大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

次の実験の全体的な目標は、成体のゼブラフィッシュ腎臓におけるネフロンセグメントの組成と機能を評価することです。これは、最初に蛍光標識されたデキストリンをゼブラフィッシュを結びつける巣に注入することによって達成されます。2番目のステップは、腎臓を切除して固定し、その後のラベリング方法のために組織を準備することです。

次に、腎臓を漂白して色素沈着を取り除き、次に染色して目的のネフロンセグメントを蛍光標識します。結果は、免疫蛍光法、顕微鏡法、および/または明視野イメージングを使用して取得され、選択した染色または染色に基づいて腎臓の解剖学的構造の視覚化を可能にします。以下のラベリング方法は、臓器の解剖学に関する腎臓分野の重要な質問に答えるのに役立ち、損傷イベントの前後の両方でネフロン組成を研究し、腎機能を評価するために使用できます。

これらの技術の意味は、成人の腎臓形成における遺伝的異常の研究にまで及び、慢性疾患モデリング中の腎臓の状態を評価するためにも適用できます。麻酔をかけた魚から溶液をデカントし始め、濡れたスポンジカビの腹側に動物を慎重に置きます。次に、インスリン注射器に20マイクロリットルの解凍デキストリンストック溶液を入れます。

腹部の腹側正中線で浅い角度で挿入が行われるように針を配置します。臓器に少し注入しないように、注入直後に針を上げて体壁を持ち上げ、溶液を注入するスペースを作ります。注射後、魚をそっと水槽に戻して麻酔から回復します。

まず、麻酔をかけた魚から余分な溶液を取り除き、ティッシュペーパーまたはペーパータオルの上に置きます。頭部と内臓を切除した後、極細の解剖針を使用して体壁をピンで開きます。動物の背壁に付着している腎臓器官を見つけます。

細い鉗子を使用して、腎臓を背壁から取り外します。腎臓を1つのXPBSが入った5ミリリットルのガラスバイアルにそっと入れ、それぞれ5分間3回洗浄します。.トランスファーピペットで腎臓を取り出し、1つのXPBSを1〜2滴垂らしたきれいなガラスのスライドに置きます。

細い鉗子を使用してスライド上の腎臓を平らにし、組織が丸まったり、それ自体がひっくり返ったりしていないことを確認します。タングステンワイヤーツールを使用して、結合組織に小さな切開を行い、腎臓の平らな位置決めを容易にすることができます。次に、18 x 18 mm のガラス カバー スリップの各コーナーにモデリング粘土の小片を置きます。

カバースリップを腎臓にゆっくりとセットし、わずかな角度を保ちます。気泡の捕捉を最小限に抑えるために、必要に応じてカバースリップとスライドの間のスペースを埋めるために、1つのXPBSを追加ドロップします。ゼブラフィッシュの別のグループを安楽死させ、固定剤に一晩浸します。

準備ができたら、細い鉗子を使用して腎臓を背側壁から慎重に取り外し、臓器をガラス瓶に入れます。解剖した腎臓を、0.05%トゥイーンを含む1つのXPBSを3〜5ミリリットルで3回、それぞれ5分間洗浄します。.次に、PBS溶液を取り出し、5%スクロース溶液の3ミリリットルで腎臓を30分間すすぎます。

この後、溶液を3ミリリットルの30%スクロースと交換し、翌日は摂氏4度で一晩保存します。溶液を取り出し、腎臓を2回洗ってから、3〜5ミリリットルの漂白液を追加します。腎臓器官に存在するメラノサイトの色素沈着を除去するには、ガラスバイアルをローテーターに置き、色素沈着が消えるのを注意深く観察します。

色素脱失には通常約20分かかりますが、場合によっては60分もかかることもあります。漂白液を長時間放置すると崩壊する可能性があるため、色素沈着が腎臓洗浄液から2回除去されたときに10〜15分ごとにサンプルを監視して完全性を確認し、室温で4%PFA溶液と1時間インキュベートすることをお勧めします。次に、4%PFA溶液を取り出し、最後の洗浄後、3〜5ミリリットルのブロッキング溶液で腎臓を3回洗浄し、室温で2時間腎臓をインキュベートします。

ブロッキングが完了したら、選択した染色プロトコルに直接進んでください。ブロッキング溶液を取り出し、腎臓を3回洗ってから、腎臓を1つのXPBSに少なくとも10分間浸します。この間に、腎臓を12ウェルまたは24ウェルの培養皿に移します。

1つのXPBSを十分な作業用アルカリホスファターゼ基質溶液と交換してサンプルを覆い、サンプルを室温で30分間ローテーターに置きます。この時間の後、アルカリホスファターゼ洗浄緩衝液で腎臓を洗浄して反応を停止します。10〜15分かけて3回の洗浄緩衝液交換で腎臓をすすぎます。.

次に、洗浄緩衝液を取り出し、清潔なガラスに腎臓をマウントします。ラベリングキットに含まれているホスファターゼ封入剤をスライドさせます。アルカリホスファターゼで染色された腎臓を、実体顕微鏡またはデビーフィルターセットにフックされた複合顕微鏡を使用して視覚化します。

まず、DBAを1つのXPBSで希釈することにより、200マイクロリットルの作業DBA溶液を調製します。PBS溶液を200マイクロリットルのDBA溶液と交換し、サンプルを室温で1時間ローテーターに置きます。この時間の後、DBA溶液を取り出し、1つのXPBSを3〜5ミリリットルずつ5分間ずつ腎臓を3回洗浄します。

1つのXPBSを取り外し、きれいなスライドガラスに腎臓を取り付けます。前に示したように、蛍光実体顕微鏡または複合顕微鏡にセットされた標準のTrixieまたはTexas Redフィルターセットを使用して、DBAで染色された腎臓の遠位セグメントを視覚化します。この無漂白の腎臓の明視野画像では、黒い色素沈着はメラノサイトの散在する集団に対応しています。

ここでは、ネフロンPCTセグメントをデキストリン注射の3日後に視覚化します。挿入図には、メラノサイトを持つ単一のネフロンの画像が含まれています。この画像は、メラノサイトの色素沈着を取り除いた後の成人の腎臓を示しています。

これらの代表的な画像は、PCTセグメント間のわずかな形態学的変化を示していますが、多くのネフロンPCTはしっかりとコイル状になっています。他のネフロンは、デキストリンカスケードブルーデキストリン、ルシファーイエロー、およびデキストリンフルオロルビーはすべて腎臓ネフロンのPCTセグメントを優先的に標識し、デキストリンカスケードブルーとルシファーイエローの両方が、ルシファーイエロー治療腎臓で観察されたはるかに高いバックグラウンドを持ついくつかの非特異的標識を示すPCT領域を含んでいます。対照的に、デキストリンフルオロルビーは、強力なPCTラベリングによりバックグラウンドが劇的に減少しました。

PCTトランスポーター細胞型の特定のマーカーを検出することを希望して染色された成人腎臓は、デキストリン取り込みに特徴的な発現パターンを示し、さまざまな密集したループ状のPCTドメインの分布と、一貫した広い直径を示すより細長いPCTストレッチを示します。このビデオを見れば、近位尿細管にアルカリホスファターゼを、メディック遠位尿細管にDBAを装着するなど、成体のゼブラフィッシュ腎臓内のネフロンセグメントをうまく標識する方法を十分に理解できるはずです。4%パラアルデヒドでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、コート、手袋、眼鏡の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。