Name: 患者とヒト内皮細胞に由来する前立腺循環腫瘍細胞との間のE-セレクチン介在性の相互作用を観察するin vitro法での (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 学ぶ前立腺循環腫瘍細胞とE-セレクチン発現内皮細胞の相互作用をマイクロスライド流動アッセイで観察する方法。ビデオ顕微鏡を用いてリアルタイムで細胞接着動態を解析し、転移メカニズムの理解に貢献します。

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この作品は、米国国立がん研究所から国防総省前立腺癌研究プログラム（W81XWH-12-1から0124）の、U54CA143876、ロバートMcCooey泌尿生殖器がん研究基金からの資金によってサポートされていました。私たちは、HUVECをを提供するためのVE-カドヘリン抗体を提供し、博士マルコSeandel（外科）博士Annaritaロレンツォ（病理部）に感謝したいと思います。

観測CTC - 内皮相互作用のためのマイクロスライド上の1。培養のHUVEC <ol><li>組織培養フードの下では、まず、PBSで1mmのチャネル幅をマイクロスライドをすすぐ。優しくコート1ミリリットルルアーロック注射器を用いて50μg/ mlのフィブロネクチン（PBSに溶解）200μlのマイクロスライド。 </li><li>蓋付きのマイクロスライドをカバーし、30分間組織培養フードの中に保管してください。マイクロスライド内の液体の遅い分注は、チャネル内の気泡の形成を防ぐことができます。 </li><li>マイクロスライド上に温かい（37°C）HUVEC増殖培地200μl（M199培地、1M HEPES、20％FBS、5 mg / mlのヘパリン、100μg/ mlの内皮細胞成長因子、及びL-グルタミン）を灌流し、インキュベートRTで20分。灌流中、HUVEC細胞懸濁液を調製。 </li><li> PBSでのHUVECをすすぎ、室温で1〜2分間、0.05％トリプシン-EDTAを追加します。 5分間180×gでの2mlの増殖培地中でHUVECを遠心分離機。 </li><li> neubaを用いて細胞濃度を測定UERの血球計数器および増殖培地μL10 7のHUVEC cells/100を準備します。その後、慎重に200μlのピペットチップを用いてマイクロスライドの入口からメディアを取り出します。 </li><li>目の高さにマイクロスライドを持参し、1 mlのルアーロック注射器を用いて、そっとチャンネルにHUVECの準備濃度の200μLを灌流。注意気泡形成を防ぐために、この段階で必要とされる。気泡が表示された場合、気泡が出口チャネルを入力するまで、わずかにより長い時間灌流キープ。 </li><li>マイクロスライドの入口と出口の両方でのHUVECメディア、等量の（〜80μl）を置く。これは、いずれかの方向における細胞の流れを防止する。 </li><li>スライドをカバーし、1.5時間、インキュベーター（37℃）に保管してください。 </li></ol>ミクロスライド上で一晩HUVEC文化のためのフロー商工総会の2。準備<ol><li> 15マイルのためのインキュベーター内の滅菌20 mlの注射器、メスとオスルアーコネクタ、チューブ、シリンジポンプを配置N。 </li><li>最小限のデッドボリュームの場合は、0.04インチの内径のチューブを使用しています。より小さなチューブ径が気泡形成を防止する。 </li><li>温かい（37℃）、HUVEC培地（12ml）で20 mlの注射器を埋める。注射器の上にコネクタを備えたチューブを取り付けます。気泡を除去する。マイクロスライドにこのアセンブリを接続します。 </li><li>完全HUVEC培地でマイクロスライドの入口を埋める。マイクロスライドの横のコネクタに接続され満たされた20 mlの注射器を持参してください。静かにマイクロスライドにコネクタを取り付けます。 </li><li>インキュベーターにセットアップを持参し、10μL/分のせん断速度に設定したシリンジポンプに接続します。 37℃のインキュベーター内で細胞のO / Nを残す</li><li>次の日、マイクロスライドの入口に取り付けられたコネクタを削除することで、セットアップを分解します。 </li><li> ECの上、E-セレクチンの発現を上方制御するために、4ミリリットルのメディアが10 ng / mlの時に、IL-1βを含む新鮮な増殖培地を準備します。 10 mlの注射器でメディアを吸引除去する。 Tを削除彼マイクロスライドの入口からメディアやスライドにシリンジを接続します。 </li><li>インキュベーター内で4時間10μL/分の剪断速度でシリンジポンプを設定します。 </li></ol> 3。抗PSMAの調製（J591-488）ラベル前立腺癌細胞<ol><li> HUVECのIL-1βのインキュベーションの間、抗PSMA J591-をAlexa488ラベルのPCa細胞を調製。 1分間MDA細胞を0.05％トリプシン-EDTAを追加します。それが細胞表面に存在する糖ペプチドに影響を与えることができるように長い時間のために、トリプシンに細胞を放置しないでください。酵素を含まない細胞解離試薬はまた、代わりに、トリプシンを使用することができる。 5分間200×gで遠心分離する。 </li><li> 1ミリリットルのH / Hバッファー（ハンクスsolution/0.1％HSA/10のHEPES / 1のCaCl 2）でのMDA細胞ペレットを再懸濁します。暗い場所での室温で30分間20μg/ mlの時に抗PSMA J591-のAlexa488抗体を追加します。インキュベーション中に細胞を再懸濁。 </li><li> 30分後、5分間800×gで細胞溶液を遠心する。 ASPIレートと1ミリリットルのH / Hバッファにペレットを再懸濁します。標識されたMDA細胞をカウントし、1×10 6細胞/ mlの最終濃度をもたらす。 J591-488ラベルされたMDA細胞を5 mLの注射器を記入し、気泡を除去。 </li></ol> PCaの患者から4。抗PSMAの調製（J591-488）ラベルのCTCエンリッチ<ol><li> （クエン酸ナトリウムを含有する）は青キャップチューブに前立腺癌患者から7.5ミリリットルの血液を収集する。穏やかに0.1％BSA / 1 mMのEDTA / PBS中の血液1:1に希釈する。 </li><li> 5.3ミリリットルフィコール·パックプラス50mlのコニカルチューブに追加します。層は、フィコール·パックの上に血を希釈した。 30分間400×gで遠心分離する。 </li><li>プレコート全てのチューブまたは先端が2％FBS/RPMI-1640 / 1mMのCaCl 2/4のMgCl 2表面へのCTCの非特異的結合を防ぐために、（R / S緩衝液）を用いたCTCと接触する。 CTCのと接触メディアとバッファの4℃の温度を維持する。 </li><li>末梢血単核細胞（PBMC）を画分を集め30ミリリットルのR / Sバッファを含む別の50 mlのコニカルチューブ内のインタフェースからのCTCを含む。 8分間400×gで遠心分離する。 </li><li>ペレットを再懸濁し、8分間、400×gでR / S緩衝液中で再度洗浄する。遠心分離した後、H / Hバッファーでペレットを再懸濁します。暗い場所での室温で30分間20μg/ mlの時に抗PSMA J591-488抗体を追加します。 </li><li> 30分後、J591-488を含む遠心PBMCを、5分間、800×gでのCTCを標識した。 H / Hのバッファに再懸濁。試料と（R / S緩衝液で予めコーティング）1mlシリンジを充填する。 </li></ol> 5。顕微鏡の準備、シリンジポンプおよびフロー商工総会<ol><li>倒立顕微鏡の電源をオンにして、10倍の対物レンズでケーラー照明を設定します。顕微鏡の試料ステージと同じレベルで、シリンジポンプを持参し、1ダイン/ cm 2のせん断応力（〜10μL/分）で設定してください。 </li><li>ツァイスAxioVisionのソフトウェアを起動します。コンピュータ画面上の目的を選択します。新規作成ソフトウェアの[ツール]オプションの下にあるフォルダ。 </li><li> AxioVisionのスマート実験オプションを開いて、30分間の短い30秒のビデオを記録するために設定を調整します。 </li><li>ライブの蛍光ビデオ、画像オプション-12秒露出、2×2ビン、5ゲインを設定します。これらのパラメータは、ツァイスMRMカメラでビデオのフレームレート（毎秒約23フレーム）に近いビデオを達成するの​​に役立ちます。 </li><li>コンピュータの画面に10のX目的で流路の幅全体を可視化するために、Cマウントアダプター（0.63 xf/60 mmインタフェース）を使用します。 </li><li>水銀ランプのスイッチをオンにします。 </li><li>シリンジとシリンジポンプ上に細胞を含むコネクタを配置します。 </li><li> IL-1βは、インキュベーターからのHUVECを刺激させる。 HUVECをを含むマイクロスライドの塗りつぶされた入口チャネルへのコネクタを接続します。 </li><li>チューブに取り付けられたコネクタと出口チャネルを接続します。フロースルーを収集するために皿または15ミリリットルコニカルチューブにチューブを入れる。 </li><li> infusiを開始10μL/分でマイクロスライドを通して上。内皮細胞間の相互作用を観察し、MDA細胞またはエピ蛍光顕微鏡で488 nmのフィルタの下に患者に由来するラベルのCTCのラベル。 </li><li> 30秒の短いビデオなどの実験の記録を開始。再生分析中に、ローリング速度を測定。圧延速度は、経時的に細胞が移動した距離を割ることによって測定される。 </li></ol>ミクロスライドの6。免疫染色<ol><li> 10分間、IL-1βで刺激したHUVECにMDA細胞を灌流した後にマイクロスライドの入口と出口からメディアを取り出します。 </li><li> （37°C）をPBSで5分間、マイクロスライドの入口にカルシウム及びマグネシウムを含有する200μlのチップを用いて、暖かい置く。ベンチで小道具としての蓋を使用してマイクロスライドを傾けます。免疫染色時に全てのインキュベーションのために傾いた位置にマイクロスライドを保管してください。 </li><li>入口に暖かい、2％ホルムアルデヒドを灌流によってHUVECをを修正しました。 </li><l私は&gt;室温で20分間インキュベートする。 5分間ずつPBSで2回すすいでください。 </li><li> RTで10分間PBS中5％BSAにトリトンX-100（0.1％）を添加する。 </li><li> 5分間ずつPBSで2回すすいでください。 30分間、PBS中の5％BSAでブロックする。 </li><li>一次抗体ヤギ4℃で2.5％のBSA、O / Nでの抗VE-カドヘリン（1:100）でインキュベート</li><li>次の日、5分間ずつPBSで2回洗浄します。 45分間二次ロバ抗ヤギ抗体647を追加します。 5分間ずつPBSで2回洗浄します。 </li><li> 1時間ヒトJ591-のAlexa488結合抗体で、室温でインキュベートする。 </li><li> 5分間ずつPBSで2回洗浄します。 5分間、DAPIを追加します。 5分間蒸留水で洗ってください。 </li><li> PBSを追加する（または長期保存のためのMowiol）。共焦点顕微鏡下でマイクロスライドを可視化する。 </li></ol>

<ol><li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li>
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<li>Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+fucosyltransferase+III+disrupts+the+adhesion+of+circulating+cancer+cells+to+E-selectin+without+affecting+hematopoietic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion.</a> Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).</li>
<li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).</li>
</ol>

博士バンダーは、この記事で使用したJ591抗体のためにコーネル研究財団（「CRF」）に割り当てられている特許に関する発明である。博士バンダーはコンサルタントであるMLN-2704の特許は、さらなる研究と開発のためのCRFによってライセンスされていると、会社の株式を所有しています。

による血液細胞の間でのCTCの数が少ないために、それは、細胞の純粋な集団としてのCTCを単離することは困難である。 CTC / ECの相互作用を研究するために、CTCの稀で、不純な人口は、2つの主要な課題提起：血液細胞の間でCTCのa）の特定を; B）CTC / ECの相互作用の観察。 血液細胞のう ​​ち、前立腺のCTCを同定する第一の制限を克服するために、我々は、事実上すべての前立腺腫瘍細胞を6 PSMA を発現するという事実を利用した。モノクローナル抗体J591-488は、細胞表面のPCaのCTCを標識することができることを示唆している結合ex vivoで以下の内部化とCTC / ECの相互作用13のために研究されている。抗体および免疫蛍光極大の最適な内在化のために、我々は30分または1時間のいずれかのために4℃または37℃のいずれかで抗体を用いてMDA細胞をインキュベートした。我々は最大の免疫蛍光が観測されたことを観察した37°Cで30...

転移は、ほとんど理解さままで複雑な多段階プロセスである。 E-selectin/selectinリガンド軸は、血管内皮細胞と癌細胞との間の1,2主要接着剤の相互作用を促進することによって腫瘍転移において重要な役割を果たすことが示されている。内皮細胞（E）-セレクチン異なるE-セレクチンリガンド（単数または複数）は、腫瘍細胞3で表されているが、活性化された内皮細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。多数のインビトロのアプローチが成功裏に腫瘍細胞および内皮細胞（EC） は1〜E-selectin/selectinリガンド相互作用をモデル化するために使用されてきた。これらの相互作用を研究するために、異なるフローチャンバーシステムは、血管系をシミュレートするために使用されている。フローチャンバーアセンブリの中でも、電気部品と連動して平行プレートフローチャンバー（PPFC）が日常的にインビボせん断応力条件においてシミュレートインビトロモデルとして使用される。この中法のECは35-mmディッシュ上で増殖させ、単層を達成した後、電気部品は、PPFCに取り付けられており、せん断応力ベースの実験を行っている。 しかし、PPFC、その他の現在のシステムは、CTCのは、血液細胞の何百万人の間で循環して、原発腫瘍から脱落、細胞のまれな集団であるため、主に、患者とのECから派生（CTCの）循環腫瘍細胞の間の接着相互作用を研究するために多くの制約を提示（10 9血液細胞あたり1 CTC）4。従って、培養細胞株の無制限の供給とは異なり、低CTCカウントを再生分析のための相互作用を記録するために適切な流路幅を必要とする非常に少数のまれなCTCおよび/ EC相互作用をもたらす。患者派生のCTCが不純な集団であることからさらに、したがって、識別マーカーは、特定の内のCTCを追跡するために必要とされている。この問題を解決するために、我々は、前立腺癌（PCaの）CTを同定する新しい方法を開発Csの実質的にすべてのこれらのCTCのは、それらの細胞表面上で、5,6、前立腺特異的膜抗原（PSMA）を発現するという事実を利用することにより。本稿では、転移のメカニズムを理解するために、最終的には、ECの前立腺のCTCの相互作用を研究するために我々の新しいシステムの潜在的な有用性を実証するために、前立腺癌細胞株、MDA PCA2B（MDA）を使用しました。 私たちの方法論は、生体内血管系7-9 にシミュレートする様々なせん断基づく実験に適用することができます。 PCaのCTC / ECの相互作用を調べることに加えて、現在のフローチャンバーシステムを容易に電気部品で末梢血単核細胞または腫瘍細胞の相互作用を分析するように適合され得る。分解·フローチャンバーの再組み立ての容易さ、（以下、マイクロスライドという）マイクロスライドIII（0.1）は 、灌流の下で培養のECを可能にし、PRを誘導するために種々のサイトカインでのECを刺激otein式。加えて、培養された電気部品、例えば、E-およびP-セレクチン組換えタンパク質は、腫瘍細胞と相互作用し、マイクロスライド上に被覆することができる層流状態10で観察することができる。

<table><tbody><tr><td>マイクロスライド</td><td>イビディ</td><td>80331</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>ミリポア</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック チューブ</td><td>コール パーマー</td><td>EW-96115-08</td><td></td></tr><tr><td>オス ルアー アダプター</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>メス ルアー アダプター</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ ポンプ</td><td>Chemyx Inc</td><td>Fusion 100</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロックシリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium</td><td>Sigma</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>内皮マイトジェン</td><td>バイオメディカル テクノロジー</td><td>ズ BT-203</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSMA J591-488</td><td>Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interleukin-1 beta</td><td>Peprotech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ミリポア</td><td>SM-2002-C</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ</td><td>H-3149</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>ワイル コーネル医科大学</td> - 外科部門 <td></td><td>マルコ Seandel</td></tr><tr><td>VE-Cadherin</td><td>サンタ クルス</td><td>sc-5648</td><td></td></tr><tr><td>10x objective</td><td>Zeiss Plan Neofluar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵素フリー細胞解離試薬</td><td>ミリポア</td><td>S-004-C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ロンザ</td><td>12-702-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-paque plus</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr></tbody></table>

患者とヒト内皮細胞に由来する前立腺循環腫瘍細胞との間のe-セレクチン介在性の相互作用を観察するin vitro法での

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

転移は血管外遊出および二ニッチを形成するためのアクセスを取得することにより、腫瘍細胞が原発腫瘍intravasate血液血管およびリンパ系から脱落するプロセスである。血管系からの腫瘍細胞の血管外遊出は、異なる細胞株から得られた内皮細胞（EC）および腫瘍細胞を用いて研究することができる。初期の研究は、静的条件を用いて行ったが、それはウェルのECは生理的流れの条件下では異なる挙動を示すことが実証されている。したがって、異なるフローチャンバアセンブリは、現在のECによる癌細胞の相互作用を研究するために使用されている。電流フローチャンバアセンブリは、異なる剪断応力条件下での異なる細胞株または流体のいずれかを使用して再現性のある結果を提供する。しかしながら、このような循環腫瘍細胞（CTCの）のような希少細胞との相互作用を観察し、研究するために、特定の変更は、従来のフローチャンバアセンブリに行われる必要がある。 CTCの血液細胞数百万人のうち、稀な細胞集団である。これにより、CTCの純粋な集団を得ることは困難である。通常の循環で見られる細胞の異なるタイプのCTCの汚染が存在濃縮または枯渇の技術を使用して避けられない。本報告では、蛍光ラベル、循環前立腺癌細胞に固有の方法を説明し、自己組織化フローチャンバーシステムにおいて、電気部品との相互作用を研究する。この技術はさらに、前立腺のCTCおよび関心対象の任意のタンパク質間の相互作用を観察するために適用することができる。

図1に、マイクロスライド上のECの単分子層のO / N培養を示しています。 図1Aにスケーリングはマイクロスライドの100％が70％の10倍の対物レンズ（ 図1B）を使用して表示されている間に5 ​​倍の対物レンズを使用して表示されていることを示しています。 E-セレクチン介在性相互作用のため、エッジにローリング細胞は録画と再生の分析のためのマイクロスライドの70％以上を利用できるようにしたとは見なされません。我々の経験では、最初にこのセットアップアセンブリは、せん断応力下で培養するためにECの単層をいくつかの練習が必要です。マイクロスライド上でECの増殖を確立した後、我々は、前立腺癌細胞を標識MDA。 J591-488、抗PSMA抗体の特異性は、健康なドナーの血液にスパイクし、抗PSMA J591-488モノクローナル抗体を蛍光標識で標識しMDA細胞を用いて試験した。無PSMA免疫染色（データは示さず）PBMCにおいて観察されなかった。 J591-488結合および内部移行アルテという可能性を除外するために、RSは行動を転がり、我々は...

我々の報告は、生理的流れの条件下で、前立腺癌においてCTC / ECの相互作用を可視化し、分析するためのユニークな方法を記載する。

患者とヒト内皮細胞に由来する前立腺循環腫瘍細胞との間のE-セレクチン介在性の相互作用を観察するin vitro法での

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

本手順の全体的な目的は、マイクロスライドフローアセンブリを用いて、希少な前立腺がん細胞とE-selectinを発現する血管内皮細胞との相互作用を調べることです。まず、マイクロスライドをフィブロネクチンでコーティングします。次に、チャネル幅が狭いマイクロスライド上のダイナミックフローシステムにおいて、ヒト臍帯静脈内皮細胞（VE）を培養します。次に、前立腺がん細胞を抗前立腺特異的膜抗原（PSMA）ヒト化モノクローナル抗体で標識し、細胞内に取り込ませます。最終ステップとして、抗PSMA標識前立腺がん細胞をE-セレクチン発現VEに灌流させます。最終的に、ビデオ顕微鏡を用いて、前立腺がん細胞と内皮細胞との相互作用を観察します。並行平板フローチャンバーやその他の動的アセンブリなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、循環腫瘍細胞などの希少な前立腺癌細胞と、培養内皮細胞との相互作用を動的フローシステム内で検討できることです。この手法は、前立腺腫瘍細胞がどのように血管系を通じて転移するのか、あるいは白血球が遊走する際に用いるものと同じメカニズムを利用しているのかといった、転移の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな方は、組織培養フード内で灌流しながら狭いチャネルに血管内皮細胞の単層を培養させるため、困難に直面することがあります。まず、マイクロスライドをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄します。次に、1 mLルアーロックシリンジを用いて、50 µg/mLのフィブロネクチン200 µLでマイクロスライドを緩やかにコーティングします。マイクロスライドに蓋をして、組織培養フード内で30分間保持します。次に、200 µLの温めたqve増殖培地をマイクロスライドに灌流させ、室温で20分間インキュベートします。液体をマイクロスライドにゆっくりと分注することで、チャネル内での気泡形成を防ぎます。灌流の間、vexをPBSで洗浄し、0.1%コラゲナーゼおよび0.05%EDTAを含むPBSを加えて室温で1〜2分間放置することで、vex懸濁液を調製します。hveを2 mLの増殖培地とともに180 ×gで5分間遠心分離します。その後、ヘモサイトメーターを用いて細胞濃度を測定し、増殖培地100 µLあたり1,000万個の細胞を調製します。次に、マイクロスライドの入口から培地を慎重に除去します。200 µLのピペットチップを用い、マイクロスライドを目線の高さに合わせ、1 mLのルアーロックシリンジを使用して、調製した濃度のvex 200 µLをチャネル内に緩やかに注入します。このステップでは、気泡の形成を防ぐために注意が必要です。もし気泡が現れた場合は、気泡が出口チャネルに抜けるまで、少し時間をかけて注入し続けてください。次に、約80 µLのVE培地をマイクロスライドの入口と出口の両方に同量ずつピペットで分注します。これにより、どちらの方向にも細胞が流れるのを防ぎます。スライドにカバーをかけ、37 °Cのインキュベーター内で1.5時間保持します。フローチャンバーの組み立てを開始するために、滅菌済みの20 milliliterシリンジ、メスおよびオスのルアーコネクター、シリンジポンプ、およびチューブをインキュベーター内に15分間置き、デッドボリュームを最小限に抑えます。内径0.04 inchesのチューブを使用してください。チューブの径を小さくすることで、気泡の形成を防ぐことができます。次に、20 mLのシリンジに12 mLの加温したVE培地を満たします。シリンジ内の気泡を完全に除去してください。マイクロスライドの入口にVE培地を満たします。このアセンブリをマイクロスライドに接続します。アウトレットコネクタをマイクロスライドに慎重に取り付けます。セットアップをインキュベーターに入れ、シリンジポンプに接続します。次に、ポンプを10 µL/minのせん断速度に設定し、細胞を37 °Cのインキュベーター内で一晩培養します。翌日、マイクロスライドの入口に取り付けられたコネクターを取り外して装置を解体します。その後、血管内皮細胞におけるE-selectinの発現を上方制御するため、出口コネクターを取り外します。インターロイキン-1βを含む新鮮な増殖培地を調製します。10 mLシリンジで培地を吸引します。スライドの入口に残っている培地を除去し、新鮮な培地を入口がいっぱいになるまで加えます。シリンジをスライドに接続します。interleukin one betaを用いてvexをインキュベートしている間、シリンジポンプを10 µL/minのせん断速度に設定し、インキュベーター内で4時間保持します。次に、anti PSMA Alexa 488抗体で標識した前立腺がん細胞を準備します。まず、MDA前立腺がん細胞に0.05% trypsin EDTAを加え、1分間置きます。細胞表面に存在する糖ペプチドに影響を及ぼす可能性があるため、細胞を長時間トリプシンにさらさないでください。細胞を200×gで5分間遠心分離します。次に、MDA細胞ペレットを1mLのHank's Bufferに再懸濁し、抗PSMA抗体を加えて、暗所、室温で30分間インキュベートします。その際、インキュベーション中に細胞を再懸濁してください。30分後、細胞懸濁液を800 ×gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを1 mLのHank'sバッファーで再懸濁します。標識したMDA細胞をカウントし、最終濃度を100万 cells/mLに調整します。5 mLのシリンジにラベル済みのMDA細胞を満たし、気泡を取り除きます。倒立顕微鏡の電源を入れ、10倍対物レンズで照明を調整します。シリンジポンプを顕微鏡のサンプルステージと同じ高さに合わせ、せん断応力を1 dime/cm²に設定します。次に、Zeiss Axio visionソフトウェアを開きます。コンピュータ画面上で対物レンズを選択します。ソフトウェアのツールオプションで新しいフォルダを作成します。Axio visionのスマートエクスペリメントオプションを開き、32秒の短いビデオを30分間記録するように設定を調整します。ライブ蛍光ビデオの場合は、画像オプションを設定してください。これらのパラメータは、Zeiss MRMカメラを用いてビデオフレームレートに近い動画を取得し、10 x 対物レンズでフローチャネルの全幅をコンピュータ画面上で可視化するのに役立ちます。CMマウントアダプターを使用し、シリンジおよび細胞を含むコネクタをシリンジポンプに設置する前に、水銀ランプのスイッチをオンにします。次に、インターロイキン1βで刺激したaxを含むマイクロスライドの充填済みインレットチャネルにコネクタを取り付けます。アウトレットチャネルをチューブに取り付けられたコネクターに接続します。流出液を回収するため、チューブをディッシュまたは15 milliliterコニカルチューブに入れます。マイクロスライドへの注入を10 microliters per minuteで開始します。488 nmのフィルターを装着したエピ蛍光顕微鏡下で、内皮細胞と標識MDA細胞または患者由来の標識CTCとの相互作用を観察します。実験の様子を32本の短いビデオとして記録し始めてください。再生分析中に、ローリング速度を測定します。ローリング速度は、細胞が移動した距離を時間で除して算出します。ここでは、一晩培養した内皮細胞の単層を示しています。マイクロスライド上において。スケールにより、5倍の対物レンズではマイクロスライドの100%が見え、10倍の対物レンズでは70%が見えることが示されています。選択された媒介相互作用については、エッジ部分でローリングしている細胞は除外されており、これによりマイクロスライドの70%以上がビデオ録画および再生分析に利用可能となります。ボックスプロットは、異なるせん断応力条件下における、interleukin one beta刺激内皮細胞上のラベルなしMDA細胞およびanti PSMAラベルMDA細胞の両方のローリング速度の分布を示しています。1 dyn cm⁻²および5 dyn cm⁻²におけるローリング速度において、より高い剪断応力である10 dyn cm⁻²では有意な差は観察されませんでした。ラベルなしのMDA細胞とanti-PSMA標識MDA細胞のローリング速度の間には、統計的に有意な差が認められました。前立腺癌患者の血液を用いて撮影したタイムラプスビデオでは、標識された前立腺CTCとレクチン発現内皮細胞との間に3種類の相互作用が示されています。それは、CTCが付着と再付着を繰り返すテザリング、30秒後もCTCが脱離しなかった安定した接着、および非相互作用CTCが視野に入ってくる相互作用なしの3つの状態です。マイクロスライドは容易に免疫染色および蛍光イメージングが可能であり、anti-PSMA標識MDA細胞の強固な接着が確認されました。interleukin one betaで刺激した血管内皮細胞への灌流後がこちらで確認できます。このビデオを視聴することで、この手順に従って、循環前立腺腫瘍細胞のような希少細胞とS selectinを発現する血管内皮細胞との相互作用を調べる方法について十分に理解できるはずです。また、s selectinリガンドの存在など、追加の疑問を解決するために、免疫蛍光染色などの他の手法を行うことも可能です。このような手法を用いることで、研究者は転移に関与するさまざまな段階を理解することができます。

in-vitro-method-to-observe-e-selectin-mediated-interactions-between

Research

JoVE Journal

Medicine

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