1つまたは2つのジスルフィド結合を有する標的に対して非常に単純であるが、ジスルフィド結合の数が増加するにつれてますます難しくなることができる。あるいは、そして特に4個以上のジスルフィド結合を有するタンパク質およびペプチドのためには、例えば、酵母、昆虫または哺乳動物発現などのより複雑な生産システムを試すことが有益であり得る。 小型化と自動化の進歩により、HTPの電気生理学ラボオンチップ技術28は、間違いなく機能解析のための将来の道になります。我々は（おそらく構造的研究を除いて）ほとんどの目的のために、これは大規模な文化のための必要性を否定することを想定。小規模培養物は、発現条件をスクリーニングするために有用であるだけでなく、接尾を提供することができるようになるだけでなくこれらの小型化された機能アッセイのためのサンプルのficient量。機能的特徴付けのために十分な量で並列に複数のターゲットを生産する能力を培養し、そのプラットフォームのこれらの種類を使用することのコストを下げるため、組換えタンパク質の発現および特徴付けは、コストと時間が有効になります。 プロトコルは、本明細書欧州FP7 VENOMICSプロジェクトの初期段階において、ジスルフィドリッチなペプチドおよびタンパク質の発現に適用されている。毒は頻繁に興味深い薬理可能性を持っている生理活性ペプチドの優れた供給源である。しかし、それらの製造、それらの複雑なジスルフィド結合パターンと小型サイズのため困難である。本明細書に記載のようなハイスループットプラットフォームを用いて、VENOMICSプロジェクトは、自然界で観察される多様性を再現する10,000の新規毒ペプチドのライブラリーを生成することを目的とする。このライブラリは、ジスルフィド-Rの特徴付けのために利用されます新薬の開発を目的とした潜在的な薬理または治療への応用とICHペプチド。プラットフォームは、現在VENOMICSプロジェクトで使用するための新しいプロトコルをベンチマーキングし、検証するために使用されている。

ゲノミクスおよび新規タンパク質の発見の加速された速度の進歩によって動機付けられ、ハイスループット·パイプラインは、最適なタンパク質産生戦略のスクリーニングおよび同定のための従来のアプローチを並列化するために開発されている。潜在的な最適化すべき変数に変化する式は1,2菌株 、これらに限定されないが、温度3,4、メディア2,3、ターゲットは5変異体、融合パートナー6-13、14,15シャペロンとの共発現は、細胞質あるいはペリプラズム発現16〜18、及び精製バッファー成分3。バッチ間のばらつきを抑制しつつ、高スループットのアプローチを実装することにより、多数の変数または多くのターゲットは、高い効率と並行して試験することができる。我々の経験では、戦略は（温度、メディア、曝気など）および精製条件（同RESI同じカルチャを使用して、スケールアップの際に良好な再現性を提供しますnは、緩衝液など）を含む。いくつかのハイスループットプラットフォーム、すなわちそのような融合パートナーは、発現株または温度19-23変化するパラメータ等を介して、可溶性タンパク質発現のための条件を識別するために過去10年間に使用されてきた。 我々は最近、可溶性ジスルフィドリッチタンパク質11の発現のための私達のハイスループットスクリーニング法を使用していました。選択されたタンパク質は、有毒な供給源からだけであったが、植物、ブタ、ウシ及びヒトを含む広範囲の種からのジスルフィドリッチな酵素阻害剤を含んでいた。実験は、12の異なる融合パートナーと28ジスルフィド網状タンパク質の溶解性と折り畳みに3の異なる発現株の効果を比較した。我々は（収率および得られた可溶性タンパク質の数の両方で）株BL21（DE3）での生産のための融合パートナーとしてのDsbCを使用してpLysSを大幅outproducedひずみとの融合の他の組み合わせは11をテストしたことを明らかにした。ザ·この実験の結果は、ジスルフィドリッチな標的の発現のためのより適したものに（広範囲のタンパク質の発現をスクリーニングするために使用されている）当初の一般的なハイスループット·パイプライン22,24を適合させるための基礎を形成した。動物の毒からジスルフィドリッチタンパク質は、特に重要である。毒は、薬理学的および治療的潜在値と、生物活性ペプチドおよびタンパク質の複雑な混合物である。しかし、ジスルフィド結合含有タンパク質の発現は、容易ではありません。これらのタンパク質は、一般的に一から七のジスルフィド結合の間で含まれており、アクティブにするために、正しいジスルフィド結合パターンを用いて酸化されなければならない。現在、プラットフォームは、FP7、欧州VENOMICSプロジェクト（www.venomics.eu）の一部として、ジスルフィドリッチな動物毒多数のタンパク質の発現をスクリーニングおよび標的の数千のハイスループット発現のための新規なプロトコルをベンチマーキングするために使用されている。ここでは、自動化された方法ジスルフィドリッチに動物毒タンパク質を印加（ 図1参照）の高スループットの小規模発現スクリーニングおよび精製の ​​ために設けられている。ジスルフィドリッチペプチドやタンパク質のための戦略は、精製および酸化還元活性融合パートナー、DsbCは、標的タンパク質に切断可能なHIS-DsbCの融合を作成します（ 図2を参照）のための彼のタグを利用しています。 プロトコルの焦点は、本明細書ロボットとHTP電気泳動を処理液を用いて自動化であるが、これらの方法はまた、高スループットの手動アプローチに適している、基本的なセットアップでさえ研究室は高価な機器のための任意の必要条件なしにプロトコルを利用できることを意味。精製および分析（ジスルフィドリッチタンパク質に固有のものではありませ）への変換のためのマニュアルのプロトコルは、他の場所で24公開されており、ここでは繰り返さない。再結合によって生成される発現クローンからの手動手順のスループット（、可溶性タンパク質レベルの分析にナショナルクローニング25）、96（SDS-PAGE検出を使用して）または384（4×96であるドットブロット及びSDS-PAGE 26を使用して）週培養（） 図1を参照。 （例えば、キャリパーGXIIラボチップシステム22と同様に、液体処理ロボットおよびドットブロット26又はHTP電気泳動を使用した半自動化された方法で行われる場合、これを増加させることができる 結果の分析のための）最大1152まで（12×96）一週間にわたって並行して培養、本明細書に記載される。正規振盪インキュベーターに十分な通気のための短い軌道高速振盪インキュベーターの使用を必要とディープウェル96（DW96）形式、（振盪で増殖させた培養物とは対照的に使用できるように、培養は24（DW24）形式深いウェル中で行われる800rpmで）。自動誘導培地27の使用はまた、手動誘導ステップを排除し、式を簡素化します。研究所ではすでに、事前定義された式とプリを使用した場合でもfication条件が、これらは単に効率を向上させるために、このHTPシステムに直接転送することができる。ジスルフィドリッチタンパク質のためのハイスループットスクリーニングパイプラインの詳細な概略図を図3に設けられている。パイプライン中のパラメータはボランティアタンパク質生産のための最も有用な条件を選択させ広範なスクリーニング実験11、22、に基づいて選択した。 特徴付けは、サンプルの数十マイクログラムが十分な、または敏感な機能アッセイ及び結合アッセイ（例えば、低容積HTPパッチクランプシステム28）のためのパイロットスタディにおける小規模表現から直接精製タグ付きタンパク質を行うことができる。同じであっても、切断後に、タグなしのターゲット上で実行される、タグおよびプロテアーゼを設けすることができる（逆相HPLCによって、など）を除去する。品質管理はまた、（予想されたサイズおよび酸化番目を確認するために質量分析法によって行うことができるATE）や、純度や異質性を確認するクロマトグラフィー法（）29。時々 、切断が不要な、あるいは望ましくない（特に難溶性タンパク質のため30,31）ので、このプロトコルの切断にはオプションのタグ。それにもかかわらず、全ての構築物内で直接（ 図2および考察を参照されたい）切断後、天然のタンパク質を産生する標的遺伝子の前にTEVプロテアーゼ切断部位（ENLYFQ / [G] 32）がある。融合タグの切断が所望される場合、切断は、効率性を分析する必要に応じて条件を最適化し、後続のスケールアップ実験の収率の信頼できる推​​定値を得るために小さなスケールで（溶出画分または「カラム上 &#39;）試験することができる。 実験の目的や期待に応じて、アフィニティ精製の間に使用されるビーズの量は2つのオプションがあります。パイロットアッセイまたはMSのために精製するために（可能な限り多くのタンパク質を捕捉できるようにする、又はextrapolに）スケールアップ利回りのために食べた樹脂を200μlの最終容量は、システムが飽和する前に、1から100 mg / Lの文化の範囲内の可溶性タンパク質の検出を可能とする、使用されるべきである）8.1節の（プロトコル（Aを参照） 。実験の目的は、可溶性タンパク質の低量の検出である場合は、樹脂の50μlの最終体積は、（B（プロトコルを参照して0.1〜25 mg / Lの培養物の範囲内の可溶性タンパク質の検出を可能にする、適切である）セクション8.2）である。 必要に応じて生産は可溶性発現のために識別条件を用いてさらなる構造的および機能的研究のために精製された標的のミリグラム量を得るために、スケールアップすることができる。 AFMBで使用スケールアッププロトコルの詳細は他の場所で議論されている22,24。 実験装置、プロトコル内の重要なステップに関連するさらなる詳細は、変更及びトラブルシューティングおよび技術の限界は、ディスクで提供されussion。実験開始前の議論をお読みください。 我々は、各ステップで90％の成功率を期待するプロトコルの全体にわたって（例えば、培養物の少なくとも90％が、任意の所与の段階で成長しなければならない）。実験におけるいずれかのステップの成功率が90％を下回るとサンプルが廃棄され、実験が構築物の完全な回収のために繰り返される。これは試験したタンパク質に高度に依存するであろうしかし、この成功率は、可溶性タンパク質として発現構築物の番号又は100％の効率で切断する構築物の割合には適用できない。 ロボットワークテーブルのセットアップのための具体的な詳細は、各プロトコルのために提供される別のワークテーブルのセットアップに必要とされるが、それらは適合させることができる（また、 図4を参照）。ロボットハードウェア（テカン）を96マルチチャンネルアーム（MCA96）、ロボットマニピュレータ（ローマ）と8チャンネル液体ハンドリングヘッド（で構成されていますLIHA）。 MCA96が利用できない場合MCA96を利用するすべてのステップもLIHAがステップ間に洗浄する必要があるので、彼らは時間がかかります、LIHAを使用して行うことができる。ロボットは、技術的に無菌環境ではありませんが、抗生物質を含めることは、一般的には、汚染や無菌性に問題がないことを保証します。

<table><tbody><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 リキッドハンドリングロボット</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td>プロトコルは、プレート用の真空マニホールドを備えた任意のリキッドハンドリングロボットに適合させることができます. http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8</td></tr><tr><td>96ウェルPCR(PCR96)プレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>652270</td><td></td></tr> <tr><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/ LB培地</td><td></td><td></td><td>無菌性のためにオートクレーブ滅菌済み。</td></tr><tr><td>抗生物質のストック</td><td></td><td></td><td>カナマイシン (50 mg/ml)、アンピシリン (100 mg/ml)、クロラムフェニコール (エタノール中 34 mg/ml)、ストック &マイナス;20°C. 1:1,000の希釈を使用してください。</td></tr><tr><td>ディープウェル96(DW96)プレート、容量2.42ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780270</td><td>無菌用オートクレーブ滅菌済み.<br/</td></tr><tr><td>> http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/ Expression ベクター</td><td></td><td></td><td>ターゲットコンストラクトの発現用。&minusで保存します。20°C。</td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysSコンピテントセル</td><td></td><td></td><td>またはユーザーの選択の代替大腸菌発現株。&minusで保存します。80°C。</td></tr><tr><td>ブレスシール通気性粘着フィルム</td><td>Greiner Bio-One</td><td>676050</td><td></td></tr><tr><td>PCRマシン、96ウェルプレートブロック</td><td></td><td></td>付き <td>SDS-PAGE/Caliperサンプルの変形、熱ショック、沸騰用。</td></tr><tr><td>24ウェル無菌組織培養プレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662165</td><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td></tr> <tr><td>LB-寒天</td><td></td><td></td><td>無菌のためにオートクレーブ滅菌済み。</td></tr><tr><td>200 &mu;l 滅菌使い捨てチップ</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 038 617</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Multitron振とうインキュベーター、3 mmスローInfors</td><td></td><td>AJ103</td><td>必須ではありませんが、通常の振とうインキュベーターも使用できます。 http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td></tr> <tr><td>Plateインキュベータ</td><td></td><td></td><td></td>ー</tr><tr><td>マイクロタイタープレート</td><td></td><td></td><td>グリセロールストックおよび精製プロトコルBを使用した溶出用。</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td></td><td></td><td>グリセロールストックの調製用。</td></tr><tr><td>200 &mu;l使い捨てのヒント</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 038 616</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>粘着テープパッド&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td></tr><tr><td>Bactinyl</td><td>Orapiグループ</td><td></td><td>または同等の微生物消毒剤。</td></tr><tr><td>ZYP-5052 ミディアム</td><td></td><td></td><td>コンポーネントのレシピについては、表 1を参照してください。</td></tr><tr><td>ディープウェル 24 (DW24) プレート、容量 10 ml</td><td>Whatman</td><td>7701-5102</td><td>無菌性のためのオートクレーブ滅菌. http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td></tr><tr><td>平底、透明なマイクロタイタープレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>吸光度測定値用.<br/</td></tr><tr><td>> http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/ Plate reading spectrophotometer</td><td></td><td></td><td>随意。培養物のOD600の測定に。</td></tr><tr><td>深井戸プレート用ローター付き遠心分離機&nbsp;</td><td></td><td></td><td>3,800 x gに適しています。</td></tr><tr><td>リゾチーム50</td><td></td><td></td><td>mg / mlを水に溶かします。.&minusで保存します。20°C。</td></tr><tr><td>イミダゾール ACSグレード</td><td>メルク</td><td>IX0005-1</td><td>高品質のイミダゾールは、タンパク質収量を計算するためのA280の読み取りを妨げないように使用する必要があります。</td></tr><tr><td>溶解バッファー</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris、300 mM NaCl、0.25 mg/mL リゾチーム(またはお好みのバッファー)を含む 10 mM イミダゾール pH 8。毎回在庫からリゾチームを追加し、長期間保存しないでください。</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレートソニケーター(超音波プロセッサXL、深井戸プレート対応)</td><td>株式会社ミソニックス</td><td></td><td>必須ではありません。通常、リゾチームだけでほぼ完全な溶解には十分です。</td></tr><tr><td>DNase&nbsp;</td><td></td><td></td><td>水に2 mg / mlストック、フィルター滅菌。アリコートを&minusで保存します。20°C。</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム(MgSO4)</td><td></td><td></td><td>2 M水ストック、オートクレーブ滅菌済み。</td></tr><tr><td>SDS-PAGEまたはキャリパーサンプルバッファー&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>結合バッファー50</td><td></td><td></td><td>mM Tris、300 mM NaCl、10 mMイミダゾールpH 8(またはお好みのバッファー)。4°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>50</td> mM Tris、300 mM NaCl、50 mM イミダゾール pH 8 (またはお好みのバッファー) を洗浄<td></td><td></td>してください<td>。4°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>溶出バッファー50</td><td></td><td></td><td>mM Tris、300 mM NaCl、250 mMイミダゾールpH 8(またはお好みのバッファー)。4°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>96ウェルレシーバー/フィルタープレート20 &micro;m、1.8 ml容量</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740686.4</td><td>http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td></tr><tr><td>200 &mu;l使い捨てワイドボアチップ</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 050 348</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Ni セファロース 6 高速フロー樹脂</td><td>GE ヘルスケア</td><td>17-5318-02</td><td>ターゲット融合タンパク質の精製用。4°Cで保存します。使用前に洗浄し、平衡化してください。 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td></tr><tr><td>タバコエッチングウイルス(TEV)プロテアーゼ</td><td></td><td></td><td>切断用、オプション、切断用 2 mg/ml、保存バッファー中の還元剤なし。&minusで保存します。80°C。</td></tr><tr><td>96ウェル0.22 &micro;mフィルタープレート</td><td>Millipore</td><td>MSGV N22 10</td><td>オプション。切断後に可溶性画分をろ過するには http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td></tr><tr><td>SDS-PAGE/dotブロット装置またはキャリパーLabchip GXII装置</td><td></td><td></td><td>電気泳動装置およびゲルタイプの選択はユーザーにあります」の裁量。</td></tr><tr><td>分光光度計とキュベット</td><td></td><td></td><td>280nm(A280)での吸光度を測定し、可溶性タンパク質の収率を計算します。キャリパーで解析を行う場合は不要です。</td></tr><tr><td>ZipTipピペットチップ</td><td>ミリポア</td><td></td><td>オプション。ZipTipの種類は、ユーザーの裁量に委ねられています。C4樹脂は大きなタンパク質に使用する必要がありますが、ペプチドの場合はC18の方が優れている場合があります。サンプルの脱塩のための別の方法はまた、さらなる品質管理の前にサンプルをクリーンアップするために使用することができます. http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td></tr><tr><td colspan="4">材料は、プロトコルセクションに必要な順序でリストされています。試薬は、特に断りのない限り、室温で保存することができます。著者の参照番号の好ましい材料の選択肢が提供されていますが、同等の製品も適している場合があります。ブランドが実験結果に影響を与えない試薬については、会社の詳細は省略されています。</td></tr></tbody></table>

で産生された組換えジスルフィド豊富な毒タンパク質に印加される高スループット定量的発現スクリーニングおよび精製<em&gt; e.大腸菌の</em

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

大腸菌（E.coli）は、構造的および機能的研究のための組換えタンパク質の生産に最も広く使用される発現系である。多くのタンパク質は、不溶性の形態で発現されているので、タンパク質を精製することは時々困難である。困難または複数のターゲットを操作するときには、そのため迅速可溶性発現のための条件を識別するために、高スループット（HTP）小規模のタンパク質発現スクリーニング（1-4 5ml培養物）を使用することをお勧めします。ラボの種々の構造ゲノミクスプログラムに対応するため、（組換えタンパク質の0.1 mg / Lの培養物の範囲内）の定量的およびHTPタンパク質発現スクリーニングプロトコルは、何千ものタンパク質上に実装され、検証された。プロトコルは、液体ハンドリングロボットを用いて自動化しただけでなく、特殊な装置なしに手動で行うことができる。 ジスルフィド豊富な毒タンパク質が増している治療薬のリードとしての可能性の認識を高める。彼らは、非常に強力かつ選択的なことができますが、その複雑なジスルフィド結合ネットワークは、それらを製造するために挑戦します。 FP7、欧州Venomicsプロジェクト（の一員として<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> ）、私たちの課題は、機能的な特徴付けのための新規毒液タンパク質の何千もの生産を目的に成功した生産戦略を開発することである。ジスルフィド結合イソメラーゼのDsbCの酸化還元特性に助けられ、私たちは、 大腸菌中の酸化、機能的な毒ペプチドの発現のための私達のHTP制作パイプラインに適合大腸菌細胞質。プロトコルはまた、多様なジスルフィドリッチタンパク質の産生に適用可能である。ここでは、私たちのパイプラインは、動物の毒タンパク質の産生に適用さを証明している。プロトコルは、本明細書に記載してit可溶性ジスルフィドリッチタンパク質週できるだけ少ないで得られる可能性が高い。小さなスケールから、目を使用する可能性がありますeは、質量分析によって酸化状態を検証するために、パイロット研究において特徴づけのため、又は感受性マイクロアッセイのためのタンパク質を精製した。

代表的な結果をVENOMICSパイプラインから96ジスルフィドリッチタンパク質の発現スクリーニングのために、図6に示されている。タンパク質は残基の数を増加させること、次いで、ジスルフィド結合の数を増加させることによって配置されている。ペプチドは、HIS-タグおよびDsbCは融合パートナーと細胞質中で発現させた。推奨される培養条件を用いる場合、12のOD 600は、通常達成される。ペプチドを、ニッケル親和性樹脂の50μlの最終容量で8.2-Bプロトコルを使用して精製したので、約25 mg / Lの融合タンパク質の最大値は、この実験で検出することができた。 図6Aは、カリパーラボチップ（Caliper LabChip）システム（切断前の融合を示す）および融合タンパク質mg / L培養で得外挿に基づいて、スコアリングシステム（0.1〜2 mg / Lの培養物のレベルで、2からの電気泳動結果を示す10 mg / Lの培養物、10〜25 mg / Lの文化なし<html> Tが検出されました。）期待通りに切断されたDsbCタグは、通常ではなく27kDaのよりも、約32 kDaの動作する​​ことに注意してください。同様に、DsbCは融合も予想よりも高い約5 kDaのを実行します。ターゲットの多くのために我々は完全な融合（上のバンド）を参照していないだけでなく、融合パートナーは、単独（下のバンド）。これらのターゲットのいくつかのために培養条件を最適化するだけではDsbCは、最終的な収量の増加を可能にすることに比較して、完全な融合（上のバンド）の比率を向上させることができます。得点だけ無傷の融合のレベルに基づいています。唯一の16 96のうち、タンパク質は、融合レベルで検出することができなかった。これは、83％の全体的な成功レベルに​​対応する。検出することができた80のタンパク質のうち、これらのうちの45は2 mg / Lの培養物（56％）よりも高いレベルで検出された。 （この例では、プロトコルB 8.2〜25 mg / Lの融合タンパク質の最大値を検出することができるを用いても）標的との融合に依存して、タンパク質収量は2〜100 mg / Lの培養物の範囲である。 T &quot;&gt;現在のジスルフィド結合の数（ 図6（b）に示す）による成功の分析では、最低の成功レベルが6ジスルフィドを含むターゲットに対して66％であることと、（1と7の間）を試験のジスルフィド結合のすべての数値のための合理的な成功を示しています債券。等電点及び残基の数（ 図6Cに示されている）に基づく式の成功の分布の分析は、両方の発現に成功目標とプロット全体に散らばって検出されなかったターゲットに、技術は特に偏りを示さない。 図6Dは、DTTで還元試料の前後に、単一のターゲットのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）から得られた質量分析結果の一例を示す図である。通常、このような網羅的な質量分析解析は、しかし完全なdemonstratioの目的のために、（還元試料を分析する必要がない）実行する必要がないであろうNは、両方の結果を示している。図示ターゲットは4ジスルフィド結合を有する5.7 kDaのジスルフィドリッチ毒液タンパク質である。左のスペクトルは、それがさらなる介入なしに切断し、脱塩した後だったので、前のDTTによる還元に対するタンパク質の結果を示す。右側のスペクトルは、余分なDTTを除去するための脱塩に続くDTTによる還元後のタンパク質を示しています。実験大衆に対応するイオンは、スペクトル上の矢印でマークされ、各イオンのための指定は、緑で表示されます。 （タンパク質のための先行削減（-DTT）へと縮小（+ DTT）の後に）これ​​らのイオンのために計算された実験的な親質量は表に示します。質量（減少したサンプルのための先行削減、5717.6 Daのサンプルのための5709.6 DA）は8ダの質量差を示す。 2 Daの質量差が、1酸化されたジスルフィド結合の存在に対応する（予想通り）、従って8ダルトンの質量差は4ジスルフィド結合の存在を示すで非還元サンプル。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> 記載の半自動化された機器とのハイスループット発現スクリーニングプロトコルの図1略図。このプロトコルを使用して、96から384の条件は手動の方法を使用して一週間に一人で試験することができる、または最大1152の条件。発現プラスミドは、多数のターゲットが一度にサブクローン化することができるように、組換えクローニング技術を用いて構築される。一旦可溶性発現条件が同定されており、切断が行われ、所望の場合、タンパク質は、酸化および純度、マイクロアッセイおよび/または大規模生産を確認するための品質管理に進むことができる。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" wiDTH = &quot;500&quot; /&gt; 図2。ユニバーサル組換えクローニングのための回路図と設計を構築します。対象エントリクローンから、複数の発現ベクターは、ハイスループット様式（週で最大6×96エントリークローン）の単一の実験でサブクローン化することができる。発現されたタンパク質は、ニッケルアフィ​​ニティー精製にHISタグをコードしている。 DsbCは（細胞質発現のためにそのペリプラズムシグナル配列を欠く）融合パートナーは、溶解度を増加および/または折り畳みと標的タンパク質の正しい酸化を助けるために使用される。タグの切断が所望される場合に、ターゲットコード配列がN-末端TEVプロテアーゼ部位（ENLYFQ）を含むべきであることに留意されたい。左上の挿入図は、PCRまたは遺伝子合成により得ることができるドナーベクターと標的配列を使用して、エントリークローンの生成を示す。エントリークローンはまた、商業的なエントリークローンコレクションから得ることができる。複数の組換えクローニングシステムは、しかし、我々はゲートウェイの体系を利用して、ご利用いただけますM、回路図に示すように。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。複数のジスルフィドの豊富なターゲットのハイスループットスクリーニングのパイプライン。目標は、最初は、BL21（DE3）pLysSをEの細胞質中のHIS-DsbCの融合体として表現される自動誘導培地（ZYP-5052）を使用して、17分の37℃で大腸菌 。精製は、HTP電気泳動（又はドットブロット/ SDS-PAGEによる）により、可溶性構築物の検出に続いて、ニッケル樹脂上で行われる。発現スクリーニングの最初のラウンドが失敗した場合に、代替的な培養条件が試されている。構築物は、十分に高い収率、マイクロアッセイおよび品質管理において可溶性タンパク質を産生する場合に実行することができ、必要に応じて、大規模生産を追求することができる。水溶性の利回りが十分に高くないターゲットの場合、発現スクリーニングは、代替STRAを続行することができますインした後、温度が他の融合パートナーとペリプラズム発現。オプションのステップは、破線のボックスで示されている。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> HTPプラットフォームの図4ロボットのワークテーブルのセットアップ代替ワーク·テーブルを使用することもできるが、我々の液体ハンドリングロボットワークテーブルのレイアウトは、示されている、利用可能な等価なサイトが提供される。セットアップは（8チャンネル液体ハンドリングヘッド（LIHA））、4箇所で2マイクロプレートキャリアごと（MP4、1-4および5-8位）、2箇所で真空ステーションのための洗浄ステーション（WS）で構成されています2ポジションごと（TE-シェーカーは、14〜15と16〜17位）し、キャリアと3位（MP3は、11〜13位）、2プレートシェーカー付きマイクロプレートキャリア、（TE-VACSは、9と10位） 3ポジションを使い捨てチップのために（DITI、18〜20位）。加えて再2ホテルディープウェルプレート用の担体（図示せず）マイクロプレート用の1である。液体処理ロボットに搭載されているハードウェアは、使い捨てチップ、周りにプレート/機器を動かし、固定チップを備えた8チャネル液体ハンドリングヘッド（LIHA）とロボットマニピュレータ（ローマ）で使用するための96のマルチチャンネルアーム（MCA96）ですワークテーブル。位置の番号付けは、プロトコルの全体にわたって参照される。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> 図5 4つの24ウェルプレート中に単一の96ウェルプレートから転送するための模式図。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> 図6。代表的な結果は96ジスルフィド豊富な毒プロの発現の画面に表示されますteins。タンパク質は、細胞質中のHIS-DsbCの融合体として発現させ、ニッケル樹脂を50μl（プロトコル8.2-B）を用いて精製した。A）式のスクリーニングの結果、仮想ゲルを示すと発現収量得点。仮想ゲルのコントラストは非常に弱い又は強いバンドを補償するためにレーンを調整された。上のバンドは、インタクトな融合タンパク質単独融合タグに対応する下位バンドに対応する、いくつかの標的のために二つのバンドを見ることができることに留意されたい。B）それぞれの発現レベルで発現されたタンパク質の割合でジスルフィド結合の数と比較しタンパク質。各群におけるタンパク質の実際の数は、グラフ上に重ねている。C）等電点（pI）および残基の数に基づいて、発現レベルの分布D）5.7 kDaのジスルフィドリッチな毒のための質量分析結果の一例4ジスルフィド結合を有するタンパク質。上のスペクトル左側の前、DTTによる還元と右側のスペクトルにタンパク質を示しているタンパク質はDTTで還元した後、脱塩を示しています。実験大衆に対応するイオンは、矢印でマークされ、その割り当ては緑で表示されています。前削減へと縮小後のタンパク質のための実験的な質量は、表に示されており、8ダの質量差を示し、還元剤を添加する前に酸化されたタンパク質の存在に対応している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td>コンポーネント</td><td>レシピ</td><td>コメント</td></tr><tr><td> ZY </td><td> 〜928ミリリットル 10グラムリプトン 5gの酵母エキス 925ミリリットルの水</td><td>混合し、次いで滅菌するオートクレーブ。 </td></TR&gt; <tr><td> 2男のMgSO 4 </td><td> 100ミリリットル 49.3グラムのMgSO 4·7H 2 O 約60 mlの水</td><td>溶解するまで攪拌して滅菌するオートクレーブ。 </td></tr><tr><td> 50X 5052 </td><td> 1 L 250グラムのグリセロール 730ミリリットルの水 25gのグルコース 100グラムのα-乳糖</td><td>順番に追加するすべて溶解するまでの熱の上に攪拌して滅菌するオートクレーブ。 </td></tr><tr><td> 20X NPS </td><td> 1 L 900ミリリットルの水 66グラム（NH 4）2 SO 4 136グラムのKH 2 PO 4 142グラムのNa 2 HPO 4 </td><td>順番に追加し、すべて溶解し、その後滅菌するオートクレーブまで撹拌。 </td></tr></tbody></table> ZYP-5052培地の成分については、表1。レシピ。

定量的スクリーニング、ハイスループット発現および小規模大腸菌培養物からの融合タンパク質の精製、分析のためのプロトコルを説明し、ジスルフィドに富む動物毒タンパク質標的の発現に適用される。

で産生された組換えジスルフィド豊富な毒タンパク質に印加される高スループット定量的発現スクリーニングおよび精製<em&gt; E.大腸菌の</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

次の手順の全体的な目標は、ハイスループット発現スクリーニングプロトコルを使用して、自動液体ハンドリングロボットを使用して大腸菌の可溶性タンパク質のレベルを定量することです。これは、最初に接種することによって達成されます96。ターゲット融合タンパク質をコードするプラスミドで形質転換した細胞を用いたウェルプレカルチャー 翌日、自動誘導培地を充填した24ウェルプレートに一晩プレカルチャーを接種して発現を創出します。収穫後の培養物および発現培養物からの可溶性タンパク質の凍結は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製されます。最終的には、各インタクトターゲット融合の溶解度を測定して、タンパク質産生と成功したターゲットの生成に最適な発現条件を決定できます。効率が向上した従来の方法のこの技術の利点から、バッチへの制限されたバッチ放射線と、この方法の視覚的なデモンストレーションとデータ処理と追跡のシンプルさが重要です。自動化された手順は、テキストが手順の迅速さや単純さを伝えていないため、テキスト形式では理解しにくく、理解しにくいように見える場合があります。バクテリアの形質転換後、ロボットグリッパーを使用して最初の24ウェルLB寒天プレートの蓋を脇に置くことから始めます。次に、8チャンネルのリキッドハンドリングアームを使用して混合し、96ウェルのトランスフォームプレートから50マイクロリットルのトランスフォームミックスを吸引します。リキッドハンドリングアームの最初の4つのチャネル内の形質転換ミックスをLB寒天プレートの最初のカラムに分注し、最後の4つのチャネル内の形質転換をLB寒天プレートの2番目のカラムに分注し、分注後にすべてのチップを完全に洗浄し、96ウェルプレートからLB寒天プレートの次の4列のすべてのウェルに形質転換ミックスを移し続けます。そのプレートが完成しました。最初のプレートへの移動が完了したら、蓋を元に戻し、次のプレートの移動を開始します。すべてのトランスフォームを播種したら、すべてのプレートを1200 RPMで1分間振とうして、トランスフォーメーションミックスの均一な分布を生成します。次に、混合後、96マルチチャンネルアームを使用して、残りの形質転換混合物の60マイクロリットルを96ウェルプレートから吸引し、LBブロスを含むディープウェル96プレートに混合物を分注します。深井戸96のプレカルチャーを通気性のある接着フィルムで密封して培養空気の曝気を可能にし、プレートを摂氏37度の振とうインキュベーターに一晩最高速度で置きます。培養前をインキュベーターに入れたら、LB寒天プレートをフードに入れ、蓋を外した状態で約10分間駆動します。次に、37°Cのプレートインキュベーターでプレートを反転させます。翌日、リキッドハンドリングアームを使用して、一晩のプレカルチャーの100マイクロリットルを深いウェル96プレートに吸引し、発現カルチャーを1つの40分の1希釈で接種し、以前と同じスキームを使用して、プレカルチャーの各カラム間の洗浄ステーションでリキッドハンドリングアームを完全に洗浄します。接種が終了したら、発現培養物を摂氏37度の振とうインキュベーターに入れ、通気性のある接着剤で4時間密封します。次に、温度を摂氏17度に下げて一晩インキュベーションします。翌朝、深井戸24プレートを3000Gで10分間遠心分離し、抗菌剤を含む廃棄物容器に上清を捨て、プレートを逆さまに吸収紙に叩いて残留培地を取り除き、培養物が正しく成長したことを確認します。深井戸にペレットが存在するかどうかを確認します。次に、125マイクロリットルの溶解緩衝液を吸引し、緩衝液を深井戸24プレートの各ウェルに2回分注し、各ウェルに4つの先端を注入する。ペレットを再懸濁するための溶解緩衝液の最終容量1ミリリットルに達するには、プレートを1200RPMで5分間振とうします。ロボット上で、セル懸濁液を深井戸96プレートの適切なウェルに戻し、マイナス80°Cで密封されたプレートを最低1時間保管します。このデモンストレーションでは、50マイクロリットルのニッケルビーズを使用したプロトコルを使用して、ターゲット融合タンパク質を精製します。まず、ディープウェル96プレートを水浴で約15分間解凍します。その後、細胞溶解物を振盪インキュベーターに最大速度でさらに10分間懸濁すると、培養物は粘性になるはずです。次に、手動の8チャンネルピペットを使用して、DNAと硫酸マグネシウムの混合物をディープウェル96プレートの各ウェルに分注し、それぞれ10マイクログラム/ミリリットルと20ミリモルの最終濃度にします。密封されたプレートをさらに15分間振ると、培養物は非粘性になるはずです。精製中のフィルタープレートの目詰まりを防ぐためには、ライセートが粘性でなくなったことを注意深く目視で確認することが重要です。リキッドハンドリングロボットでは、200マイクロリットルのワイドボアチップを使用して樹脂スラリーを完全に混合してから、200マイクロリットルのスラリーをライセートを含むディープウェル96プレートに移します。1400 RPMおよび室温で10分間深い井戸96の版を結合を可能にするために振盪し、次に広い穴の先端を使用して混合し、次に200マイクロリットルのアリコートの樹脂のlysateのスラリーの完全な1200マイクロリットルをフィルター版に移す。次に、真空を約30秒間オンにして、プレートを介してライセートをろ過し、深いウェルに流れを収集します。96は、流れを含む深井戸96の下方をフィルタープレートの下から取り出し、実験終了までラックに収納する。次に、2回目の洗浄後に毎回800マイクロリットルの結合バッファーで樹脂を2回洗浄し、ロボットグリッパーを使用してフィルタープレートの下に新鮮で深い96プレートを配置し、50ミリモルIミダズウォッシュを収集します。150マイクロリットルの洗浄バッファーをフィルタープレートに加え、バッファーがディープウェル96を含むものを通過するまで再度真空を適用する。洗浄液はフィルタープレートの下から取り出され、実験が終了するまでラックに保管されます。次に、結合バッファーで実証されたように、800マイクロリットルの洗浄バッファーでさらに2回洗浄した後、ロボットグリッパーを使用してマイクロプレートを作業テーブルに移し、SPEブロックとフィルタープレートをマイクロプレートの上に戻してエルーシアンを回収しました。次に、フィルタープレートの樹脂に190マイクロリットルのElucianバッファーを追加します。3分後、バキュームを1分間適用して、すべてのバッファが通過できるようにします。Ellucianボリュームが正しいことをすばやく視覚的に確認します。最後に、Ellucian洗浄のブロックサンプルをプレートに流して、可溶性発現のレベルを定量化します。最初にエルシアンプレートを分析し、必要な場合にのみ、関連する洗浄とフラクションのフローを確認します。これらのデータは、キャリパーラボチップシステムからの電気泳動結果を示しています。無傷の切断された融合タンパク質は上部のバンドで表され、切断されたタンパク質フラグメントは下部のバンドで表されます。各標的タンパク質の融合収率は、1リットルあたり0.1〜2、2〜10、および10〜25マイクログラム/リットルの培養レベル内にあると決定されましたが、場合によっては検出されませんでした。各融合タンパク質フラグメント内に存在するディススルフィド結合の数によってタンパク質発現の成功を評価すると、試験したすべてのジスルフィド結合の数について妥当な成功が示され、最も低い成功レベルは66%でした6つのジスルフィド結合を含むターゲット。等電点と残基数に基づく発現成功の分布の解析では、発現に成功したターゲットと検出されなかったターゲットの両方がプロット全体に散在しているため、この手法に特にバイアスはないことが示されました。融合物が検出されて切断されると、精製されたターゲットは、エレクトロスプレーイオン化、質量分析による品質管理を受けます。ここで示されている代表的なターゲットは、4つのジスルフィド結合を持つ5.7キロダルトンのジスルフィドリッチ毒タンパク質です。このスペクトルは、DTTで還元する前のタンパク質の結果と、さらなる介入なしでの切断および脱塩後のタンパク質の結果を示しています。このスペクトルは、DTTで還元した後、余分なDTTを除去するための脱塩後のタンパク質を示しています。矢印は実験質量に対応するイオンを示し、各イオンの名称は緑色で示されています。これらのイオンについて計算された実験用親質量を表に示し、4つの酸化硫化ジアン結合に相当する8ダルトンの質量差に対応しています。セットアップすると、完全なプロトコールを1週間以内に1,000を超える培養物で実行できます。このビデオを見れば、ハイスループット法を使用して可溶性タンパク質産生に必要な成功条件を特定するために、小規模の大腸菌培養を使用する方法を十分に理解できるはずです。

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