大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析
August 9th, 2014
ゼブラフィッシュ成体の腎臓は腎臓の再生や病気の研究のための優れたシステムです。このような研究の重要な側面は、ネフロンの構造と機能の評価である。このプロトコルは、ネフロンの尿細管組成を評価し、腎再吸収を評価するために実施することができるいくつかの方法論を記載している。
次の実験の全体的な目標は、成体のゼブラフィッシュ腎臓におけるネフロンセグメントの組成と機能を評価することです。これは、最初に蛍光標識されたデキストリンをゼブラフィッシュを結びつける巣に注入することによって達成されます。2番目のステップは、腎臓を切除して固定し、その後のラベリング方法のために組織を準備することです。
次に、腎臓を漂白して色素沈着を取り除き、次に染色して目的のネフロンセグメントを蛍光標識します。結果は、免疫蛍光法、顕微鏡法、および/または明視野イメージングを使用して取得され、選択した染色または染色に基づいて腎臓の解剖学的構造の視覚化を可能にします。以下のラベリング方法は、臓器の解剖学に関する腎臓分野の重要な質問に答えるのに役立ち、損傷イベントの前後の両方でネフロン組成を研究し、腎機能を評価するために使用できます。
これらの技術の意味は、成人の腎臓形成における遺伝的異常の研究にまで及び、慢性疾患モデリング中の腎臓の状態を評価するためにも適用できます。麻酔をかけた魚から溶液をデカントし始め、濡れたスポンジカビの腹側に動物を慎重に置きます。次に、インスリン注射器に20マイクロリットルの解凍デキストリンストック溶液を入れます。
腹部の腹側正中線で浅い角度で挿入が行われるように針を配置します。臓器に少し注入しないように、注入直後に針を上げて体壁を持ち上げ、溶液を注入するスペースを作ります。注射後、魚をそっと水槽に戻して麻酔から回復します。
まず、麻酔をかけた魚から余分な溶液を取り除き、ティッシュペーパーまたはペーパータオルの上に置きます。頭部と内臓を切除した後、極細の解剖針を使用して体壁をピンで開きます。動物の背壁に付着している腎臓器官を見つけます。
細い鉗子を使用して、腎臓を背壁から取り外します。腎臓を1つのXPBSが入った5ミリリットルのガラスバイアルにそっと入れ、それぞれ5分間3回洗浄します。.トランスファーピペットで腎臓を取り出し、1つのXPBSを1〜2滴垂らしたきれいなガラスのスライドに置きます。
細い鉗子を使用してスライド上の腎臓を平らにし、組織が丸まったり、それ自体がひっくり返ったりしていないことを確認します。タングステンワイヤーツールを使用して、結合組織に小さな切開を行い、腎臓の平らな位置決めを容易にすることができます。次に、18 x 18 mm のガラス カバー スリップの各コーナーにモデリング粘土の小片を置きます。
カバースリップを腎臓にゆっくりとセットし、わずかな角度を保ちます。気泡の捕捉を最小限に抑えるために、必要に応じてカバースリップとスライドの間のスペースを埋めるために、1つのXPBSを追加ドロップします。ゼブラフィッシュの別のグループを安楽死させ、固定剤に一晩浸します。
準備ができたら、細い鉗子を使用して腎臓を背側壁から慎重に取り外し、臓器をガラス瓶に入れます。解剖した腎臓を、0.05%トゥイーンを含む1つのXPBSを3〜5ミリリットルで3回、それぞれ5分間洗浄します。.次に、PBS溶液を取り出し、5%スクロース溶液の3ミリリットルで腎臓を30分間すすぎます。
この後、溶液を3ミリリットルの30%スクロースと交換し、翌日は摂氏4度で一晩保存します。溶液を取り出し、腎臓を2回洗ってから、3〜5ミリリットルの漂白液を追加します。腎臓器官に存在するメラノサイトの色素沈着を除去するには、ガラスバイアルをローテーターに置き、色素沈着が消えるのを注意深く観察します。
色素脱失には通常約20分かかりますが、場合によっては60分もかかることもあります。漂白液を長時間放置すると崩壊する可能性があるため、色素沈着が腎臓洗浄液から2回除去されたときに10〜15分ごとにサンプルを監視して完全性を確認し、室温で4%PFA溶液と1時間インキュベートすることをお勧めします。次に、4%PFA溶液を取り出し、最後の洗浄後、3〜5ミリリットルのブロッキング溶液で腎臓を3回洗浄し、室温で2時間腎臓をインキュベートします。
ブロッキングが完了したら、選択した染色プロトコルに直接進んでください。ブロッキング溶液を取り出し、腎臓を3回洗ってから、腎臓を1つのXPBSに少なくとも10分間浸します。この間に、腎臓を12ウェルまたは24ウェルの培養皿に移します。
1つのXPBSを十分な作業用アルカリホスファターゼ基質溶液と交換してサンプルを覆い、サンプルを室温で30分間ローテーターに置きます。この時間の後、アルカリホスファターゼ洗浄緩衝液で腎臓を洗浄して反応を停止します。10〜15分かけて3回の洗浄緩衝液交換で腎臓をすすぎます。.
次に、洗浄緩衝液を取り出し、清潔なガラスに腎臓をマウントします。ラベリングキットに含まれているホスファターゼ封入剤をスライドさせます。アルカリホスファターゼで染色された腎臓を、実体顕微鏡またはデビーフィルターセットにフックされた複合顕微鏡を使用して視覚化します。
まず、DBAを1つのXPBSで希釈することにより、200マイクロリットルの作業DBA溶液を調製します。PBS溶液を200マイクロリットルのDBA溶液と交換し、サンプルを室温で1時間ローテーターに置きます。この時間の後、DBA溶液を取り出し、1つのXPBSを3〜5ミリリットルずつ5分間ずつ腎臓を3回洗浄します。
1つのXPBSを取り外し、きれいなスライドガラスに腎臓を取り付けます。前に示したように、蛍光実体顕微鏡または複合顕微鏡にセットされた標準のTrixieまたはTexas Redフィルターセットを使用して、DBAで染色された腎臓の遠位セグメントを視覚化します。この無漂白の腎臓の明視野画像では、黒い色素沈着はメラノサイトの散在する集団に対応しています。
ここでは、ネフロンPCTセグメントをデキストリン注射の3日後に視覚化します。挿入図には、メラノサイトを持つ単一のネフロンの画像が含まれています。この画像は、メラノサイトの色素沈着を取り除いた後の成人の腎臓を示しています。
これらの代表的な画像は、PCTセグメント間のわずかな形態学的変化を示していますが、多くのネフロンPCTはしっかりとコイル状になっています。他のネフロンは、デキストリンカスケードブルーデキストリン、ルシファーイエロー、およびデキストリンフルオロルビーはすべて腎臓ネフロンのPCTセグメントを優先的に標識し、デキストリンカスケードブルーとルシファーイエローの両方が、ルシファーイエロー治療腎臓で観察されたはるかに高いバックグラウンドを持ついくつかの非特異的標識を示すPCT領域を含んでいます。対照的に、デキストリンフルオロルビーは、強力なPCTラベリングによりバックグラウンドが劇的に減少しました。
PCTトランスポーター細胞型の特定のマーカーを検出することを希望して染色された成人腎臓は、デキストリン取り込みに特徴的な発現パターンを示し、さまざまな密集したループ状のPCTドメインの分布と、一貫した広い直径を示すより細長いPCTストレッチを示します。このビデオを見れば、近位尿細管にアルカリホスファターゼを、メディック遠位尿細管にDBAを装着するなど、成体のゼブラフィッシュ腎臓内のネフロンセグメントをうまく標識する方法を十分に理解できるはずです。4%パラアルデヒドでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、コート、手袋、眼鏡の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
概要
この記事では、成体のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン断層の組成と機能性を評価するためのプロトコルを提示します。これは、腎臓研究に価値あるモデルです。説明された方法論は、ネフロンの構造と腎臓の再吸収の評価を容易にし、腎臓再生と疾患の研究に貢献します。
主要な研究要素
科学分野
- 腎臓学
- 再生医療
- 比較生物学
背景
- ゼブラフィッシュは腎臓機能と再生を研究するためのモデル生物です。
- ネフロンの構造の理解は腎臓疾患研究に重要です。
- 蛍光標識技術は腎臓解剖の視覚化を強化します。
- 研究の意味は遺伝的異常と慢性疾患モデリングにまで及びます。
研究目的
- ゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン断層の組成を評価すること。
- 損傷前後の腎機能を評価すること。
- 腎臓研究に適用可能な方法論を開発すること。
使用された方法
- ゼブラフィッシュへの蛍光標識されたデクストリンの注入。
- 組織調製のための腎臓の解剖と固定。
- ネフロン断層の脱色と染色。
- 免疫蛍光と顕微鏡技術を用いた視覚化。
主な結果
- 染色後のネフロン断層の成功的な視覚化。
- 技術により腎臓の詳細な解剖評価が可能。
- 結果は腎臓の解剖学と機能の理解に貢献。
- 方法論は様々な腎臓研究用途に適応可能。
結論
- ゼブラフィッシュの腎臓モデルはネフロン研究に効果的。
- 蛍光標識技術は腎機能への洞察を提供。
- 研究結果は腎臓疾患と再生に影響。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding nephron regeneration mechanisms in zebrafish provides predictive value for identifying compounds that modulate renal repair pathways. This model supports target validation by enabling functional assessment of nephron segment integrity before and after injury. The protocol facilitates mechanistic de-risking in early discovery by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable renal phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to renal regeneration pathways through segment-specific labeling.
- Operational Value: Provides reproducible readouts of nephron epithelial integrity and tubular function in adult zebrafish.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that promote true regeneration versus transient repair.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for proximal and distal tubule segments to assess compound effects.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and staining workflows for high-content imaging platforms.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats for dose-response screening in renal injury models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage nephron labeling to preclinical evaluation of renal recovery in injury paradigms.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural nephron changes with functional dextrin clearance as a translational readout.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying nephron segment-specific damage and regeneration kinetics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing functional renal phenotyping capabilities.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of renal regeneration mechanisms via visualization of nephron segment composition.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized kidney preparations with segment-specific fluorescent outputs for compound screening.
- Analytics: Enables quantitative comparison of dextrin uptake and segment intensity across conditions to assess renal functionality.
- Translational Research: Connects structural nephron assessment to functional recovery metrics in chronic disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal renal phenotyping across genetic and pharmacological injury models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in renal target validation through direct visualization of nephron segment integrity.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, bleaching, and multi-step staining protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of nephrotoxic liabilities in lead candidates.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying regenerative capacity in preclinical renal models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microsurgery, and fluorescence microscopy.
- Dependent on dextrin labeling reagents, bleaching solutions, and immunofluorescence infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for consistent kidney dissection and mounting procedures.
- Adaptation considerations include species-specific pigmentation and nephron architecture in non-zebrafish models.
- Practical limitations include tissue fragility during dissection and potential dextrin efflux affecting longitudinal studies.
