蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

本手順の総合的な目的は、ゼブラフィッシュにおける定量的な腎機能アッセイを構築することである。まず、受精後72時間（72 HPF）のゼブラフィッシュ胚を麻酔させる。次に、胚を注入用モールドに移し、心臓が視野の左側にくるように配置する。

次に、心膜腔にルミン・デキストラ蛍光染料を注入し、エピ蛍光解剖顕微鏡を用いて心臓領域の蛍光画像を撮影します。最終的に、エピ蛍光顕微鏡を用いて蛍光染料の腎排泄能を評価します。この手法の主な利点は、ゼブラフィッシュでは困難な血液検査や尿検査を行うことなく、ゼブラフィッシュの腎機能を定量的に読み取れる点にあります。

この手法は、ゼブラフィッシュの疾患モデルにおいて腎機能を評価するための強力なツールとなります。テキストプロトコルに従って針を引き抜き、型を準備した後、まず魚用水で調製した2%アガロース溶液を90 mmのペトリ皿に注ぎ、型を鋳造します。型をペトリ皿の上に置き、重ねたスライドの端がアガロース表面下に傾いた状態で浸かるようにします。

30分間静置します。スライドキャストを取り除き、trica麻酔剤を1:25の割合で含有させた新しい魚用飼育水を使用します。スライドに転写した個体を覆い、ゼブラフィッシュに蛍光色素の注入を行います。

エアコンプレッサー、圧力レギュレーターシステム、および外径1.0のキャピラリーに使用するストレートピペットホルダーで構成される標準的なマイクロインジェクション装置を使用します。ピペットホルダーはMN 33コンパクト内に設置してください。磁気スタンドでスチール製ベースプレートに固定された3軸制御マイクロマニピュレーターと、解剖顕微鏡を使用して、テキストプロトコルに記載された標準条件で維持されたゼブラフィッシュの胚を可視化、操作、および注入します。

実験に応じて、野生型または遺伝子組換えのゼブラフィッシュ系統を使用します。魚にストレスを与えず最大限の卵を回収できるよう、8Lのタンクあたりオス15匹とメス15匹の飼育密度を維持します。回収の前夜に、繁殖タンクを野生型のストックタンクの中に沈めておきます。

採取日に、魚に30～40分間産卵させます。次に、メッシュストレーナーと新鮮な飼育水を用いて卵を回収し、洗浄します。洗浄した卵を、胚培地を含む90 mmのペトリ皿に移し、筋形成を抑制するために28.5 °Cでインキュベートします。

受精後8時間（HPF）に、生存している胚を最小限の液体とともに、1-phenyl-2-thiourea（PTU）を100 µM添加した胚培養液を含む新しいペトリ皿に移し、28.5 °Cでさらにインキュベートします。

先端の細いピンセットを使用して、ニードルの端を折ります。次に、パルス幅を最小設定まで最大にして、RDをニードルの先端まで移動させます。溶液が先端に達したら、設定をミリ秒に戻します。

マイクロメーターを顕微鏡ステージ上に配置し、圧力レギュレーターとニードルチップの微調整を用いて、注入前の排出液滴のサイズを直径100ミクロン、または体積0.5ナノリットルに調整します。35ミリメートルのペトリ皿を2枚用意します。それぞれに5ミリリットルの胚培地を入れ、一方に「trica」、もう一方に「recovery」とラベルを貼ります。

ストックtricaを200 µL、tricaとラベルされたディッシュに加えます。注入の準備が整ったら、72 HPFの個別の胚を選択します。最小限の液体をtricaディッシュに移し、胚の活動を観察します。

胚を麻酔した後、注入用モールドに移し、左側が上になるように溝の中で方向を調整します。心臓を視野の左側に配置します。RDを心臓に注入するには、針で心膜を貫通させ、心膜腔に1 nanoliterのRDを注入します。

針を抜いた後、注入した胚を最小限の液体とともに回収ディッシュに移し、1分間観察します。次に、個々の胚を、PTUを含む新鮮な胚培養液1 mLが入った24ウェルプレートに移し、適切にラベルを貼ります。実験群あたり少なくとも10個の胚に注入した後、28.5 °Cで3時間インキュベートします。

注入後3時間（HPI）に、既述の方法で胚を麻酔します。その後、3%メチルセルロースを含む35 mmペトリ皿に移します。胚をメチルセルロースの中にそっと押し込み、側面を撮影できるように向きを調整します。

UV光用に570ナノメートルのエミッションフィルターを使用し、胚の画像を撮影します。胚を回復させた後、指定のウェルに戻し、すべての注入済み胚の画像を撮影して、引き続き28.5°Cでインキュベートします。24 HPに2回目の画像撮影を行った後、Image Jソフトウェアを用いて、画像を開き関心領域（ROI）を指定することで、各注入済み胚の蛍光強度を定量化します。

「選択範囲を編集」を選択し、値を100正方形ピクセルに指定して設定します。ROIの中央に心臓を配置し、「解析」を選択して「測定設定」を開き、平均グレースケールと面積を測定項目に含めます。その後、測定を行い、胚ごとに3 HPIおよび24 HPIの各画像セットの蛍光強度を定量化し、さらなる解析のために平均グレースケール値をスプレッドシートに転記します。

適切なソフトウェアを使用して統計解析を行い、ここで示すようにStudent's T-testを用いて群間の統計的有意性を比較します。bbbs nine Morphoを注入した魚にRDを注入したところ、受精後5日までに胚の40%に前脳嚢胞が形成されました。さらに、Morpho注入魚は、対照群と比較して、注入後24時間（HPI）における蛍光色素の除去能力の低下を示しました。

10匹の魚のグループにつき、15分以内に注射を完了させる必要があります。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュの光学的な透明性を利用し、微量注入した蛍光色素の経時的な消失を定量的にモニタリングすることで、ゼブラフィッシュの腎機能を効果的に評価する方法について十分に理解できるはずです。