患者とヒト内皮細胞に由来する前立腺循環腫瘍細胞との間のE-セレクチン介在性の相互作用を観察するin vitro法での

我々の報告は、生理的流れの条件下で、前立腺癌においてCTC / ECの相互作用を可視化し、分析するためのユニークな方法を記載する。

この手順の全体的な目標は、マイクロスライドフローアセンブリを使用して、まれな前立腺がん細胞とeセレクチン発現内皮細胞との間の相互作用を調べることです。これは、最初にマイクロスライドにフィブロネクチンをコーティングすることによって達成されます。2番目のステップは、チャネル幅の小さいマイクロスライド上の動的フローシステムでヒト臍帯静脈内皮細胞またはVEを培養することです。

次に、前立腺がん細胞を抗前立腺特異的膜抗原またはPSMAヒト化モノクローナル抗体で標識し、これが内在化されます。最後のステップは、抗PSMA標識前立腺癌細胞をeセレクチン発現ve上に灌流することです。最終的に、ビデオ顕微鏡法を使用して、前立腺がん細胞と内皮細胞との間の相互作用を示します。

この手法は、パラレルプレートフローチャンバーやその他のダイナミックアッセンブリーなどの既存の方法と比較した場合の主な利点として、循環腫瘍細胞などの希少な前立腺がん細胞と培養内皮細胞との間の相互作用をダイナミックフローシステムで調べることができる点です。この方法は、前立腺腫瘍細胞がどのようにして血液血管系を介して転移するのかなど、転移の分野における重要な質問に答えるのに役立ちますか?それらは、白血球がその化中に使用するのと同じメカニズムを使用していますか?

一般に、この技術に不慣れな個人は、組織培養フードの下の灌流下の狭いチャネルで内皮細胞の単層を培養することが含まれるため、苦労します。まず、マイクロスライドをリン酸緩衝生理食塩水またはPBSですすいでください。次に、1ミリリットルのルアーロックシリンジを使用して、1ミリリットルあたり50マイクログラムのフィブロネクチンを200マイクロリットルでマイクロスライドに優しくコーティングします。

マイクロスライドを蓋で覆い、組織培養フード内に30分間保管します。次に、200マイクロリットルの温かいqve増殖培地をマイクロスライド上に灌流し、室温で20分間インキュベートします。マイクロスライド内の液体をゆっくりと分注することで、チャネル内の気泡の形成を防ぎます。

灌流中に、ベックスをPBSですすぎ、0.1%コラゲナーゼと0.05%EDTAをPBSに室温で1〜2分間追加して、ベックス懸濁液を準備します。2ミリリットルの増殖培地をGの180倍で5分間遠心分離します。次に、ヘモサイトメーターを使用して細胞濃度を測定し、成長培地100マイクロリットルあたり1,000万個の細胞を調製します。

次に、マイクロスライドの入口から培地を慎重に取り出します。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、マイクロスライドを目の高さに持っていき、1ミリリットルのルアーロックシリンジを使用して、準備された濃度のベックスの200マイクロリットルをチャネルに優しくパフします。このステップでは、気泡の形成を防ぐために注意が必要です 気泡が現れた場合は、気泡が出口チャネルに入るまで少し長い時間灌流し続けます。

次に、等量の約80マイクロリットルのVE培地をマイクロスライドの入口と出口の両方にピペットで移します。これにより、セルがどちらの方向にも流れなくなります。スライドを覆い、摂氏37度のインキュベーターに1.5時間保管します。

フローチャンバーの組み立てを開始するには、滅菌済みの20ミリリットルシリンジ、メスとオスのルアーコネクター、シリンジポンプ、チューブをインキュベーターに15分間配置して、デッドボリュームを最小限に抑えます。内径0.04インチのチューブを使用。チューブの直径を小さくすると、気泡の発生を防ぎます。

次に、20ミリリットルのシリンジに12ミリリットルの温かいVE培地を入れます。シリンジから気泡を完全に取り除きます。マイクロスライドの入口にVEメディウムを充填します。

このアセンブリをマイクロスライドに接続します。コンセントコネクタをマイクロスライドにそっと取り付けます。セットアップをインキュベーターに持ち込み、シリンジポンプに接続します。

次に、ポンプを毎分10マイクロリットルのせん断速度に設定してから、細胞を摂氏37度のインキュベーターに一晩放置します。翌日、マイクロスライドのインレットに取り付けられたコネクタを取り外して、セットアップを分解します。次に、アウトレットコネクタ2を取り外して、内皮細胞上のeセレクチン発現をアップレギュレートします。

インターロイキン1ベータを含む新鮮な増殖培地を調製します。10ミリリットルのシリンジで培地を吸引します。スライドの入口から残った培地を取り除き、次に入口を完全に満たす新鮮な培地を追加します。

シリンジをスライドに接続します。シリンジポンプを毎分10マイクロリットルのせん断速度でインキュベーターで4時間セットし、インターロイキン1ベータのベックスインキュベーション中に、抗PSMAアレクサ4 88抗体標識前立腺癌細胞を調製します。まず、0.05%トリプシンEDTAをMDA前立腺癌細胞に1分間追加します。

トリプシンは細胞表面に存在する糖ペプチドに影響を与える可能性があるため、細胞をトリプシンに長時間さらさないでください。細胞をGの200倍で5分間遠心分離します。次に、MDA細胞口蓋を1ミリリットルのHank's Bufferに再懸濁し、抗PSMA抗体を室温で30分間暗所でインキュベートし、インキュベーション中に細胞を懸濁させます。

30分後、細胞溶液をGの800倍で5分間遠心分離します。ペレットを吸引し、1ミリリットルのハンク緩衝液に再懸濁します。標識されたMDA細胞をカウントし、最終濃度を1ミリリットルあたり100万細胞にします。

5ミリリットルのシリンジに標識されたMDA細胞を充填し、気泡を取り除きます。倒立顕微鏡の電源を入れ、カーラーの照度を対物レンズの10倍に設定します。シリンジポンプを顕微鏡のサンプルステージと同じレベルに持ってきて、1 dime per cm 四方のせん断応力に設定します。

次に、Zeiss Axioビジョンソフトウェアを開きます。コンピューター画面で目標を選択します。ソフトウェアのツールオプションの下に新しいフォルダを作成します。

Axio visionでスマート実験オプションを開き、32番目の短いビデオを30分間録画するように設定を調整します 蛍光ライブビデオの場合は、画像オプションを設定します。これらのパラメータは、Zeiss MRMカメラを使用してビデオフレームレートに近いビデオを実現するのに役立ち、コンピュータ画面上の10倍対物レンズで流路の全幅を視覚化し、シリンジと細胞を含むコネクタをシリンジポンプに配置する前に、水銀ランプのCMマウントアダプタースイッチを使用します。次に、インターロイキン1ベータ刺激軸を含むマイクロスライドの充填インレットチャネルにコネクタを取り付けます。

チューブに取り付けられたコネクタでアウトレットチャネルを接続します。チューブを皿または15ミリリットルの円錐形チューブに入れて、流れを収集します。マイクロスライドから毎分10マイクロリットルで注入を開始します。

内皮細胞と、488ナノメートル未満の患者に由来する標識MDA細胞または標識CTCとの間の相互作用を観察します。エピ蛍光顕微鏡でフィルターを掛けます。実験を 32 番目の短いビデオとして録画を開始します。

再生解析中に、ローリング速度を測定します。ローリング速度は、セルが移動した距離を経時的に割ることによって測定されます。ここに示されているのは、内皮細胞の単層の一晩培養です。

マイクロスライド上。スケーリングは、マイクロスライドの100%が5倍対物レンズを使用して見えるのに対し、70%は選択された媒介インタラクションに対して10倍対物レンズを使用して見えることを示しています。エッジで転がる細胞は考慮されないため、マイクロスライドの70%以上がビデオ録画および再生分析に利用可能になります。箱ひげ図は、さまざまなせん断応力条件でインターロイキン1ベータ刺激内皮細胞上の非標識MDA細胞と抗PSMA標識の両方の転動速度の分布を示しています。

10ダイム/センチメートル四方の高せん断応力では、10ダイム四方と5ダイセンチメートル四方の転がり速度に有意差は観察されませんでした。非標識PSMA細胞と抗PSMA標識MDA細胞のローリング速度との間に統計的に有意な差が観察されました。前立腺癌患者からの血液を使用して撮影された時間スティッチングビデオは、標識された前立腺CTCとレクチン発現内皮細胞との間の3種類の相互作用を示しています。CTCが付着する場所と再接着する安定した接着、CTCが30秒後も剥離せず、非相互作用するCTCが視野に入るため相互作用はありません。マイクロスライドは、免疫染色が容易で、抗PSMA細胞の固着を蛍光的に画像化することができ、標識されたMDA細胞です。

インターロイキンを介した増殖後、1つのベータ刺激内皮細胞がここで見ることができます。このビデオを見た後、この手順に従って、循環前立腺腫瘍細胞などの希少細胞とSセレクチン発現内皮細胞との間の相互作用を調べる方法について十分に理解できるはずです。免疫蛍光などの他の方法も、sセレクチンの存在などの追加の疑問に答えるために実施することができる。配 位 子。

このような手法は、研究者が転移に関与するさまざまなステップを理解するのに役立ちます。