効率的な哺乳動物細胞発現および結晶化のための細胞外糖タンパク質のシングルステップの精製
2015年12月23日
これは、分泌されたグリコシル化された哺乳類タンパク質の生産と、その後のX線結晶構造解析やその他の生物物理学的研究のための十分な収量の均質なタンパク質のシングルステップ精製のための迅速で費用対効果の高いプロトコルです。
この哺乳類のタンパク質発現技術の全体的な目標は、構造的、生物物理学的、機能的研究に適した、ミリグラム単位の天然折り畳みタンパク質を生成することです。この技術の主な利点は、分泌された哺乳類タンパク質と構造研究に必要な純度の濃度を得るための迅速で簡単なプロトコルであることです。一般的に、タンパク質収量に関するほとんどの問題は、細胞の健康と生存率によるものであることがわかっています。
細胞の生存率を綿密にモニタリングし、培地の糖レベルもモニタリングすることで、タンパク質の収量を大幅に改善し、細胞の有用性を延ばすことができます。また、細胞密度を監視することも非常に重要です。トランスフェクション前の任意の時点で細胞が1ミリリットルあたり200万細胞を超えると、タンパク質収量が大幅に減少することがわかりました2 93 F細胞の大規模な培養を行うには、1リットルの2 93 F培地に10ミリリットルの100 xグルタミンと5ミリリットルの100 xペン連鎖球菌を補給します。
抗生物質は無血清条件下で十分な強度を示しており、抗生物質濃度が低下するとトランスフェクション中の細胞生存率が向上し、タンパク質収量の培養が改善されます。1リットルの培地に300ミリリットルの培地に入った2つの93F細胞を、トランスフェクションの1日前に標準的な組織培養インキュベーターで振とうしながら、摂氏37度、8%の二酸化炭素でベントキャップ付きの三角フラスコをバッフルし、トランスフェクションの日に細胞を1ミリリットルあたり50万個の細胞密度に希釈します。2 93 F培地に10%の容量の2%重量/体積セルブーストを添加して、培地を補充します。
このステップで見られるようにkafuを追加して、タンパク質のグリコシル化を制御します。DNAおよびトランスフェクション試薬溶液を無血清培地で調製し、5分間インキュベートします。次に、トランスフェクション試薬をDNA溶液に1ミリリットル刻みで加えて混合します。
室温で30分間静かにインキュベートし、試薬DNA複合体を形成します。次に、溶液を細胞に滴下し、トランスフェクションした細胞がタンパク質を72〜96時間発現させて糖タンパク質を精製します。まず、培養物を遠心分離フラスコ遠心分離機に1300 Gs.To で20分間デカントし、細胞をペレット化し、スーパーナトを収集し、必要に応じて2回目のスピンを行うか、0.22ミクロンフィルターを使用して上清を清澄化します。
次に、10 x ニッケルニトロ負荷、三酢酸、またはニッケルNTA結合バッファーを10%容量で加えます。次に、2ミリリットルのニッケルNTAスラリーをカラムに加え、摂氏4度で作動する1×結合バッファーの10カラム容量で平衡化することにより、摂氏4度の重力カラムを調製します。上澄み液を樹脂に流し、流れを溜め込みます。
上清を注いだ後、10カラム容量の洗浄バッファーでカラム洗浄します。次に、5カラム容量の溶出バッファーでタンパク質を溶出します。0.5ミリリットルの最終容量に脱グリコシル化が必要な場合は、16, 000GSおよび摂氏4度での遠心分離により、遠心分離濃縮器ペレットを使用してEITを0.43ミリリットルに濃縮します。
次に、500ミリモルのクエン酸ナトリウム、pH 5.5、および20マイクロリットルのエンドhfの50マイクロリットルを加えます。タンパク質を洗浄した樹脂と摂氏4度で1時間インキュベートします。
インキュベーション後、1000Gで5分間回転して樹脂をペレット化し、上清を回収します。適切な分子量カットオフ、遠心分離フィルター、および図示の貯蔵バッファーへのバッファー交換を使用してタンパク質を濃縮します。以下は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィー後のシネ処理細胞で発現する分泌タンパク質の代表的なSDSページの結果です。
第1のレーンは脱グリコシル化前のタンパク質で、第2のレーンはエンドhfによる脱グリコシル化後のタンパク質です。グリコシル化タンパク質は約10キロダルトン高くなり、その後、1回の精製ステップの後、脱グリコシル化後の予測分子量と一致する単一のバンドに崩壊します。クリスタルスクリーンは吊り下げ式で設置しました。
上の画像は最初の結晶ヒットを示し、下の画像は最適化された結晶化条件を示しています。このことは、対象タンパク質の生化学的均一性が結晶化成功の決定因子となり得ること、そして最適化された哺乳類発現系がこの結晶化に適したタンパク質を生成することを示しています。ニッケル精製タンパク質のさらなる精製は、サイズ排除クロマトグラフィーによって容易に行うことができます。
これは、タンパク質産生を評価し、適切に折り畳まれたタンパク質を生成するための条件を最適化するための有用なステップでもあります。目的のタンパク質はクロマトグラフィー溶出の主要な分子種である必要があり、溶出量はタンパク質の分子量に対応している必要があります。先ほどの。EEU時間は、一度習得するとタンパク質の凝集またはミスフォールディングを示唆している可能性があります。
この手法は、適切に実行すれば4日で実行できます。この手順を実行する間、この手順に従って細胞培養の無菌状態を維持することが重要です。サイズ、排除クロマトグラフィー、マルチアングル光散乱、示差スキャン、蛍光測定などの他の方法を実行して、タンパク質のオリゼーション状態と熱安定性を評価することができます。
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概要
このプロトコルは、構造研究に適した高収率を得るために、哺乳動物由来の分泌型、グリコシル化タンパク質を迅速かつコスト効率良く生産する手法を概説しています。細胞の健康状態と条件のモニタリングの重要性を強調しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- タンパク質発現
- 生物物理学的研究
- X線結晶解析
背景
- ネイティブフォールド型タンパク質の生産に焦点を当てています。
- 細胞の生存率と培養条件の重要性。
- 収率には細胞密度のモニタリングが不可欠です。
- 大規模培養に293F細胞を利用しています。
研究目的
- 哺乳動物由来のタンパク質を取得するための迅速なプロトコルを開発すること。
- 構造研究に適したタンパク質を確保すること。
- 慎重なモニタリングを通じてタンパク質の収率を向上させること。
使用した方法
- 293F細胞のトランスフェクション。
- グルタミンとペニシリン・ストレプトマイシンを添加した培養培地。
- 細胞の健康状態と培地の糖度レベルのモニタリング。
- 大規模培養技術。
主要な結果
- 分泌型タンパク質をミリグラム量で達成しました。
- 細胞成長とタンパク質収率に最適な条件を特定しました。
- 細胞密度のモニタリングの有効性を示しました。
- タンパク質精製のための信頼できる方法を提供しました。
結論
- このプロトコルは高品質の哺乳動物由来タンパク質を生産するのに効率的です。
- 細胞の健康状態とモニタリングはタンパク質発現の成功に不可欠です。
- 様々な構造および生物物理学的応用に適しています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid, scalable production of natively folded mammalian glycoproteins is a critical bottleneck for structural biology and biophysical characterization in early drug discovery. This protocol enables efficient generation and single-step purification of secreted proteins, directly supporting structure-based drug design and mechanistic de-risking. Streamlined workflows reduce time and cost barriers, accelerating progression from target validation to lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables production of milligram quantities of functional glycoproteins for structural interrogation.
- Supports mechanistic de-risking by providing natively folded proteins for biophysical assays.
- Facilitates rapid hypothesis testing and target confidence through high-quality protein reagents.
Screening & Assay Development
- Delivers purified proteins suitable for downstream assay development and screening platforms.
- Improves assay reproducibility and standardization by ensuring protein homogeneity and quality.
- Reduces workflow complexity with single-step purification, supporting scalable screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Provides structurally validated proteins for translational biomarker studies when relevant.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by supporting advanced biophysical analyses.
- Reduces risk of late-stage failures by ensuring protein quality for functional and structural studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing high-quality protein reagents for structural, biophysical, and functional workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven target validation and pathway elucidation with native glycoproteins.
- Screening: Delivers reproducible, homogeneous proteins for robust assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of protein folding, purity, and glycosylation state for comparative analyses.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant protein forms for downstream studies when applicable.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for rapid protein production across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines production timelines with standardized, scalable protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling early structural insights.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally tractable targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture and protein purification techniques.
- Needs access to suspension-adapted cell lines, tissue culture infrastructure, and chromatography systems.
- Demands rigorous monitoring of cell viability, density, and media composition for optimal yields.
- Adaptable to various glycoprotein targets but may require optimization for specific constructs.
- Protein quality assessment (e.g., SDS-PAGE, size exclusion chromatography) is essential for downstream success.
