Name: 大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶ 大人のゼブラフィッシュ腎臓におけるネフロン構成と機能の解析方法。蛍光標識デキストリン注入、組織染色、免疫蛍光顕微鏡技術を用いて腎臓解剖と再吸収機能を評価し、腎臓再生医療や疾患研究に貢献します。

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この作品は、以下の中からRAWに資金によってサポートされていました：国立衛生研究所は、K01 DK083512、DP2 OD008470、およびR01 DK100237を付与します。ダイムバジルオコナースターター学者グラント賞＃5-FY12-75 3月;科学と生物科学専攻のノートルダム大学の大学から資金を起動する。そしてギャラガー家族に代わってエリザベスとマイケル·ギャラガーからノートルダム大学の寛大な贈り物は、幹細胞研究促進するため。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割がありませんでした。私たちは、ゼブラフィッシュのコロニーのケアと福祉での傑出した献身ために彼らのサポートのために生物科学科のスタッフに感謝し、ノートルダム寺院でのゼブラフィッシュ研究センター。最後に、この作品についての彼らのコメント、議論や洞察力のための私達の研究室のメンバーに感謝。

著者らは、開示することは何もない。

ここでは、成体ゼブラフィッシュにおけるネフロンセグメントのコンポーネントの視覚化を可能にする方法を記載している。蛍光デキストラン複合体の注入は、これらの近位尿細管細胞30,38のエンドサイトーシスの性質により優遇されたPCTラベリングを可能にします。この方法は、異なる蛍光複合体の群れを得ることができるデキストランの存在に非常に柔軟に行うことができる。二次標識手順が必要とされないように加えて、リジン固定可能なデキストランの使用は、PCTセグメントを標識するための特に便利な方法です。これは、比較的簡単な信号検出を可能にし、多くの他の蛍光標識、免疫標識、およびトランスジェニックレポーター株の使用と互換性がある。アルカリホスファターゼ標識はまた、PCTにおいて強い反応性とPSTでわずかに弱い反応性、近位尿細管をマークします。最後に、DBA染色はCHを表示遠位尿細管セグメントのラベル付けを可能にしますaracteristicは形態を分岐した。非免疫由来の糖結合タンパク質である、さまざまなレクチン分子は、哺乳動物のネフロンセグメント47を区別するために広く使用されてきた。それはそれは、哺乳動物の腎臓47に集合管をマークするために利用されるようにゼブラフィッシュにおけるDBAは、遠位尿細管セグメントと相関していることは興味深い。 まとめると、これらの方法は、腎組成および機能を文書化するためにさまざまな組み合わせで利用することができる。これらの方法の全ては、全体の腎臓調製物において使用することができるので、それらは完全に多くの時間がかかり、面倒な方法、 例えば、凍結切片作業と免疫標識の使用に頼ることなく、臓器全体ネフロンの構造と機能を評価するためのツールを提供する。しかし、この方法の資料に記載の汚れは凍結切片で生存可能である。凍結切片の分析は、特定のpeptiを検出するための免疫組織化学のために適しています（ホールマウントと比較して）サンプルを生成DESは、もちろんかかわらずこの種の分析は、適切な一次抗体の利用可能性を必要とします。残念ながら、ゼブラフィッシュ、動物モデルでの作業中の一つの主要な制限は、抗体の貧しい可用性残る。したがってWISHは、遺伝子発現の解析のための最も広く使用されている、 すなわち、「ゴーに、「手続きのまま。紫や赤の沈殿物を生成するためにBCIP、NBT、および/またはINT基質反応を用いてWISHは、凍結切片上の蛍光染色と互換性がありません。一つの選択肢は、蛍光WISH検出、ゼブラフィッシュの胚のサンプル用に最適化されており、成人の腎臓での使用のために調整することができた手順の使用を呼び出すことであろう。このビデオ記事の方法の説明は、個別のセグメントは、eGFPのかmCherryをレポーターで標識されたトランスジェニックゼブラフィッシュ系統との組み合わせで蛍光WISHのような技術とのさらなる実験のために許可する必要があります。代わりに、これらの方法は、ここでクーロンを説明したその他の重要な染料、 例えば、他のレクチンと組み合わせて試験することがdは。したがって、ここに記載した方法の更なる適応と膨張が全体マウント腎臓調製および分析のための研究者のニーズに合うように呼び出すことができる。 このように、これらの方法は、進行中の再生の研究のためのゼブラフィッシュモデルと実装のための、また、遺伝病のモデル化において幅広い可能性を秘めている。腎臓の苦痛のための革新的な研究や治療の差し迫った必要性がある。何百万人もの人が、先天性の急性および/または慢性の原因から生じ、毎年腎臓病のいくつかのフォームに苦しんでいます。さらに、腎臓病の有病率は、これらの疾患のグローバルな公衆衛生上の問題14,15を作り、世界的に上昇し続ける。外部透析機械が自分の腎臓がこの役割を実行できない場合には、代謝廃棄物の患者の血液を取り除くのに役立つことにより、血液透析などの治療法が利用可能である。残念ながら継続的な治療が生存のために必要であるとして、この介入は、制限があります。また、患者は、最終的には、患者がキャンセル待ちに置かれると受け取るように年を取ることができる腎臓移植を必要とします。でも、腎臓移植を取得した後、多くの患者は、手順の結果として悪影響を受けると自分たちの生活の残りのためにこれらの効果を戦う必要があります。これらの困難は、腎疾患を予防またはおそらく組織再生8,16,52,53を強化するのに役立つどちら小説治療法の開発のための重大な必要性を実証している。生物医学研究室で人間の被験者の使用の明白な倫理的な限界を考えると、動物モデルは、ヒト疾患の病因の研究のため、新たな治療法のテストのために不可欠である。その解剖学的類似性および進化の近接の結果、マウスは、ヒト疾患45の最も広く使用されているモデルとなっている。しかし、この動物との一定の制限がはこちらより、あるインビボでの大規模遺伝子スクリーニングを完了することの実用性器官の発達を可視化するることができない。ゼブラフィッシュは、ヒト疾患45,46の臓器の開発とモデリングの研究のための関連性の高い有益なモデル生物である。ヒトの疾患に関しては、ゼブラフィッシュにおける機能ホモログは、ヒトの全遺伝子54,55のほぼ70％のために存在する。 最近の研究は、腎臓の研究31,37,56の多くの分野のためのゼブラフィッシュの有用性を強調している。 AKI後のゼブラフィッシュにおける再生及び修復の研究は、尿細管上皮再生とneonephrogenesisが発生し、30,37時間経過再生を通じて重複する2つのプロセスがあることを示唆している。ゲンタマイシンと呼ばれるアミノグリコシド系抗生物質の使用は、成人のゼブラフィッシュ29,30,37にAKIの成果を研究するためのそれを通して怪我パラダイムとして利用されている。ゲンタマイシン、近位tubulから損傷後約2週間にわたりエス再生成し、その間に新しいネフロンは、臓器29,30,37を通じて形成される。一般的には、上皮再生を制御するメカニズムは非常に議論の余地が残されている。修復プロセスの1提案されたメカニズムでは、内腔への死細胞の脱落に続いて、最初の急性損傷のイベントがあります。次に、新しい細胞が分化し、その後脱分化、増殖、および移行一連のイベント、負傷した基底膜を再増殖し、損傷部位に機能を回復さがある。あるいは、他の研究は、置換細胞はネフロンの尿細管内に存在する幹細胞/前駆細胞から生じることを示唆している。ゼブラフィッシュにおいてneonephrogenesisのプロセスに関しては、細胞凝集体は、ゲンタマイシン注射29,30によって次AKIが観察されている。これらの凝集体は後に既存の細管29,30に配管し、新しいネフロンに成熟する。ネフロン上皮再生とneonephrを結びつける共通のスレッドogenesisは、全くの謎因子である：現時点では、これらの回生偉業が利用可能な洞察があるよりも、発生する方法については、指数関数的に多くの質問があります。 現在までに、しかし、証拠のいくつかのエキサイティングなラインがゼブラフィッシュを用いた腎再生研究は確かに、直接、翻訳可能性56-58を有することができる人間のAKIに関連する比較洞察を提供できるという考えを支持している。化学スクリーニングは、最近、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤メチル-4-（フェニルチオ） -ブタノエート（m4PTB）56,57が同定されたゼブラフィッシュ胚における腎前駆細胞の増殖を増加させる小分子を同定する。ゲンタマイシン誘発のAKIとゼブラフィッシュの幼虫にこの化合物の投与は、幼虫の生存率が増加し、その尿細管増殖は56,58を向上したことを明らかにした。適度な虚血誘導AKIとマウスをm4PTBで処理した場合、その回復が連想で加速された尿細管細胞58の増殖の両方尿細管萎縮および細胞周期停止の減少にiation。これらの知見は、正常なゼブラフィッシュ腎臓の発生および/ ​​またはAKI回生応答を担う経路は、哺乳類56で保存されることを示唆している。 このように、さらなる研究が関与しているシグナル伝達経路を特定し、それらの相互作用、ゼブラフィッシュは、腎臓フィールドに、この重要な目標を追求するために、1つの有望な手段を提供して理解することが回生すなわちのメカニズムを離れていじめるために必要とされている。このようなプロトコルに記載ネフロンセルのラベルなどのツールは、AKIモデルにおいて腎組成および機能性を評価するために利用することができるアッセイの1つのグループを表す。さらに、それらは、腎臓病のトランスジェニックモデルを特徴付けるために適用することができ、腎ダム後のネフロン構造の修復を促進することができる化学治療薬を同定する方法を提供することができる時代。

腎臓は、体内の生理機能の多くを満たす複雑な器官である。腎臓の最も重要な機能は、代謝老廃排泄され、このタスクは密接流体恒常性の維持と絡み合っている。付随的に、血圧、電解質レベル、および酸塩基平衡を調節しながら腎臓は、血液を濾過し、尿を形成することにより、これらのジョブを実行する。ネフロンと呼ばれる高度に専門化上皮尿細管は、腎臓1,2の基本的な機能単位として機能する。大人の脊椎動物では、ネフロンは、一般的にこのように多くの細管がかなり小さな器官にパックするためにできるように、集中排水システムを取り巻くしっかりとコイル状の配置で構成されています。例えば、それぞれの人間の腎臓は100万人以上のネフロン3を含むことができます。マウスのような他の哺乳動物は、腎臓4あたり8から10000ネフロンのオーダーで保有する。腎臓の複雑度は、これらの哺乳動物および他のヴェールの間で異なる総ネフロン数と腎臓内でのそれらの建築レイアウトの変動によるebrates。脊椎動物種は開発中に最大3つの連続した​​腎臓構造を形成し、ネフロン養老や配置に関して複雑さを増す各フォームが表示されます。前腎、中腎、および後腎。保持される最後の腎構造は、成人の腎臓臓器通常、中腎または後腎2として機能する。各腎臓の形態は、しかしながら、ネフロン系組成物2を有する。 ネフロンは腎臓の主力であり、代謝物分泌および再吸収と一緒に血液濾過を担当しています。ネフロンは、上皮細胞で構成される単純な管状構造であり、分化した上皮の離散、専門性の高いドメインは、特定のタスクを実行する分節組織を持っている。ネフロンを通してろ液の流れのために、典型的には、3つの主要な部分はcomprisことがある電子各ユニット：（1）腎小体、近位、中間、および遠位セグメントを有する、（2）尿細管、および（3）集合管1。近位尿細管は、有機溶質、最も顕著なグルコースおよびアミノ酸1の再吸収を担当しています。中間細管（またはヘンレのループ）塩と水の調節1の主要部位である。最後に、塩および他のイオンの微調整は、遠位尿細管および集合管で発生し、高度内分泌系1によって調節される。そこから、ろ液は、最終的には廃棄物1としての体を出て、尿管、膀胱を通って移動する。 腎機能の喪失は、正常なネフロンの活動を妨げる原因の多数に由来することができます。これらの原因は腎臓の発生、ネフロン5の奇形を引き起こすなど、先天性欠損、または損傷の異なるタイプからの原因（遺伝的およびenvironme両方に起因する時に発生する可能性がありますNTAL起源）。後天性の傷害は、大きく、急性腎臓損傷（AKI）または慢性腎障害（CKD）に分類される。 AKIは、多くの場合、虚血または毒素曝露6,7起因する腎機能の突然の喪失を伴う。哺乳類では、ネフロン上皮修復は、このような怪我8後に可能となり、多くの人が、AKI後の腎機能の完全な回復を示す。 70％の入射範囲6,7 -しかし、AKIも広い30全体に報告されており、高い罹患率と死亡率に関連付けられています。 CKDは、対照的に、典型的には、線維症8,9に関連付けられた、延長された損傷の年に起因する腎機能の進行性の喪失と関連している。どちらか一方が他方10-12に個人を素因となることができますように。また、相互作用は、AKIとCKDの間に存在する。例えば、AKIに苦しんでいる人たちは、CKDや死13の影響を受けやすくなります。腎臓病の発生率は、米国および全世界の両方、epideに達しているマイクプロポーションとは高齢者人口は、腎臓14,15のための再生医療介入を識別するためのニーズがあると、このように拡張するように上昇すると予測される。 AKI患者が回復できるという知識にもかかわらず、それは長い間、腎臓が先天的回生の力のない臓器であると考えられてきた。この伝統的なビューには、劇的に近年16年に改定されました。 AKI後のマウスとラットで腎障害を調査する研究はネフロン細管上皮細胞が増殖し、機能的ネフロン17-20を再構築することができることを示している。哺乳類はネフロンを再生成するには、この適応能力を有しているが、腎線維症とCKD 21につながるトリガすることができます注目すべき制限及び不適応応答があります。例えば、最近の研究では、マウスネフロンにおける繰り返さ上皮細胞の切除が減少再生に関連していたことが実証され、腎線維化を示唆しているネフロンは場海EA限られた回生しきい値22。大人の哺乳類の腎臓は、紛失または破損したものを置き換えるために新しいネフロンを構成するので、それらの破壊が恒久的なネフロン赤字8,9につながるという証拠はない。興味深いことに、いくつかの脊椎動物はネフロン上皮を再生することにより、また、新しいネフロン、neonephrogenesisまたはネフロン新生23と呼ばれるプロセスを生成することによって、AKIに反応しません。 Neonephrogenesisは毒素曝露または部分切除後に魚に発生し、損傷モデルは、歴史的に金魚24,25、ティラピア26、スケート27、メダカ28、およびより最近では、ゼブラフィッシュ29,30が含まれている。これらのうち、ゼブラフィッシュは、腎再生のための責任を細胞および分子経路を発見するために実行可能な遺伝子研究のモデルを提供する。 このビデオの記事では、成人のゼブラフィッシュではネフロンセグメントにラベルを付ける方法を示します。ネフロン解剖学、分子的特徴に関する知識、そして機能的特徴は、ゼブラフィッシュを用いて、将来の成功腎研究のために不可欠です。大人のゼブラフィッシュの腎臓は中腎構造であり、大人の哺乳類、鳥類、爬虫類31で見つかった後腎構造よりネフロン数と組織の観点から本質的にあまり複雑である。しかし、ゼブラフィッシュネフロンセグメント組織は、哺乳類に類似しており、最初の遺伝子発現研究31-35に基づいて胎児腎臓で文書化されました。ゼブラフィッシュ胚ネフロンは、近位尿細管（PCT）、近位尿細管ストレート（PST）、（DE）遠位早く、および遠位後期（DL）31-35（ 図1）を含むリニア細管セグメントを含む。ゼブラフィッシュ成体のネフロンは、同様の管状のセグメント30,31,36,37（ 図1）を有する。 PCTは、機能表現型によって識別できます。PCTにおける上皮細胞は（サイズは10〜70 kDa）の蛍光標識されたデキストラン化合物を組み込む予定に存在胚および成体ゼブラフィッシュの腎臓の両方で使用されてきた循環は、これらの近位尿細管細胞38-41（ 図1）によるエンドサイトーシス取り込みを評価した。ゼブラフィッシュと哺乳類の間ネフロンセグメントにおける1つの違いは、ゼブラフィッシュが中間尿細管、ヘンレまたは30-37のループを欠いているということです。哺乳類におけるこのセグメントの機能は、水を節約するために、ゼブラフィッシュは、その尿を濃縮するための緊急性のない淡水種であるので、ゼブラフィッシュは、このセグメント32,33を欠いていることは驚くべきことではない。このように、全体的なネフロン組成物は、主にゼブラフィッシュと哺乳類の腎臓32,33の間で保存されている。これらの類似性は、発生腎形成32-35,42時の腎発現遺伝子の機能を調査することにより、することができ、人間の条件のかなりのリストに追加して、非常に多くの腎疾患43,44をモデル化するための有効な研究ツールであることがゼブラフィッシュを有効にしている使用して調査ゼブラフィッシュ45,46。 今日では、成人のゼブラフィッシュの腎臓は、その遺伝的取り扱いやすさと、この種における遺伝子機能及びシグナル伝達経路を調べるために利用可能な技術リソースの拡大を口蓋に腎再生の比較研究のための魅力的なモデルです。いくつかの研究は、AKI 29,30,37後の再生のメカニズムを調査するためにゼブラフィッシュ中腎を使用している。大人のゼブラフィッシュの腎臓を使って継続的なAKIの研究のためには、ネフロンの機能を調査するために、異なるネフロン領域や方法を標識する絶妙なメソッドを持つことが不可欠である。成人腎臓分析のためのいくつかの方法が胚腎臓プロトコルから適応されている。大人のゼブラフィッシュにおける蛍光標識されたデキストランの腹腔内注射は、ゼブラフィッシュ胚38-41（ 図1）のように、エンドサイトーシス30を介して中腎ネフロンにおけるPCT上皮にラベルを付けます。この方法は、visualizするために使用されている近位尿細管が復元生理的機能の一つ評価30（ 図1）を可能AKI、次の彼らの再吸収財産を取り戻すメール。ネフロンの近位尿細管のもう一つの特徴は、このセグメントの上皮細胞は、内因性アルカリホスファターゼ活性の高いレベルを示す刷子縁37を有することである。このように、近位上皮はELF-（酵素標識蛍光）として知られている蛍光ベースの技術-97 47を使用して、大人のゼブラフィッシュの腎臓で視覚的に定位させることができる。 ここでは、近位尿細管の機能評価を取得し、この細管セグメントのサイズと輪郭をマッピングするように、成人のゼブラフィッシュの腎臓中の蛍光デキストラン取り込みアッセイを30,48の実行方法について説明します。次に、蛍光標識アルカリホスファターゼで大人のネフロンの近位尿細管領域を標識するためのテクニックを説明します。第三に、私たちはそのrhod初めて示して哺乳類の腎臓49集合管の一般的なマーカーとして使用されてきたアミンタグ付きレクチンドリコスbiflorus凝集素（DBA）は、成人のゼブラフィッシュの腎臓の遠位尿細管をマーク。 DBAは、アルカリホスファターゼ染色に相互に排他的であるように、これらのラベルは、広く大人のゼブラフィッシュネフロンのパン - 遠位ストレッチに対する汎近位を区別する方法を提供します。ホールマウントクライオスタット組織切片の両方でこれらの蛍光染色剤の実装を通じて、私たちは一意にネフロンセグメントを識別し、溶質輸送体遺伝子の発現ドメインとこれらのラベルを関連付ける。したがって、このプロトコルはまた、当社の胚WISHプロトコル50に基づいて、in situハイブリダイゼーション （WISH）分析における成体組織全体のマウントのための修正された組織処理手順のガイドが含まれています。これらの手順は、O、形態学的および機能的属性を文書化するためにさまざまな組み合わせ（ 図2）において使用することができるfは大人のゼブラフィッシュの腎臓ネフロン。したがって、これらのプロトコルは、再生の研究、他の腎疾患モデルの表現型の特徴に適用することができ、さらには成人腎臓の形成を研究するために使用される。

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td></td><td></td><td>10 X PBSを蒸留水で希釈して作られます。</td></tr><tr><td>1X PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Tween-20 洗剤を 1 X PBS に</td></tr>。<tr><td>1X PBSと0.05%Tween0.05</td><td></td><td></td><td>%Tween-20洗剤を1 X PBSに入れます。</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) を 1 X PBS に溶解し、ドラフト内のホットプレートで沸騰させます。アリコートを冷やして冷凍庫に保管し、-20°Cで冷凍します。使用直前に解凍し、ストックを再冷凍しないでください。&nbsp;</td></tr><tr><td>ファインフォーセプス</td><td>ロボズ</td><td>RS-1050</td><td>デュモン ピンセット パターン #55&nbsp;</td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4445</td><td>ホワイトフロスト&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>モデリングクレイ</td><td>ハズブロ</td><td>プレイドー</td><td>他のモデリングクレイは、同様に交換することができ、同様に働くことができます</td></tr><tr><td>スライドホルダー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12-587</td><td>オプション:スライドフラットを格納するための段ボールトレイ</td></tr><tr><td>漂白ソリューション</td><td></td><td></td><td>漂白剤混合式(20 ml溶液用): 1.6 mlの10%水酸化カリウム溶液 0.6 mlの30%過酸化水素溶液 100 &mu;l 20% Tween 蒸留水で 20 ml まで充填</td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキング溶液</td><td></td><td></td><td>(10 ml 溶液用): 8 ml 1X PBS と 0.05% Tween 2 ml の子牛胎児血清 150 &mu;l of DMSO</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ活性検出</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td>ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kitを利用しています。&nbsp;ワーキング基板溶液を調製するには、製造元の指示に従って、検出バッファーで基板を20倍に希釈します。&nbsp;</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ洗浄液</td><td></td><td></td><td>洗浄緩衝液のレシピ(100 mL溶液用): 5 ml 0.5 M EDTA 120 mg のレバミゾール 95 ml の 1X PBS</td></tr><tr><td>デキストラン、フルオレセイン、40,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1844</td><td>蒸留水で希釈して 50 mg/mL のストック溶液を調製します。 アリコートを-20°Cの冷凍庫に保管します。</td></tr><tr><td>デキストラン、カスケードブルー、10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td>蒸留水で希釈して50 mg/mlのストック溶液を作り、アリコートを-20°Cの冷凍庫で保存します。</td></tr><tr><td>デキストラン、ルシファーイエロー、10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1825</td><td>蒸留水で希釈して 50 mg/ml のストック溶液を作り、アリコートを -20°C の冷凍庫で保存します。</td></tr><tr><td>デキストラン、テトラメチルローダミン(フルオロルビー)、10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>蒸留水で希釈して50 mg/mlのストック溶液を作り、アリコートを-20°Cの冷凍庫で保存します。</td></tr><tr><td>Dolichos biflorus 凝集素 (DBA)-ローダミン</td><td>ベクター研究所</td><td>RL-10-32</td><td>DBA 染色溶液 (100 &mu;l solution): 1 &mu;DBA 99 の l &mu;l 1X PBS</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield ハードセット 封入剤</td><td>ベクター研究所</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス</td><td></td><td>VWR 48393081</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド、DMSO</td><td>アメリカンバイオアナリティカル</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma</td><td>S0289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA、0.5 M溶液、pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502</td><td></td></tr><tr><td>レバミゾール</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>組織凍結培地</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TFM-C</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek クライオモールド生検、10 x 10x 5 mm</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>TruBond 380 接着顕微鏡スライド</td><td>Tru Scientific</td><td>0380W</td><td></td></tr><tr><td>リキッドブロッカー &ndash; スーパーPAPペン</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>免疫染色水分チャンバー</td><td>エバーグリーンサイエンティフィック</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>サーム</td><td>マイクロメートル&トレード;HM 525 クライオスタット</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ645;SMZ1000;83455 P-ブルーGFP / DAPI;83457 P-Endow GFP/FITC;83457 P-TRITC</td><td>フィルター セットは次の通りでした: Hoechst/DAPI フィルターは、DAPI、ヨウ化プロピジウム、デキストランカスケード ブルー、およびアルカリホスファターゼの検出に使用されました。GFP/FITCフィルターは、デキストラン-FITC、デキストランルシファーイエロー、および抗GFP検出に使用されました。TRITCフィルターは、デキストラン-フルオロ-ルビー、PI、およびDBAの検出に使用されました。</td></tr><tr><td>Nikon</td><td></td><td>96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td><td>Filter set used as follows: Hoechst/DAPIフィルターは、DAPI、ヨウ化プロピジウム、デキストランカスケードブルー、アルカリホスファターゼの検出に使用されました。GFP/FITCフィルターは、デキストラン-FITC、デキストランルシファーイエロー、および抗GFP検出に使用されました。Texas Redフィルターは、デキストラン-フルオロ-ルビー、PI、およびDBAの検出に使用されました。&nbsp;</td></tr></tbody></table>

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

ゼブラフィッシュのモデルは、腎臓の開発、再生や病気を研究するための関連システムとして浮上している。どちらの胚および成体ゼブラフィッシュ腎臓を強く哺乳類を含む他の脊椎動物と保存されているネフロンとして知られている機能ユニットで構成されている。ゼブラフィッシュの研究は最近、成人のネフロンが被害を被るから2独特の現象が蒸散ことを実証した：最初に、破壊された尿細管上皮細胞に置き換えられ、既存のネフロン内の強固な再生があります。第二、全く新しいネフロンはneonephrogenesisとして知られているプロセスにおける腎前駆細胞から産生される。これとは対照的に、ヒトおよび他の哺乳動物は、ネフロンの上皮再生のための限られた能力を持っているようだ。現在までに、これらの腎臓再生現象の原因となるメカニズムはよくわかっていないままである。大人のゼブラフィッシュ腎臓はネフロン上皮再生とneonephrogenesis両方を受けるので、それらは優れた実験的なパラを提供これらのイベントを研究するdigm。さらに、腎臓の再生を制御する細胞および分子メカニズムを描写するために使用することができるゼブラフィッシュモデルで利用可能な遺伝的および薬理学的ツールの広い範囲が存在する。このような研究の一つの重要な側面は、ネフロンの構造と機能の評価である。このプロトコルは、大人のゼブラフィッシュの腎臓における腎組成やテストネフロンの機能を評価するために使用することができます標識技術のセットについて説明します。したがって、これらの方法には、これらに限定されないが、成体ゼブラフィッシュの腎臓損傷パラダイム、腎毒性暴露方式や、ニトロレダクターゼ媒介細胞アブレーション法などの標的細胞死の遺伝的方法の将来の表現型の特徴付けに広く適用可能である。さらに、これらの方法は、成人の腎臓形成に遺伝的摂動を研究するために使用することができ、また、慢性疾患のモデリングの際に腎状態を評価するために適用することができる。

ゼブラフィッシュ成体の腎臓は腎臓の再生や病気の研究のための優れたシステムです。このような研究の重要な側面は、ネフロンの構造と機能の評価である。このプロトコルは、ネフロンの尿細管組成を評価し、腎再吸収を評価するために実施することができるいくつかの方法論を記載している。

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

次の実験の全体的な目標は、成体のゼブラフィッシュ腎臓におけるネフロンセグメントの組成と機能を評価することです。これは、最初に蛍光標識されたデキストリンをゼブラフィッシュを結びつける巣に注入することによって達成されます。2番目のステップは、腎臓を切除して固定し、その後のラベリング方法のために組織を準備することです。次に、腎臓を漂白して色素沈着を取り除き、次に染色して目的のネフロンセグメントを蛍光標識します。結果は、免疫蛍光法、顕微鏡法、および/または明視野イメージングを使用して取得され、選択した染色または染色に基づいて腎臓の解剖学的構造の視覚化を可能にします。以下のラベリング方法は、臓器の解剖学に関する腎臓分野の重要な質問に答えるのに役立ち、損傷イベントの前後の両方でネフロン組成を研究し、腎機能を評価するために使用できます。これらの技術の意味は、成人の腎臓形成における遺伝的異常の研究にまで及び、慢性疾患モデリング中の腎臓の状態を評価するためにも適用できます。麻酔をかけた魚から溶液をデカントし始め、濡れたスポンジカビの腹側に動物を慎重に置きます。次に、インスリン注射器に20マイクロリットルの解凍デキストリンストック溶液を入れます。腹部の腹側正中線で浅い角度で挿入が行われるように針を配置します。臓器に少し注入しないように、注入直後に針を上げて体壁を持ち上げ、溶液を注入するスペースを作ります。注射後、魚をそっと水槽に戻して麻酔から回復します。まず、麻酔をかけた魚から余分な溶液を取り除き、ティッシュペーパーまたはペーパータオルの上に置きます。頭部と内臓を切除した後、極細の解剖針を使用して体壁をピンで開きます。動物の背壁に付着している腎臓器官を見つけます。細い鉗子を使用して、腎臓を背壁から取り外します。腎臓を1つのXPBSが入った5ミリリットルのガラスバイアルにそっと入れ、それぞれ5分間3回洗浄します。.トランスファーピペットで腎臓を取り出し、1つのXPBSを1〜2滴垂らしたきれいなガラスのスライドに置きます。細い鉗子を使用してスライド上の腎臓を平らにし、組織が丸まったり、それ自体がひっくり返ったりしていないことを確認します。タングステンワイヤーツールを使用して、結合組織に小さな切開を行い、腎臓の平らな位置決めを容易にすることができます。次に、18 x 18 mm のガラス カバー スリップの各コーナーにモデリング粘土の小片を置きます。カバースリップを腎臓にゆっくりとセットし、わずかな角度を保ちます。気泡の捕捉を最小限に抑えるために、必要に応じてカバースリップとスライドの間のスペースを埋めるために、1つのXPBSを追加ドロップします。ゼブラフィッシュの別のグループを安楽死させ、固定剤に一晩浸します。準備ができたら、細い鉗子を使用して腎臓を背側壁から慎重に取り外し、臓器をガラス瓶に入れます。解剖した腎臓を、0.05%トゥイーンを含む1つのXPBSを3〜5ミリリットルで3回、それぞれ5分間洗浄します。.次に、PBS溶液を取り出し、5%スクロース溶液の3ミリリットルで腎臓を30分間すすぎます。この後、溶液を3ミリリットルの30%スクロースと交換し、翌日は摂氏4度で一晩保存します。溶液を取り出し、腎臓を2回洗ってから、3〜5ミリリットルの漂白液を追加します。腎臓器官に存在するメラノサイトの色素沈着を除去するには、ガラスバイアルをローテーターに置き、色素沈着が消えるのを注意深く観察します。色素脱失には通常約20分かかりますが、場合によっては60分もかかることもあります。漂白液を長時間放置すると崩壊する可能性があるため、色素沈着が腎臓洗浄液から2回除去されたときに10〜15分ごとにサンプルを監視して完全性を確認し、室温で4%PFA溶液と1時間インキュベートすることをお勧めします。次に、4%PFA溶液を取り出し、最後の洗浄後、3〜5ミリリットルのブロッキング溶液で腎臓を3回洗浄し、室温で2時間腎臓をインキュベートします。ブロッキングが完了したら、選択した染色プロトコルに直接進んでください。ブロッキング溶液を取り出し、腎臓を3回洗ってから、腎臓を1つのXPBSに少なくとも10分間浸します。この間に、腎臓を12ウェルまたは24ウェルの培養皿に移します。1つのXPBSを十分な作業用アルカリホスファターゼ基質溶液と交換してサンプルを覆い、サンプルを室温で30分間ローテーターに置きます。この時間の後、アルカリホスファターゼ洗浄緩衝液で腎臓を洗浄して反応を停止します。10〜15分かけて3回の洗浄緩衝液交換で腎臓をすすぎます。.次に、洗浄緩衝液を取り出し、清潔なガラスに腎臓をマウントします。ラベリングキットに含まれているホスファターゼ封入剤をスライドさせます。アルカリホスファターゼで染色された腎臓を、実体顕微鏡またはデビーフィルターセットにフックされた複合顕微鏡を使用して視覚化します。まず、DBAを1つのXPBSで希釈することにより、200マイクロリットルの作業DBA溶液を調製します。PBS溶液を200マイクロリットルのDBA溶液と交換し、サンプルを室温で1時間ローテーターに置きます。この時間の後、DBA溶液を取り出し、1つのXPBSを3〜5ミリリットルずつ5分間ずつ腎臓を3回洗浄します。1つのXPBSを取り外し、きれいなスライドガラスに腎臓を取り付けます。前に示したように、蛍光実体顕微鏡または複合顕微鏡にセットされた標準のTrixieまたはTexas Redフィルターセットを使用して、DBAで染色された腎臓の遠位セグメントを視覚化します。この無漂白の腎臓の明視野画像では、黒い色素沈着はメラノサイトの散在する集団に対応しています。ここでは、ネフロンPCTセグメントをデキストリン注射の3日後に視覚化します。挿入図には、メラノサイトを持つ単一のネフロンの画像が含まれています。この画像は、メラノサイトの色素沈着を取り除いた後の成人の腎臓を示しています。これらの代表的な画像は、PCTセグメント間のわずかな形態学的変化を示していますが、多くのネフロンPCTはしっかりとコイル状になっています。他のネフロンは、デキストリンカスケードブルーデキストリン、ルシファーイエロー、およびデキストリンフルオロルビーはすべて腎臓ネフロンのPCTセグメントを優先的に標識し、デキストリンカスケードブルーとルシファーイエローの両方が、ルシファーイエロー治療腎臓で観察されたはるかに高いバックグラウンドを持ついくつかの非特異的標識を示すPCT領域を含んでいます。対照的に、デキストリンフルオロルビーは、強力なPCTラベリングによりバックグラウンドが劇的に減少しました。PCTトランスポーター細胞型の特定のマーカーを検出することを希望して染色された成人腎臓は、デキストリン取り込みに特徴的な発現パターンを示し、さまざまな密集したループ状のPCTドメインの分布と、一貫した広い直径を示すより細長いPCTストレッチを示します。このビデオを見れば、近位尿細管にアルカリホスファターゼを、メディック遠位尿細管にDBAを装着するなど、成体のゼブラフィッシュ腎臓内のネフロンセグメントをうまく標識する方法を十分に理解できるはずです。4%パラアルデヒドでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、コート、手袋、眼鏡の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、成人のゼブラフィッシュから臓器を特定し、解剖するための手順を説明します。...

アダルトゼブラフィッシュからの臓器の解剖

ゼブラフィッシュの腎臓は、腎臓および造血両方成人の幹細胞/前駆細胞の本拠地であり、これらの細胞型と脊椎動物のモデル生物でそれらの子孫を研究する優秀な機会を表しています。ここでは、このような細胞の単離、移植、および腎臓および/または血液細胞集団の発現の研究​​などのアプリケーションに使用することができる大人のゼブラフィッシュの腎臓を、特定し、外科的に除去する研究者を可能にする詳細な解剖の手順を示しています。...

アダルトゼブラフィッシュ腎臓の解剖

ヒトの急性腎臓損傷（AKI）は腎臓のネフロンを構成する上皮細胞の損傷によって引き起こされる一般的な臨床上の問題であり、AKIは50から70パーセント1の高い死亡率に関連付けられています。この現象を導くメカニズムと限界がよくわかっていないままにかかわらず、上皮細胞の破壊に続いて、ネフロンは、再生する機能が制限されています。このビデオの記事では、我々はターゲットレーザーのゼブラフィッシュ胚の腎臓で腎臓のネフロン細胞の切除、または前腎のための私たちのテクニックを説明します。私たちの新しいメソッドは、AKIの腎毒性誘発性のモデルを補完し、腎臓のネフロンにおける上皮再生に関連付けられている細胞と分子の変化の高解像度の理解を得るために使用することができます。...

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このビデオは、成虫のゼブラフィッシュ腎臓のフラットマウントの解剖と準備を示しています。準備されたフラットマウントは、標本分析のために顕微鏡で視覚化することができます。...

腎臓フラットマウントの準備:成体のゼブラフィッシュ腎臓の顕微鏡分析のためのフラットマウントを解剖して準備する手順

このビデオでは、成魚の腎臓の色素脱失とその後の染色手順の準備を示しています。染色後、成体のゼブラフィッシュの腎臓は、腎臓の再生、腎疾患モデルの表現型の特徴付け、およびネフロンの機能の研究に使用できます。...

ゼブラフィッシュ腎臓の色素脱失と染色:成体ゼブラフィッシュ腎臓の染色準備技術

ここでは、ゲンタマイシン注射による急性腎障害を誘発することにより、成人の腎臓再生を研究するための信頼性の高い方法を紹介します。損傷はゲンタマイシンの投与量と環境温度に依存することを示し、in situハイブリダイゼーションを使用してlhx1a...

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ゼブラフィッシュは、慢性腎臓病（CKD）をモデル化するための一般的なツールである。しかし、それらの小さいサイズは、それが不可能な従来の方法を使用して腎機能を評価することを可能にする。私たちは、CKDにおけるゼブラフィッシュ腎臓機能の定量的な分析を可能にする蛍光色素腎クリアランスアッセイ1を記述する。...

蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

ここで説明する方法は、焦点平面ドリフトを補正する光学切片および再調整の単純な戦略を実行することができる顕微鏡解剖蛍光を用いて、ゼブラフィッシュ胚における器官の発達の時間経過解析を可能にします。...

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

抗生物質から化学療法に至るまで薬物が含まnephrotoxinsから発生腎損傷は、その病因が完全には理解のまま、複雑な障害をもたらすことができます。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの腎臓保護措置の同定に適用することができ、これらの条件、疾患のモデリングのために使用することができる方法を示します。...

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

このプロトコルは、腎毒性物質としてシスプラチンを使用して、成体ゼブラフィッシュに急性腎損傷(AKI)を誘導する手順を記述する。この技術の再現性を評価するステップと、腎組織、フローサイトメトリー、TUNELの炎症と細胞死を分析する2つの技術を詳述した。...

成体ゼブラフィッシュにおけるシスプラチンによる急性腎損傷モデル

ゼブラフィッシュは腎臓の発達を理解するための重要なモデルです。ここで、イン ・シチュハイブリ...

イン・シトゥ メサネフォロス発生時のゼブラフィッシュ幼虫と若年期のハイブリダイゼーション

学ぶ 大人のゼブラフィッシュ腎臓におけるネフロン構成と機能の解析方法。蛍光標識デキストリン注入、組織染色、免疫蛍光顕微鏡技術を用いて腎臓解剖と再吸収機能を評価し、腎臓再生医療や疾患研究に貢献します。

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

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