蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの定量的腎機能アッセイを作成することです。これは、最初に72 HPFでゼブラフィッシュの胚に麻酔をかけることによって達成されます。次に、胚を射出成形金型に移し、心臓が視野の左側に来るように向きを変えます。

次に、心膜腔に反芻デクストラ蛍光色素を注入し、エピ蛍光解剖顕微鏡を使用して心臓領域の蛍光画像が必要です。最終的に、蛍光色素の腎臓クリアランスは、エピ蛍光顕微鏡を使用して評価されます。この技術の主な利点は、ゼブラフィッシュでは不可能な血液検査や尿検査を必要とせずに、ゼブラフィッシュの腎機能を定量的に読み取ることができることです。

この方法は、ゼブラフィッシュ疾患モデルにおける腎機能を評価するための強力なツールを提供します。針を引っ張り、テキストプロトコルに従って型を準備した後、最初に魚水で作った2%aro溶液を90ミリメートルのシャーレに注いで型を鋳造します。型をペトリ皿に置き、積み重ねられたスライドエッジがアグロ表面の下に斜めに沈むようにします。

30分間設定します。スライドキャストを取り外し、トリカ麻酔薬を含む新鮮な魚の水を1対25の比率で使用します。スライドを覆うために、蛍光染料のゼブラフィッシュ注射を行うためにarosを刷り込みました。

1.0外径キャピラリーで使用するためのストレートピペットホルダーに供給する圧力調整器システムに接続されたエアコンプレッサーで構成される標準的なマイクロインジェクションセットアップを使用します。ピペットホルダーはMN 33コンパクト内に収納する必要があります。磁気スタンドユーザー解剖顕微鏡によってスチールベースプレートに固定された3軸制御マイクロマニピュレータは、テキストプロトコルに概説されている標準条件を使用してゼブラフィッシュを維持しながら胚を視覚化、操作、および注入します。

実験に適した野生型またはトランスジェニックゼブラフィッシュラインを使用してください。8リットルのタンクあたり15匹のオスから15匹のメスのストッキング密度を維持して、魚を邪魔することなく最大限の卵が収集されるようにします。繁殖タンクは、収集の前夜に野生型のストックタンクに沈めます。

収集日には、魚が産卵するまで30〜40分待ちます。次に、メッシュストレーナーと新鮮な水槽の水を使用して、卵を集めてすすぎます。洗浄した卵を胚、培地を含む90ミリメートルのペトリ皿に沈着させ、摂氏28.5度でインキュベートして筋形成を阻害します。

8時間です。受精後またはHPF。生存可能な胚を最小限の液体で1〜100PTUを含む新鮮なペトリ皿に移し、胚培地にさらに28.5°Cでインキュベートします。

先端の細い鉗子を使用して、針の端を折ってください。次に、パルス持続時間を分設定まで最大化することにより、RDを針の先端に移動します。ソリューションが先端に到達したら、ミリ秒に戻します。

マイクロメータを顕微鏡ステージに置き、圧力調整器と針先を微調整して、噴出液滴のサイズを直径100ミクロンまたは0.5ナノリットルに調整してから注入します。35mmシャーレを2枚セットします。それぞれに5ミリリットルの胚培地ラベルが含まれており、1つはトリカ、もう1つは回収されます。

トリカラベルの付いた皿に200マイクロリットルのストックトリカを追加します。注入の準備ができたら、72 HPFの個々の胚を選択します。最小限の液体をトリカ皿に移し、胚の活動を監視します。

胚に麻酔をかけたら、それを射出成形金型に移し、左側が上を向くようにトラフに向けます。心臓を視野の左側に配置します。RDを心臓に注入するには、針を使用して心膜を突き刺し、1ナノリットルのRDを心膜腔に注入します。

針を抜いた後、注入した胚を最小限の液体で回収皿に移し、1分間モニターします。次に、個々の胚をPTUを含む1ミリリットルの新鮮胚培地を含む24ウェルプレートに移し、適切に標識します。実験群ごとに少なくとも10個の胚を注入した後、摂氏28.5度で3時間インキュベートします。

注射後 3 時間後または HPI 麻酔胚 前述のように。そして、3%メチルセルロースを含む35ミリメートルのシャーレに移します。胚をメチルセルロースにそっと押し込み、外側が画像化できるように向きを変えます。

UV光に対して570ナノメートルの発光フィルターを使用して、胚の画像を取得します。胚を回復させてから、指定されたウェルで胚を交換し、注入されたすべての胚の画像を取得し、摂氏28.5度でインキュベートを続けます。24 HP で 2 回目の画像を取得した後、Image J ソフトウェアを使用して、画像を開いて関心領域または ROI を指定することにより、注入された各胚の蛍光強度を定量化します。

[選択の編集] を選択し、値を 100 平方ピクセルに指定して設定します。ROIの中央に心臓を配置し、分析を選択し、測定値を設定し、平均グレースケールと面積を含むように測定値を設定します。次に、測定を行い、胚あたり3つのHPIおよび24 HPIの画像セットの各画像セットの蛍光を定量化し、平均グレースケール値をスプレッドシートに転送してさらに処理します。

適切なソフトウェアを使用して統計分析を実行し、ここに示すように、学生のT検定を使用してグループ間の統計的有意性を比較します。bbbs nine MorphoにRDを注入した魚は、受精後5日までに胚の40%が腹褐性嚢胞を発症しました。さらに、モルフィンフィッシュは、対照と比較して、24HPI後に蛍光色素を除去する能力の低下を示しました。

15分以内に10匹の魚のグループを注入する必要があります。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの光学的透明性を利用して、ゼブラフィッシュの腎機能の効果的な読み出しとして、マイクロ注入された蛍光色素の時間的クリアランスを定量的にモニターする方法を十分に理解できるはずです。