患者とヒト内皮細胞に由来する前立腺循環腫瘍細胞との間のE-セレクチン介在性の相互作用を観察するin vitro法での

本手順の全体的な目的は、マイクロスライドフローアセンブリを用いて、希少な前立腺がん細胞とE-selectinを発現する血管内皮細胞との相互作用を調べることです。まず、マイクロスライドをフィブロネクチンでコーティングします。次に、チャネル幅が狭いマイクロスライド上のダイナミックフローシステムにおいて、ヒト臍帯静脈内皮細胞（VE）を培養します。

次に、前立腺がん細胞を抗前立腺特異的膜抗原（PSMA）ヒト化モノクローナル抗体で標識し、細胞内に取り込ませます。最終ステップとして、抗PSMA標識前立腺がん細胞をE-セレクチン発現VEに灌流させます。最終的に、ビデオ顕微鏡を用いて、前立腺がん細胞と内皮細胞との相互作用を観察します。

並行平板フローチャンバーやその他の動的アセンブリなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、循環腫瘍細胞などの希少な前立腺癌細胞と、培養内皮細胞との相互作用を動的フローシステム内で検討できることです。この手法は、前立腺腫瘍細胞がどのように血管系を通じて転移するのか、あるいは白血球が遊走する際に用いるものと同じメカニズムを利用しているのかといった、転移の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

一般的に、この手法に不慣れな方は、組織培養フード内で灌流しながら狭いチャネルに血管内皮細胞の単層を培養させるため、困難に直面することがあります。まず、マイクロスライドをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄します。次に、1 mLルアーロックシリンジを用いて、50 µg/mLのフィブロネクチン200 µLでマイクロスライドを緩やかにコーティングします。

マイクロスライドに蓋をして、組織培養フード内で30分間保持します。次に、200 µLの温めたqve増殖培地をマイクロスライドに灌流させ、室温で20分間インキュベートします。液体をマイクロスライドにゆっくりと分注することで、チャネル内での気泡形成を防ぎます。

灌流の間、vexをPBSで洗浄し、0.1%コラゲナーゼおよび0.05%EDTAを含むPBSを加えて室温で1〜2分間放置することで、vex懸濁液を調製します。hveを2 mLの増殖培地とともに180 ×gで5分間遠心分離します。その後、ヘモサイトメーターを用いて細胞濃度を測定し、増殖培地100 µLあたり1,000万個の細胞を調製します。

次に、マイクロスライドの入口から培地を慎重に除去します。200 µLのピペットチップを用い、マイクロスライドを目線の高さに合わせ、1 mLのルアーロックシリンジを使用して、調製した濃度のvex 200 µLをチャネル内に緩やかに注入します。このステップでは、気泡の形成を防ぐために注意が必要です。もし気泡が現れた場合は、気泡が出口チャネルに抜けるまで、少し時間をかけて注入し続けてください。

次に、約80 µLのVE培地をマイクロスライドの入口と出口の両方に同量ずつピペットで分注します。これにより、どちらの方向にも細胞が流れるのを防ぎます。スライドにカバーをかけ、37 °Cのインキュベーター内で1.5時間保持します。

フローチャンバーの組み立てを開始するために、滅菌済みの20 milliliterシリンジ、メスおよびオスのルアーコネクター、シリンジポンプ、およびチューブをインキュベーター内に15分間置き、デッドボリュームを最小限に抑えます。内径0.04 inchesのチューブを使用してください。チューブの径を小さくすることで、気泡の形成を防ぐことができます。

次に、20 mLのシリンジに12 mLの加温したVE培地を満たします。シリンジ内の気泡を完全に除去してください。マイクロスライドの入口にVE培地を満たします。

このアセンブリをマイクロスライドに接続します。アウトレットコネクタをマイクロスライドに慎重に取り付けます。セットアップをインキュベーターに入れ、シリンジポンプに接続します。

次に、ポンプを10 µL/minのせん断速度に設定し、細胞を37 °Cのインキュベーター内で一晩培養します。翌日、マイクロスライドの入口に取り付けられたコネクターを取り外して装置を解体します。その後、血管内皮細胞におけるE-selectinの発現を上方制御するため、出口コネクターを取り外します。

インターロイキン-1βを含む新鮮な増殖培地を調製します。10 mLシリンジで培地を吸引します。スライドの入口に残っている培地を除去し、新鮮な培地を入口がいっぱいになるまで加えます。

シリンジをスライドに接続します。interleukin one betaを用いてvexをインキュベートしている間、シリンジポンプを10 µL/minのせん断速度に設定し、インキュベーター内で4時間保持します。次に、anti PSMA Alexa 488抗体で標識した前立腺がん細胞を準備します。まず、MDA前立腺がん細胞に0.05% trypsin EDTAを加え、1分間置きます。

細胞表面に存在する糖ペプチドに影響を及ぼす可能性があるため、細胞を長時間トリプシンにさらさないでください。細胞を200×gで5分間遠心分離します。次に、MDA細胞ペレットを1mLのHank's Bufferに再懸濁し、抗PSMA抗体を加えて、暗所、室温で30分間インキュベートします。その際、インキュベーション中に細胞を再懸濁してください。

30分後、細胞懸濁液を800 ×gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを1 mLのHank'sバッファーで再懸濁します。標識したMDA細胞をカウントし、最終濃度を100万 cells/mLに調整します。

5 mLのシリンジにラベル済みのMDA細胞を満たし、気泡を取り除きます。倒立顕微鏡の電源を入れ、10倍対物レンズで照明を調整します。シリンジポンプを顕微鏡のサンプルステージと同じ高さに合わせ、せん断応力を1 dime/cm²に設定します。

次に、Zeiss Axio visionソフトウェアを開きます。コンピュータ画面上で対物レンズを選択します。ソフトウェアのツールオプションで新しいフォルダを作成します。

Axio visionのスマートエクスペリメントオプションを開き、32秒の短いビデオを30分間記録するように設定を調整します。ライブ蛍光ビデオの場合は、画像オプションを設定してください。これらのパラメータは、Zeiss MRMカメラを用いてビデオフレームレートに近い動画を取得し、10 x 対物レンズでフローチャネルの全幅をコンピュータ画面上で可視化するのに役立ちます。CMマウントアダプターを使用し、シリンジおよび細胞を含むコネクタをシリンジポンプに設置する前に、水銀ランプのスイッチをオンにします。次に、インターロイキン1βで刺激したaxを含むマイクロスライドの充填済みインレットチャネルにコネクタを取り付けます。

アウトレットチャネルをチューブに取り付けられたコネクターに接続します。流出液を回収するため、チューブをディッシュまたは15 milliliterコニカルチューブに入れます。マイクロスライドへの注入を10 microliters per minuteで開始します。

488 nmのフィルターを装着したエピ蛍光顕微鏡下で、内皮細胞と標識MDA細胞または患者由来の標識CTCとの相互作用を観察します。実験の様子を32本の短いビデオとして記録し始めてください。

再生分析中に、ローリング速度を測定します。ローリング速度は、細胞が移動した距離を時間で除して算出します。ここでは、一晩培養した内皮細胞の単層を示しています。

マイクロスライド上において。スケールにより、5倍の対物レンズではマイクロスライドの100%が見え、10倍の対物レンズでは70%が見えることが示されています。選択された媒介相互作用については、エッジ部分でローリングしている細胞は除外されており、これによりマイクロスライドの70%以上がビデオ録画および再生分析に利用可能となります。ボックスプロットは、異なるせん断応力条件下における、interleukin one beta刺激内皮細胞上のラベルなしMDA細胞およびanti PSMAラベルMDA細胞の両方のローリング速度の分布を示しています。

1 dyn cm⁻²および5 dyn cm⁻²におけるローリング速度において、より高い剪断応力である10 dyn cm⁻²では有意な差は観察されませんでした。ラベルなしのMDA細胞とanti-PSMA標識MDA細胞のローリング速度の間には、統計的に有意な差が認められました。前立腺癌患者の血液を用いて撮影したタイムラプスビデオでは、標識された前立腺CTCとレクチン発現内皮細胞との間に3種類の相互作用が示されています。それは、CTCが付着と再付着を繰り返すテザリング、30秒後もCTCが脱離しなかった安定した接着、および非相互作用CTCが視野に入ってくる相互作用なしの3つの状態です。マイクロスライドは容易に免疫染色および蛍光イメージングが可能であり、anti-PSMA標識MDA細胞の強固な接着が確認されました。

interleukin one betaで刺激した血管内皮細胞への灌流後がこちらで確認できます。このビデオを視聴することで、この手順に従って、循環前立腺腫瘍細胞のような希少細胞とS selectinを発現する血管内皮細胞との相互作用を調べる方法について十分に理解できるはずです。また、s selectinリガンドの存在など、追加の疑問を解決するために、免疫蛍光染色などの他の手法を行うことも可能です。

このような手法を用いることで、研究者は転移に関与するさまざまな段階を理解することができます。