開発インビトロアッセイは、間葉細胞受けた上皮間葉移行の収縮機能を評価します
June 10th, 2016
ここでは、上皮間葉転換を経験した間葉系細胞の収縮機能を評価するためのゲル収縮アッセイの開発と応用について説明します。
この手順の全体的な目標は、in vitro 炎症性サイトカイン誘発上皮間葉転換 (EMT) を受けた間葉系細胞の収縮性を評価することです。この間葉系は、特発性肺線維症や重度の喘息における気道リモデリングなどの炎症性免疫応答によって誘発されるEMT後の基本的な細胞機能のバリエーションです。この技術の主な利点は、特定のデバイスを必要とせず、高い内容を示すことです 手順をデモントするのは、私の研究室の竹島秀之と牧田浩介の大学院生になります。
まず、A-549ヒト肺上皮細胞の培養物を5〜10ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、37°Cと5%の二酸化炭素で2ミリリットルのトリプシン-EDTAで接着細胞を剥離します。3分後、細胞懸濁液を細胞培養培地が入った円錐形のチューブに移し、遠心分離機で細胞をスピンダウンします。
ペレットを2ミリリットルの細胞培養培地に再懸濁し、カウント用に小さなエロコートを確保します。その後、10センチメートルのポリステレン皿あたり10ミリリットルの培地に0.5〜1回10〜6番目の細胞を播種し、細胞培養物を24時間インキュベートします。EMT導入の場合、翌日、細胞を10マイクロリットルのTGFベータ1およびTNFアルファで処理し、プレートをさらに48時間インキュベーターに戻します。
4日目に、EMT誘導培養物を5〜10ミリリットルのPBSで洗浄し、次に、示したようにトリプシンEDTAで細胞を剥離します。次に、トリスプシン阻害剤を添加したDMEM中の細胞懸濁液をスピンダウンし、ペレットを500マイクロリットルのpbsに再懸濁します。次に、細胞を数え、調製したばかりのゲル培地をウェルあたり10の3倍の密度で5番目の細胞に加え、ゲル化する前にピペットで溶液を穏やかに、しかし迅速に混合します。
迅速かつ慎重に、0.5ミリリットルの細胞を、きちんとした円筒形の未処理の24ウェルプレートの各ウェルに分注します。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに15分間置きます。ゲルが完全に固まったら、滅菌したスパチュアラを各ゲルの外側を一方向に円を描くように動かして、ゲルをプレートから壊さないようにします。
ゲルを取り出すときは、ヘラをウェル内で前後に動かさないように注意してください。次に、スパチュラを使用して、TGFベータ1およびTNFアルファの有無にかかわらず、1パーセントFBSを添加した5ミリリットルのDMEMを含む個々の16ミリメートル組織培養皿にゲルを穏やかに移します。最後に、皿を静かに振ってゲルが培地に浮いていることを確認し、ゲルを細胞培養インキュベーターに戻します。
未処理のa541細胞は、上皮細胞の特徴である丸石のような三角形の外観を示します。しかし、TGFベータ1およびTNFアルファによる刺激後、細胞は、同期性細胞で観察されるものと同様に、長い紡錘形を示します。EMT前後の上皮および間同期マーカー発現のQRTCPRは、炎症性サイトカインで48時間処理したA541細胞がCDH1の発現を有意に減少させ、VIAMおよびACTA2の発現を有意に増加させることを明らかにしています。
さらに、これらのサイトカインによる刺激は、西洋の血液分析によって決定されるようにE-カドヘリンの発現を減少させますが、ビメンチンN-カドヘリンおよびアルファ平滑筋アクチンの発現は誘導されます。ゲル収縮アッセイでは、48時間後、TGFベータ1およびTNFアルファ処理細胞を含むゲルは、PBSで処理された細胞を含む制御ゲルよりも小さくなります。実際、72時間後、サイトカイン処理ゲルを含むゲルのサイズは、ゲル分析装置で測定した制御ゲルと比較して大幅に縮小します。
観察されたように、ゲルの収縮ステップは、適切に実行されれば3時間で完了することができます。この手順を試行する際は、ゲル収縮アッセイを実行する前に、EMTが正常に誘導されたことを確認することを忘れないでください。観察後、この技術は、線維症や肺のリモデリングなどの炎症状態におけるEMTプロセスを変化させる方法を提供します。
このビデオを見た後、EMTを持つ細胞を一種のcuagenterに放出し、培地で泡立てる方法についてよく理解しているはずです。
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概要
この記事では、上皮間葉転換（EMT）を経験した間葉系細胞の収縮機能を評価するために開発されたゲル収縮アッセイについて説明します。この技術は、炎症性サイトカインが細胞の挙動に与える影響を研究する上で特に関連性があります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 神経科学
- 炎症研究
背景
- 上皮間葉転換（EMT）は様々な疾患において重要なプロセスです。
- 炎症性サイトカインは肺上皮細胞においてEMTを誘導することができます。
- この転換は特発性肺線維症や重度の喘息などの状態と関連しています。
- 間葉系細胞の収縮性を理解することは治療戦略に不可欠です。
研究の目的
- EMT後の間葉系細胞の収縮性を評価する。
- 専門機器を必要としない簡単なアッセイを開発する。
- 炎症性環境における細胞の挙動の理解を深める。
使用した方法
- A-549ヒト肺上皮細胞をPBSで洗浄する。
- トリプシン-EDTAを使用して細胞を剥離する。
- 遠心分離機で細胞を回転させる。
- ゲル収縮アッセイを通じて収縮機能を評価する。
主要な結果
- このアッセイは間葉系細胞の収縮性を効果的に測定します。
- 高い内容と再現性を示します。
- 結果はEMT後の細胞の挙動に有意な変化があることを示します。
- この技術は様々な研究応用にアクセス可能です。
結論
- ゲル収縮アッセイはEMTを研究するための価値あるツールです。
- 間葉系細胞の収縮特性に関する洞察を提供します。
- この方法は炎症性疾患に関するさらなる研究を促進する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mesenchymal cell contractility following epithelial-mesenchymal transition (EMT) addresses a critical gap in early fibrosis research and target validation. This in vitro gel contraction assay enables mechanistic de-risking by linking cytokine-induced EMT to functional outputs relevant for disease modeling and therapeutic hypothesis testing. The approach supports predictive confidence at the discovery-to-preclinical inflection point for fibrosis and tissue remodeling portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EMT-driven contractile phenotypes in response to inflammatory cytokines.
- Supports biological de-risking by functionally validating mesenchymal transition in disease-relevant contexts.
- Facilitates predictive confidence in target selection for fibrosis and remodeling indications.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible assay for quantifying contractile function post-EMT.
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative analysis across experimental conditions.
- Prepares validated cell systems for downstream compound screening or mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro contractility measurements with fibrotic disease mechanisms observed in vivo.
- Enables continuity from discovery-stage EMT models to preclinical evaluation of anti-fibrotic strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by linking molecular changes to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This assay positions within the early discovery to preclinical continuum, bridging mechanistic EMT studies and functional validation of fibrotic targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on EMT induction and contractile phenotype emergence.
- Screening: Offers reproducible, quantitative contractility readouts for assay-ready systems.
- Analytics: Enables statistical comparison of gel contraction across cytokine treatments and controls.
- Translational Research: Connects in vitro EMT contractility to disease-relevant fibrotic endpoints.
- Enterprise Reuse: Provides a broadly applicable platform for EMT and fibrosis research across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EMT-driven fibrosis models and target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and device-independent contractility assessment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking molecular EMT markers to functional outputs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-fibrotic and tissue remodeling assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, EMT induction, and quantitative image analysis.
- Needs access to standard tissue culture and gel handling infrastructure.
- Demands cross-team standardization of EMT induction and contractility measurement protocols.
- Adaptable to various epithelial cell lines and cytokine conditions as supported by the protocol.
- Dependent on confirmation of EMT induction prior to contractility assessment.
