Name: 蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学ぶ 蛍光クリアランスアッセイによるゼブラフィッシュ腎機能の定量評価法。72時間胚にルミン・デキストラン蛍光色素を心膜腔に注入し、エピ蛍光顕微鏡で観察することで、非侵襲的に腎機能を測定し慢性腎臓病研究に応用する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jaipreet Bharjからの技術サポート。この作業は、EU-FP7（SYSCILIA -241955）とオランダの腎臓財団（CP11.18）からの補助金によってサポートされていました。

倫理声明：動物のメンテナンス、畜産、および手続きは動物によって定義され、制御されている（科学的処置）法1986年のすべての動物実験は、生物学的に適合して内務大臣（PIL号7892分の70）によって与えられたライセンスの下で実施されましたサービス管理グループと生物サービス倫理委員会、SGUL、ロンドン、英国。すべての努力は、使用される動物の数を減少させ、苦痛を最小にし、福祉を向上させるために、手順および飼育の両方を洗練するために行われた。 楽器、麻酔剤、蛍光色素の調製<ol><li> （フィラメントなしで）マイクロピペットプラーとホウケイ標準壁毛細血管を使用して、マイクロインジェクション（ 図1A）のための適切な長さの針を引っ張る。 </li><li>心膜（ 図1B）への容易な注射のための胚の向きのためにアガロースの金型を作成します。のり約10ガラス顕微鏡SL一緒のIDEオフセットスライドの「階段」を形成する。最良の結果を得るには、各スライドの中央に急速なセットエポキシ樹脂接着剤のドロップを使用。 </li><li>ブンゼンバーナー加熱されたメスを用いてプラスチック製のピペット2 10ミリリットルを通じて長さを半で約78ミリメートルのセクションを切り取り、ピペットは、必要に応じて終了し削除します。金型90のペトリ皿中に浸漬することを可能にするために安定性を提供するために、積み重ねられたガラススライドにピペット部を取り付け、接着剤（エポキシ樹脂）。スライドの角をペトリ皿の床に垂直に整列することを確認するためにあらゆる努力をする。糊時間が設定できるようにする。 </li><li> （水族館から入手）の魚を水に作ら2％アガロース溶液中に金型にキャスト。 90ミリメートルペトリ皿にアガロース注ぎ、オープンペトリ皿の上に金型を置き、積み重ねられたスライドはアガロース表面の下の角度で水没するエッジ許可する。 30分間の実験台に設定することにしておきます。 </li><li>スライドキャストを取り外し、スライドインプリント新鮮な魚の水でアガロースをカバートリカイン麻酔薬を含む1：25の比率で（ステップ1.9を参照）。 </li><li>ローダミンデキストラン（RD）染料のソリューションを作成します。ローダミンB、10,000MWの50 mg / mlのストック濃度を作るためにオートクレーブした超純水に標識デキストランを再懸濁する。マイクロインジェクションのために、さらにオートクレーブした超純水中5mg / mlの最終濃度にストックを希釈する。 注：色素沈着細胞を24時間後に受精（HPF）からゼブラフィッシュに分化し始める。これらは、画像取得中蛍光マーカーを曖昧にすることができます。 </li><li>ブロックは、チロシナーゼの阻害を介してメラニンN -Phenylthiourea（PTU）を使用してメラニン形成を阻害する。完全に可溶化するために60℃の水槽水、熱溶液にPTU粉末を溶解することによりPTU 0.003％原液を作る。 </li><li>真菌ブルームを防止し、生存率を高めるために、メチレンブルー溶液、穏やかな殺菌剤でゼブラフィッシュ胚を培養する。 Uの0.1％メチレンブルーを含む、メチレンブルー原液の2ミリリットルを追加します。ltrapure水、標準的な胚培地として、水槽の水および使用の1 Lに。 </li><li> 「ゼブラフィッシュブック」23の手順に従って、トリカイン/エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩の15 mMストック濃度を構成している。胚を麻酔し、結果的にマイクロインジェクションの手順を実行するためにそれらを固定化した。 </li><li>胚を麻酔した後、メチルセルロースの非毒性および粘性の特性を利用して画像化するために、それらを方向付ける。 、3％メチルセルロース200mlの準備を行う氷上で30分間置き、-20℃で130mlの水を冷却した。ガラスビーカー中で80℃の熱水70mlを、メチルセルロース6gのを追加し、全ての粒子が濡れ均一に分散されるまで、ガラス棒を用いて攪拌する。氷冷した水を加え混合し、製剤を50 mlチューブに等分する前に、30分間、4℃で冷却する。 注：温度を下げることはメチルセルロースが可溶性になることができます。溶液は濃厚になります粉末水和物として。 3％のメチルセルロースを、細菌を4℃で一週間の短期間増殖または-20℃で長くすることなく保存することができる。メチルセルロースは、使用前にRTに達していることを確認してください。 </li><li>ゼブラフィッシュへの蛍光色素の注入を実行するには、標準的なマイクロインジェクションのセットアップ（ 図1C）を使用します。これは、1.0外径毛細管で使用するためのストレートピペットホルダに供給する圧力調整器システムに接続された空気圧縮機で構成されている。ピペットホルダは、磁気スタンドにより鋼製基板に固定MM33コンパクトな3軸制御マニピュレーター内に収容されるべきである。胚を操作し、可視化し、立体解剖顕微鏡を用いて注入することができる。 </li></ol> 2.ゼブラフィッシュ畜産とプレ噴射トリートメント<ol><li>以前に23を説明したようにゼブラフィッシュを維持します。 28.5℃の一定温度で供給される循環水を供給する水槽セットアップを使用、pHを6.8に調整 - 7.2と重炭酸ナトリウムとインスタントオーシャン海塩、と450〜550μSの導電率をそれぞれ。 8 Lタンクあたり15人の女性に15人の男性の飼育密度を維持し、実験に適するように、野生型またはトランスジェニックゼブラフィッシュラインを使用してください。午後11時 - 午前9時との間に日光の14時間に魚ファシリティ光サイクルを設定します。 </li><li>ゼブラフィッシュ産卵はライトが午前中に電源を入れたときに、光サイクルの開始時に開始する。最大の卵が魚を乱すことなく収集することができるようにするには、コレクションの前に夕方野生ストックタンクに（ゼブラフィッシュの専門家から入手可能なメッシュインサートを含む、）繁殖タンクを水没。 </li><li>収集し、茶こし、新鮮な水槽の水を使用して卵を洗い流した後、魚が産卵するための40分 - コレクションの日に、30を許可する。胚培地を含む90ミリメートルペトリ皿にきれいに卵を堆積し、28.5℃でインキュベートする。 </li><li>メラノを阻害するためにPTUで胚を扱う創世記。 8 HPFでは、1を含む新鮮なペトリ皿に最小限の液体中の生存胚を転送：胚培地に100 PTUをし、さらに72 HPFまで28.5℃でインキュベートする。 注：PTUので8 HPF段階を投稿する制限する必要があり、以前の段階で使用した場合発達障害を引き起こす可能性がありますが、遅くとも24 HPFとして扱うことができます。 PTUの後期に加え、完全に目の色素沈着をブロックするが、一般的には成功したとトランクメラニン形成を阻害されていません。 </li></ol> 3.マイクロインジェクション注：心膜は心臓を包むが、心膜キャビティ内の流体によって保護と心臓の動きを容易にするために分離されている。この手順の目的は、これは、脈管系への染料の迅速な取り込みを可能にする、心膜腔にRDを注入することである。 <ol><li> 6μlのロード針は - microloaderのヒントを使用して、RDに希釈し、マイクロマニピュレーターの針ホルダーに固定します。細かいティップを使用した針の端を破るED鉗子（ 図1A）。一度完全なミリ秒に切り替える、微細な設定にパルス持続時間を最大化することにより、針の先端にRDソリューションを移動します。 </li><li>直径が100μmに放出液滴のサイズを調整する（鉗子を用いて）針先端の長さに対するステージマイクロメーター、圧力調整器、および改良を使用し、これは0.5 nlの体積（ 図2A）に等しい。 注：針を壊した場合、それ以外の場合は難しい注入量を校正するようになりますからあまりを壊さないように注意してください。必要であれば、さらなる液滴サイズを増加させるために針の先端を破るが、過度の屈曲または組織に損傷を与えることなく、心膜への進入を可能にする針の厚さを維持する。 </li><li>注射の前に、トリカインを含む胚培地中で胚を麻酔。 5ミリリットル胚培地、ラベル1」トリカイン」と他の「回復」を含む2×35ミリメートルペトリ皿を設定します。 </li><li> 200を追加適切に標識された皿に株式トリカインのμL。注入する準備ができたら、72 HPFで個々の胚を選択して、トリカイン皿に最小限の液体中に移す。胚のアクティビティを監視し、胚を麻酔と切り捨てmicroloaderチップを用いて穏やかな攪拌により固定化されたテスト。 </li><li>射出成形金型に麻酔をかけた胚を移し、左側が視野の左に心を配置する、上を向いているので、アガローストラフ内の胚を方向付ける。 </li><li>心にRDを注入するために、針で心膜を貫通し、麻酔した胚（ 図2B、右パネル）の心膜腔にRDの1 NLを注入する。注射後に針を撤回。 「回復ディッシュ &#39;に最小限の液体中に注入された胚を移し、1分間監視します。適切に1ミリリットルの新鮮胚培地（PTUを含む）とラベルを含む24ウェルプレートに、個々の胚を転送します。 注意：心膜は厳しいです、しかし心膜が腹-尾咽頭アーチと背吻側卵黄嚢（ 図2Bの矢印）を満たしている交差点で注目すべき弱点があります。針はこの溝に向けられるべき。針が所定の位置にあるときに、マイクロマニピュレータの上に指をしっかりとタップが心膜腔への侵入を容易にする。 </li><li> 、実験群あたり少なくとも10の胚のために3.6別々のウェル内の各魚を置き、独自にlabelto許可個々の実験的なフォローアップ - 繰り返して、3.2を繰り返します。 3時間28.5℃でインキュベートする。 </li></ol> 4.イメージング買収<ol><li>前述のように3時間後に注射（hpiの）で胚を麻酔し、3％メチルセルロースを含む35ミリメートルのペトリ皿に移す。静かメチルセルロースに胚をプッシュし、側面を画像化することができるので、方向付ける。 </li><li>可視化oについてフィルターを使用して、UV下での胚の画像を取得する570nmで（ 図2C）で放出された光fは。画像取得後、胚がよく指定されたに交換する前に回復することができます。すべての注入した胚のための画像を取得し、さらに28.5℃でインキュベートする。 注：このプロトコルでは、我々はTXRフィルターセット、DFC300FXカメラと、それぞれのアプリケーション·ソフトウェアと蛍光実体顕微鏡を使用していました。次の画像取得のための正確な取得の設定をメモします。 </li><li>上記のように24 HPIでは、画像の第二ラウンドを獲得。すべての画像が取得された後、3 HPIと24 HPIの両方で、人道的に胚を処分するか、他の実験的な手段例えば、免疫組織化学のために使用します。 </li></ol> 5.画像処理<ol><li> NIHのImageJソフトウェアを用いて画像を解析することによって、3のhpi、24 hpiので、各注入された胚の蛍光強度を定量化する。 、蛍光強度を測定したImageJで画像を開いて、1から関心領域（ROI）を指定するには00 PX 2（編集→選択→指定）。 </li><li> ROI（ 図2C）の中心に心を置き、（→対策の分析）測定を行い、（→セットの測定値を分析します）は、平均グレースケールと面積を含めるように測定値を設定する。胚あたり、3 HPIと24 HPIで、画像のセットごとに記入し、さらなる処理のためにスプレッドシートに平均グレイスケール値を転送する。 注：これは、胚間の個々の心をも包含するとして、私たちは100 PX 2の固定ROIサイズを選択しました。心臓が原因の前に腎臓に入る血液の蛍光量を測定するために便利な場所を可能にする、その大きなサイズに測定を行うために選択した。 </li><li>適切な統計ソフトウェアを使用して統計分析を実行します。スチューデントのt検定を用いて統計的有意性のためのグループを比較する。 </li></ol>

<ol><li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+in+zebrafish%3A+a+novel+system+to+study+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).</li>
<li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+zebrafish+kidney%3A+a+tale+of+two+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes.</a> Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).</li>
<li>Ma, M., Jiang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged2a-notch+signaling+mediates+cell+fate+choice+in+the+zebrafish+pronephric+duct%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct.</a> PLoS Genet. 3 (1), e18(2007).</li>
<li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li>
<li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).</li>
<li>Cardenas-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+CCDC28B+reveals+its+role+in+ciliogenesis+and+provides+insight+to+understand+its+modifier+effect+on+Bardet-Biedl+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome.</a> Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).</li>
<li>Osborn, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+FTO+antagonises+Wnt+signaling+and+leads+to+developmental+defects+associated+with+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies.</a> PLoS One. 9 (2), e87662(2014).</li>
<li>Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+body+stability+and+ciliogenesis+requires+the+conserved+component+Poc1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1.</a> J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).</li>
<li>Tobin, J. L., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+renal+function+in+zebrafish+models+of+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies.</a> Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).</li>
<li>Torres, V. E., Harris, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease%3A+the+last+3+years%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years.</a> Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).</li>
<li>Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease+-+clinical+and+genetic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Blood+Press+Res%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects.</a> Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).</li>
<li>Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystic+kidney+disease.+1%3A+Identification+and+analysis+of+the+primary+defect%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect.</a> J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).</li>
<li>Reynolds, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+splicing+in+the+PKD2+gene+as+a+cause+of+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease.</a> J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).</li>
<li>Pazour, G. J., San Agustin, ajt, Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystin-2+localizes+to+kidney+cilia+and+the+ciliary+level+is+elevated+in+orpk+mice+with+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease.</a> Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).</li>
<li>Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polycystic+kidney+disease+proteins%2C+polycystin-1%2C+polycystin-2%2C+polaris%2C+and+cystin%2C+are+co-localized+in+renal+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia.</a> J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).</li>
<li>Baker, K., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+sense+of+cilia+in+disease%3A+the+human+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+C+Semin+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies.</a> Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).</li>
<li>Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+and+signaling+pathways+in+mammalian+development%2C+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Physiol%22%5BJournal%5D)">Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease.</a> Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).</li>
<li>Hruscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR%2FCas9+genome+editing+with+low+off-target+effects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish.</a> Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li>
<li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+morpholino+experiments%3A+don%27t+stop+making+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).</li>
<li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish%3A+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li>
<li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio)</a>. , 4th, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Forsythe, E., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bardet-Biedl+syndrome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Bardet-Biedl syndrome).</a> Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).</li>
<li>Corbetta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+simple+kidney+cysts+in+patients+with+primary+hyperparathyroidism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol+Invest%22%5BJournal%5D)">High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism.</a> J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).</li>
<li>Veleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Bardet-Biedl+syndrome+gene+BBS9%2FPTHB1+leads+to+cilia+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects.</a> PLoS One. 7 (3), e34389(2012).</li>
<li>Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVize%2C+P+%22The+Kidney%3A+From+Normal+Development+to+Congenital+Disease%22">The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease</a>. , Academic Press. (2003).</li>
<li>Chang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permselectivity+of+the+glomerular+capillary+wall+to+macromolecules.+II.+Experimental+studies+in+rats+using+neutral+dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran.</a> Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

ゼブラフィッシュは、人間の遺伝病をモデル化するための貴重なツールを提供し、in vivoでの研究のための科学的な楽器としてのそれらの使用は、腎臓を含む多くの生物学的システムの遺伝内訳の詳細な研究を可能にしてきた。多くは今ゼブラフィッシュ腎臓の発達や機能方法について理解されている。病気の原因遺伝子と人間の腎形成と相同性に印象的な類似点21は、ゼブラフィッシュは、腎疾患の病理に遺伝子機能のリードでどのような欠陥を理解する上で基本となっているかを解説しました。確かに、遺伝子操作が楽に、アンチセンスモルホリノノックダウン技術や、TALENSまたはCRISPRなど、より高度な目標とゲノム編集ツールを使用して、ゼブラフィッシュで達成することができる。疑われる腎疾患の原因遺伝子についてのノックダウンまたは変異体のモデルを作成すると、疾患発現への関与を理解する上で最初のステップです。これを行うには、腎機能の信頼できるアッセイが求められている候補遺伝子は、おそらく患者において観察病理の原因であるかどうかを示す。 腎機能検査は一般的に血液や尿中に存在する溶質のレ...

ヒト腎臓は、血液からの代謝老廃物を濾過し、細胞の恒常性を維持するために必要な溶質を回収することに重要な役割を果たしている。腎機能障害の原因となるヒトの遺伝疾患がいくつかあります。最も一般的な遺伝性腎疾患は腎炎尿細管内の流体満たされた嚢の開発によって特徴付けられる常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）です。嚢胞形成に起因する損傷は、腎臓機能10にとって有害である。 1,000 8占める-末期腎不全（ESRF）11の患者の10％：800から1：ADPKD 1の発生がある。いくつかの遺伝子は約85％と、それぞれ12,13症例の15％を占め、ポリシスチン1（PKD1）および-2（PKD2）を含む、ADPKDを引き起こすことが関係している。さらに、遺伝子PKD1のための製品と-2は、繊毛に局在し、繊毛形成14,15の基本である。として知られているヒトの遺伝性疾患の認識の家族は、用意されました繊毛の機能に影響を与え、CKD 16もたらすciliopathies。 毛様体の発達と機能に影響を与える人間の遺伝性疾患の増加数は、このかつて考えられて残留細胞小器官におけるグローバル関心を集めている。繊毛、毛様細胞性突起は、重要な細胞シグナル伝達事象の伝達に必要な受容体及びイオンチャンネルに濃縮される。繊毛は、一般的に、または一重微小管の中央ペアなしで9放射状に配置された微小管のダブレットに構造化微小管ベースの軸糸で構成されています。軸糸構造は、繊毛作用の種類とモードを定義します。 9 + 2微小管の配置は、それが上皮表面を横切る流体の移動に利用されている繊毛に運動を付与する。 9 + 0構成は、非運動性であるが、主に細胞のシグナル伝達事象17において機能すると考えられている。別にCKDから、毛様体機能障害の影響は、特徴のセットです、肥満、網膜変性、多指症、及び認知障害16を含むciliopathy機能。しかし、CKDは、患者の生活の質に最も有害なので、毛様体関連CKDのためのin vivoモデルで適切なの発展の主要な推進力の中で。 ゼブラフィッシュは、人間の遺伝病の病因を理解するための優れたモデルです。彼らの迅速な開発は、卵の大多数、透明な組織、および子宮外の成長の生産は、ゼブラフィッシュの発生過程を可視化し、生物学的事象が、かなり簡単に操作することができるようになります。遺伝子は、遺伝的に、ゲノム編集ツール（CRISPR 18とTALENS 19）の最近の成功を使用して変更するアンチセンスモルホリノ技術20を用いてノックダウン、または薬理学的に彼らの水生環境に対する化合物の添加によって調節することができる。確かに、ゼブラフィッシュは、電子を実施するためのプラットフォームを提供します他の動物モデルにおいて許容されないxperiments。ゼブラフィッシュ一方で、彼らは人間と共通する多くの機能的に保存された臓器、遺伝子、およびシグナル伝達プロセスを共有する（ヒトに比べて）比較的単純な脊椎動物である。例えば、ゼブラフィッシュの腎臓は、人間21,22に比べて構造及び機能で非常に似ています。しかし、位相の連続を通じて開発した哺乳動物の腎臓とは異なり、それぞれがより発展腎臓（前腎、中腎、および後腎）でマークされ、胚のゼブラフィッシュは、前腎、腎臓の最も未熟型を開発しています。ネフロン数百万の哺乳類の腎臓のビルディングブロックを形成見つけることができる一方で、ゼブラフィッシュ胚2つだけを持っている。初期の血液濾過液を可能に糸球体は、大動脈のちょうど腹側正中で融合されている。排出腔を経由して終了する前に融合させ、軸に沿って尾側に実行する前腎細管への糸球体を通して血液フィルター。前腎TUbulesは重く尾側の出口3,4に向けたろ液の流れに許容され、運動性繊毛と繊毛されている。この単純な前腎構造は、彼らが最終的にはより複雑な中腎構造21へと発展幼虫の成長の数週間を通じてゼブラフィッシュの恒常性を維持します。しかし、ゼブラフィッシュは、後腎21を開発したことがない。ゼブラフィッシュ特異性にもかかわらず、ゼブラフィッシュネフロンは、哺乳類で観察されたものと同等の遺伝子発現プロファイルでセグメント化され、したがって腎形成3,22のための生体モデルで他の追随を許さないを提供しています。 日常的に患者の血液および尿検査の一連の腎機能について試験される。典型的には、血液を溶解した塩、尿素およびクレアチニンについて分析する。尿素、クレアチニンおよび異常な塩濃度の高いレベルは、腎機能の問題を示している。比色ディップスティックを使用して尿検査は、タンパク質、する当館の異常なレベルを検出し、dは、膿、細菌および尿サンプル中に存在する糖。 10ミリリットルの血液 - このようなテストは、通常、約30ミリリットルの尿または5が必要です。これは、主として、アッセイを行うために十分な血液や尿を収集不可能な性質のために、そのようなゼブラフィッシュのような生体内モデル生物、 小にこれらのタイプのアッセイを翻訳することは困難であった。ここでは、適切なゼブラフィッシュ腎機能検査の不足に対処し、その研究のための革新的な技術が記載されている。血流中に蛍光色素を注入することにより、我々は、腎臓を介して血液からろ過し、蛍光活性の排泄を監視し、個別に時間をかけて定量化することができる。この方法では、我々は、例を提供する病気によって引き起こされる腎障害を研究するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>P-97 SUTTER フレーミング/ブラウンタイプマイクロピペットプーラー</td><td>Intracel</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸標準壁毛細血管</td><td>ハーバード装置</td><td>30-0017</td><td></td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>VWR International</td><td>631-0109</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ樹脂接着剤</td><td>Evo-Stik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ローダミンB 10,000 MW ラベル付きデキストラン</td><td>ライフテクノロジー&nbsp;</td><td>D-1824</td><td></td></tr><tr><td>N-フェニルチオ尿素&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>エアコンプレッサ&nbsp;</td><td>ジュンエア</td><td>OF302-15</td><td></td></tr><tr><td>ピコスプリッツァーIII.&nbsp;</td><td>パーカー・インスツルメンツ&nbsp;</td><td>051-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>小型3軸制御マイクロマニピュレーター&nbsp;</td><td>マルツハウ</td><td>ザーMM33&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>解剖実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダーチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>ステージマイクロメータ&nbsp;</td><td>パイザー- SGI</td><td>02A00404</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

ゼブラフィッシュ胚は、器官形成を研究し、人間の遺伝病をモデル化するための扱いやすいモデルを提供しています。その相対的なシンプルさにもかかわらず、ゼブラフィッシュ腎臓が開発し、人間とほぼ同じように機能します。ヒト腎臓の建設に大きな違いは、唯一の2があるゼブラフィッシュに比べネフロンの数百万の存在である。しかし、基本的な機能単位にそのような複雑なシステムを簡素化することは、腎臓が開発し、どのように動作するかの理解を助けている。ゼブラフィッシュでは、正中線に位置する糸球体は、排出腔で互いに融合する前に、胚軸上下左右対称に実行するように分岐する2前腎細管への最初の血液濾過を担当しています。前腎 ​​細管は重く最終的に排出腔2-4を経由して、終了する前に、各種の溶質の交換を可能にする、セグメント化された尿細管に沿って、ろ液の移動を容易に運動性の繊毛が移入されている。 CKD株式会社の責任多くの遺伝子繊毛形成に関連するものをluding、ゼブラフィッシュ5に研究されている。しかし、主要なドローバック、遺伝子操作した後にゼブラフィッシュ腎機能を評価するのが困難となっている。ヒトで腎機能障害を測定するための伝統的なアッセイは、主に彼らの水生環境と小型サイズのため、ゼブラフィッシュに非翻訳を証明している。例えば、胚から血液を抽出するために、物理的に不可能であり、それらが小さすぎるように、尿素およびクレアチニン含有量の分析のために魚を上演した。また、ゼブラフィッシュは、多くの場合、最初の患者の検査中に実施されるシンプルな蛋白尿「ディップスティック」、上のテストのための十分な尿を生成しない。我々は、腎機能1,6-9からの読み出しを与えるように、血管系から出腎臓を介して、経時的に、定量的蛍光色素のクリアランスを監視するためにゼブラフィッシュの光透過性を利用した蛍光アッセイを記載する。

全世界で16万人16：バルデ-ビードル症候群（BBS）は約1に影響を与える稀な異質ciliopathyです。多嚢胞腎臓を含む関連する問題の数が存在する患者は、その後の患者は頻繁に腎臓透析や移植が24を必要とする。 ESRFはCKD 16を開発した患者の約30％で、BBSの死亡の最も一般的な原因である。現在、20の非関連遺伝子が公表遺伝子型 - 表現型関連でBBSに関与している。 BBSタンパク質は、患者の特性特性とともに、ciliopathy診断を推測、繊毛と基底ボディ内の共通タンパク質局在化ドメインを共有しています。 BBS9が一緒に他のBBS（BBS1、BBS2、BBS4、BBS5、BBS7、BBS8）タンパク質とParathyoidホルモン応答B1（PTHB1）タンパク質をコードするコアは一次繊毛24の形成に関与する複雑なBBSome形成する。 BBS cの6％のためのBBS9アカウントの変異のAS 24。また、PTHはゼブラフィッシュにおけるbbs9機能の喪失は、...

ゼブラフィッシュは、慢性腎臓病（CKD）をモデル化するための一般的なツールである。しかし、それらの小さいサイズは、それが不可能な従来の方法を使用して腎機能を評価することを可能にする。私たちは、CKDにおけるゼブラフィッシュ腎臓機能の定量的な分析を可能にする蛍光色素腎クリアランスアッセイ1を記述する。

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

本手順の総合的な目的は、ゼブラフィッシュにおける定量的な腎機能アッセイを構築することである。まず、受精後72時間（72 HPF）のゼブラフィッシュ胚を麻酔させる。次に、胚を注入用モールドに移し、心臓が視野の左側にくるように配置する。次に、心膜腔にルミン・デキストラ蛍光染料を注入し、エピ蛍光解剖顕微鏡を用いて心臓領域の蛍光画像を撮影します。最終的に、エピ蛍光顕微鏡を用いて蛍光染料の腎排泄能を評価します。この手法の主な利点は、ゼブラフィッシュでは困難な血液検査や尿検査を行うことなく、ゼブラフィッシュの腎機能を定量的に読み取れる点にあります。この手法は、ゼブラフィッシュの疾患モデルにおいて腎機能を評価するための強力なツールとなります。テキストプロトコルに従って針を引き抜き、型を準備した後、まず魚用水で調製した2%アガロース溶液を90 mmのペトリ皿に注ぎ、型を鋳造します。型をペトリ皿の上に置き、重ねたスライドの端がアガロース表面下に傾いた状態で浸かるようにします。30分間静置します。スライドキャストを取り除き、trica麻酔剤を1:25の割合で含有させた新しい魚用飼育水を使用します。スライドに転写した個体を覆い、ゼブラフィッシュに蛍光色素の注入を行います。エアコンプレッサー、圧力レギュレーターシステム、および外径1.0のキャピラリーに使用するストレートピペットホルダーで構成される標準的なマイクロインジェクション装置を使用します。ピペットホルダーはMN 33コンパクト内に設置してください。磁気スタンドでスチール製ベースプレートに固定された3軸制御マイクロマニピュレーターと、解剖顕微鏡を使用して、テキストプロトコルに記載された標準条件で維持されたゼブラフィッシュの胚を可視化、操作、および注入します。実験に応じて、野生型または遺伝子組換えのゼブラフィッシュ系統を使用します。魚にストレスを与えず最大限の卵を回収できるよう、8Lのタンクあたりオス15匹とメス15匹の飼育密度を維持します。回収の前夜に、繁殖タンクを野生型のストックタンクの中に沈めておきます。採取日に、魚に30～40分間産卵させます。次に、メッシュストレーナーと新鮮な飼育水を用いて卵を回収し、洗浄します。洗浄した卵を、胚培地を含む90 mmのペトリ皿に移し、筋形成を抑制するために28.5 °Cでインキュベートします。受精後8時間（HPF）に、生存している胚を最小限の液体とともに、1-phenyl-2-thiourea（PTU）を100 µM添加した胚培養液を含む新しいペトリ皿に移し、28.5 °Cでさらにインキュベートします。先端の細いピンセットを使用して、ニードルの端を折ります。次に、パルス幅を最小設定まで最大にして、RDをニードルの先端まで移動させます。溶液が先端に達したら、設定をミリ秒に戻します。マイクロメーターを顕微鏡ステージ上に配置し、圧力レギュレーターとニードルチップの微調整を用いて、注入前の排出液滴のサイズを直径100ミクロン、または体積0.5ナノリットルに調整します。35ミリメートルのペトリ皿を2枚用意します。それぞれに5ミリリットルの胚培地を入れ、一方に「trica」、もう一方に「recovery」とラベルを貼ります。ストックtricaを200 µL、tricaとラベルされたディッシュに加えます。注入の準備が整ったら、72 HPFの個別の胚を選択します。最小限の液体をtricaディッシュに移し、胚の活動を観察します。胚を麻酔した後、注入用モールドに移し、左側が上になるように溝の中で方向を調整します。心臓を視野の左側に配置します。RDを心臓に注入するには、針で心膜を貫通させ、心膜腔に1 nanoliterのRDを注入します。針を抜いた後、注入した胚を最小限の液体とともに回収ディッシュに移し、1分間観察します。次に、個々の胚を、PTUを含む新鮮な胚培養液1 mLが入った24ウェルプレートに移し、適切にラベルを貼ります。実験群あたり少なくとも10個の胚に注入した後、28.5 °Cで3時間インキュベートします。注入後3時間（HPI）に、既述の方法で胚を麻酔します。その後、3%メチルセルロースを含む35 mmペトリ皿に移します。胚をメチルセルロースの中にそっと押し込み、側面を撮影できるように向きを調整します。UV光用に570ナノメートルのエミッションフィルターを使用し、胚の画像を撮影します。胚を回復させた後、指定のウェルに戻し、すべての注入済み胚の画像を撮影して、引き続き28.5°Cでインキュベートします。24 HPに2回目の画像撮影を行った後、Image Jソフトウェアを用いて、画像を開き関心領域（ROI）を指定することで、各注入済み胚の蛍光強度を定量化します。「選択範囲を編集」を選択し、値を100正方形ピクセルに指定して設定します。ROIの中央に心臓を配置し、「解析」を選択して「測定設定」を開き、平均グレースケールと面積を測定項目に含めます。その後、測定を行い、胚ごとに3 HPIおよび24 HPIの各画像セットの蛍光強度を定量化し、さらなる解析のために平均グレースケール値をスプレッドシートに転記します。適切なソフトウェアを使用して統計解析を行い、ここで示すようにStudent's T-testを用いて群間の統計的有意性を比較します。bbbs nine Morphoを注入した魚にRDを注入したところ、受精後5日までに胚の40%に前脳嚢胞が形成されました。さらに、Morpho注入魚は、対照群と比較して、注入後24時間（HPI）における蛍光色素の除去能力の低下を示しました。10匹の魚のグループにつき、15分以内に注射を完了させる必要があります。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュの光学的な透明性を利用し、微量注入した蛍光色素の経時的な消失を定量的にモニタリングすることで、ゼブラフィッシュの腎機能を効果的に評価する方法について十分に理解できるはずです。

evaluation-zebrafish-kidney-function-using-fluorescent-clearance

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は2日後fetilization（DPF）急性腎障害（AKI）を誘導するためにゼブラフィッシュの幼虫にアミノグリコシド、ゲンタマイシンを、マイクロインジェクションのテクニックを説明します。我々はまた、AKIの媒介の損傷を可視化するためにゼブラフィッシュ幼生の埋め込みプラスチックと切片全体のマウント免疫組織化学のための方法を、説明します。...

急性腎障害を研究するためにゼブラフィッシュ幼生の静脈内Microinjections

細胞移植は、組織の再生を研究するための、病気の細胞ベースの治療法を開発するために必要不可欠な技術です。ここでは、成人のゼブラフィッシュの魚の腎臓に直接遺伝的に標識された細胞の移植を可能に顕微鏡下手術を示しています。...

直接アダルトゼブラフィッシュの腎臓への細胞の移植

ゼブラフィッシュの腎臓は、腎臓および造血両方成人の幹細胞/前駆細胞の本拠地であり、これらの細胞型と脊椎動物のモデル生物でそれらの子孫を研究する優秀な機会を表しています。ここでは、このような細胞の単離、移植、および腎臓および/または血液細胞集団の発現の研究​​などのアプリケーションに使用することができる大人のゼブラフィッシュの腎臓を、特定し、外科的に除去する研究者を可能にする詳細な解剖の手順を示しています。...

アダルトゼブラフィッシュ腎臓の解剖

このビデオでは、成魚の腎臓の色素脱失とその後の染色手順の準備を示しています。染色後、成体のゼブラフィッシュの腎臓は、腎臓の再生、腎疾患モデルの表現型の特徴付け、およびネフロンの機能の研究に使用できます。...

ゼブラフィッシュ腎臓の色素脱失と染色:成体ゼブラフィッシュ腎臓の染色準備技術

ゼブラフィッシュ成体の腎臓は腎臓の再生や病気の研究のための優れたシステムです。このような研究の重要な側面は、ネフロンの構造と機能の評価である。このプロトコルは、ネフロンの尿細管組成を評価し、腎再吸収を評価するために実施することができるいくつかの方法論を記載している。...

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

ここでは、ゲンタマイシン注射による急性腎障害を誘発することにより、成人の腎臓再生を研究するための信頼性の高い方法を紹介します。損傷はゲンタマイシンの投与量と環境温度に依存することを示し、in situハイブリダイゼーションを使用してlhx1a...

ゲンタマイシン誘発性損傷によって大人ゼブラフィッシュにおける腎再生

ゼブラフィッシュは、脊椎動物の発生過程とモデルヒト疾患を研究するための優れた実験的な生物である。ここでは、読み出しをホールマウントin situハイブリダイゼーション （WISH）とゼブラフィッシュ胚で手動ハイスループット化学画面を実行する方法についてのプロトコルを記述します。...

ゼブラフィッシュ胚を用いた高スループットへのアプローチマニュアル小分子スクリーン

ここで説明する方法は、焦点平面ドリフトを補正する光学切片および再調整の単純な戦略を実行することができる顕微鏡解剖蛍光を用いて、ゼブラフィッシュ胚における器官の発達の時間経過解析を可能にします。...

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

抗生物質から化学療法に至るまで薬物が含まnephrotoxinsから発生腎損傷は、その病因が完全には理解のまま、複雑な障害をもたらすことができます。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの腎臓保護措置の同定に適用することができ、これらの条件、疾患のモデリングのために使用することができる方法を示します。...

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

この研究は、腎臓GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた分節型腎障害の新しいインビボモデルを提示する。このモデルは、腎上皮細胞の標的アブレーションの誘導を可能にし、ネフロン傷害および修復の細胞機構を示す。...

ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法

このプロトコルは、腎毒性物質としてシスプラチンを使用して、成体ゼブラフィッシュに急性腎損傷(AKI)を誘導する手順を記述する。この技術の再現性を評価するステップと、腎組織、フローサイトメトリー、TUNELの炎症と細胞死を分析する2つの技術を詳述した。...

成体ゼブラフィッシュにおけるシスプラチンによる急性腎損傷モデル

学ぶ 蛍光クリアランスアッセイによるゼブラフィッシュ腎機能の定量評価法。72時間胚にルミン・デキストラン蛍光色素を心膜腔に注入し、エピ蛍光顕微鏡で観察することで、非侵襲的に腎機能を測定し慢性腎臓病研究に応用する。

蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

さらに動画を探す