効率的な哺乳動物細胞発現および結晶化のための細胞外糖タンパク質のシングルステップの精製

この哺乳類タンパク質発現技術の総合的な目的は、構造研究、生物物理学的研究、および機能研究に適した、天然状態で折りたたまれたタンパク質をミリグラム単位で調製することです。本手法の主な利点は、分泌される哺乳類タンパク質を迅速かつ簡便なプロトコルで取得でき、構造研究に必要な純度での濃縮が可能であることです。一般的に、タンパク質収量に関するほとんどの問題は、細胞の健康状態と生存率に起因すると考えられます。

細胞生存率と培地の糖濃度を綿密にモニタリングすることで、タンパク質の収量を大幅に向上させ、細胞の有効期間を延長させることができます。また、細胞密度のモニタリングも非常に重要です。トランスフェクション前の任意の時点で細胞密度が2 million cells/mLを超えると、タンパク質の収量が大幅に減少することが分かっています。293F細胞の大スケール培養を行うには、1 Lの293F培地に10 mLの100x glutamineと5 mLの100x pen strepを添加してください。

血清不含条件下では抗生物質の強度が十分であり、抗生物質濃度を低減させることでトランスフェクション中の細胞生存率が向上し、結果としてタンパク質の回収量が増加します。トランスフェクションの1日前、1Lのポリカーボネート製バッフル付きエルレンマイヤーフラスコ（ベントキャップ付き）に300mLの培地と共に2 93 F細胞を入れ、標準的な組織培養インキュベーターにて37°C、8% CO2条件下で振盪培養します。トランスフェクション当日に、細胞密度が0.5 million cells/mLとなるように希釈します。その後、2 93 F培地で調製した2% w/v Cell Boostを容量比10%添加し、培養液に補充します。

タンパク質の糖鎖付加を制御するため、このステップでkafuを添加します。DNAおよびトランスフェクション試薬の溶液を無血清培地で調製し、5分間インキュベートします。次に、トランスフェクション試薬を1 mLずつDNA溶液に加え、混合します。

試薬とDNAの複合体を形成させるため、室温で30分間静かにインキュベートします。その後、溶液を細胞に滴下し、導入された細胞に72～96時間かけてタンパク質を発現させ、糖タンパク質を精製します。まず、培養液を遠心チューブに移し、1300 Gsで20分間遠心分離します。細胞をペレット化し、上清を回収します。必要に応じて、再度遠心分離を行うか、0.22 micronフィルターを使用して上清を清澄化します。

次に、10%容量の10倍ニッケルニトロロード、トリ酢酸、またはニッケルNTA結合バッファーを加えます。続いて、4°Cで重力カラムを準備します。具体的には、2 mLのニッケルNTAスラリーをカラムに加え、4°Cで1倍結合バッファー10カラム分を用いて平衡化します。上清を樹脂に通し、フロスルーを回収します。

上清をカラムに流し切った後、洗浄バッファー10カラム分でカラムを洗浄します。次に、溶出バッファー5カラム分でタンパク質を溶出させます。脱糖鎖処理が必要な場合は、遠心濃縮器を用いてEITを0.43 mLまで濃縮し、最終容量を0.5 mLにします。その後、16,000 ×g、4 °Cで遠心分離を行い、デブリをペレット化します。

次に、500 mM クエン酸ナトリウム（pH 5.5）を 50 µL、および endo HF を 20 µL 加えます。この混合物を室温で2時間インキュベートして endo HF を除去します。その後、アミロースレジンをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄します。洗浄したレジンとタンパク質を 4 °C で1時間インキュベートします。

インキュベーション後、1000 Gsで5分間遠心分離してレジンをペレット化し、上清を回収します。適切な分画分子量（MWCO）の遠心分離フィルターを用いてタンパク質を濃縮し、指定の保存バッファーでバッファー交換を行います。以下は、ニッケル親和性クロマトグラフィー後、cine処理細胞で発現した分泌タンパク質の代表的なSDS-PAGEの結果です。

1番目のレーンは脱糖鎖処理前のタンパク質であり、2番目のレーンはEndo HFによる脱糖鎖処理後のタンパク質です。糖鎖付加タンパク質は、約10 kilodaltons高い位置に泳動されますが、単一の精製工程を経て脱糖鎖処理を行うと、予測分子量と一致する単一のバンドに収束します。結晶スクリーニングは、吊り滴法を用いて実施しました。

上の画像は最初の結晶ヒットを示し、下の画像は最適化された結晶化条件を示しています。これは、目的タンパク質の生化学的な均一性が結晶化の成功を左右する決定要因となり得ること、および最適化された哺乳類発現系によって結晶化に適したタンパク質が産生されることを実証しています。ニッケル精製後のタンパク質のさらなる精製は、サイズ排除クロマトグラフィーによって容易に行うことができます。

これは、タンパク質生産の評価や、適切に折り畳まれたタンパク質を得るための条件最適化に向けた有用なステップでもあります。目的タンパク質がクロマトグラフィー溶出における主要な種である必要があり、溶出容量はタンパク質の分子量と一致していなければなりません。予定より早い溶出時間は、タンパク質の凝集またはミスフォールディングを示唆している可能性があります。習熟後は、

この手法は、適切に実施すれば4日間で完了できます。本手順の実施にあたっては、細胞培養のための無菌状態を維持することが重要です。タンパク質のオリゴマー化状態および熱安定性を評価するために、サイズ排除クロマトグラフィー、多角度光散乱法、示差走査蛍光法などの他の手法を実施することができます。