開発インビトロアッセイは、間葉細胞受けた上皮間葉移行の収縮機能を評価します

この手順の全体的な目標は、in vitro 炎症性サイトカイン誘発上皮間葉転換 (EMT) を受けた間葉系細胞の収縮性を評価することです。この間葉系は、特発性肺線維症や重度の喘息における気道リモデリングなどの炎症性免疫応答によって誘発されるEMT後の基本的な細胞機能のバリエーションです。この技術の主な利点は、特定のデバイスを必要とせず、高い内容を示すことです 手順をデモントするのは、私の研究室の竹島秀之と牧田浩介の大学院生になります。

まず、A-549ヒト肺上皮細胞の培養物を5〜10ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、37°Cと5%の二酸化炭素で2ミリリットルのトリプシン-EDTAで接着細胞を剥離します。3分後、細胞懸濁液を細胞培養培地が入った円錐形のチューブに移し、遠心分離機で細胞をスピンダウンします。

ペレットを2ミリリットルの細胞培養培地に再懸濁し、カウント用に小さなエロコートを確保します。その後、10センチメートルのポリステレン皿あたり10ミリリットルの培地に0.5〜1回10〜6番目の細胞を播種し、細胞培養物を24時間インキュベートします。EMT導入の場合、翌日、細胞を10マイクロリットルのTGFベータ1およびTNFアルファで処理し、プレートをさらに48時間インキュベーターに戻します。

4日目に、EMT誘導培養物を5〜10ミリリットルのPBSで洗浄し、次に、示したようにトリプシンEDTAで細胞を剥離します。次に、トリスプシン阻害剤を添加したDMEM中の細胞懸濁液をスピンダウンし、ペレットを500マイクロリットルのpbsに再懸濁します。次に、細胞を数え、調製したばかりのゲル培地をウェルあたり10の3倍の密度で5番目の細胞に加え、ゲル化する前にピペットで溶液を穏やかに、しかし迅速に混合します。

迅速かつ慎重に、0.5ミリリットルの細胞を、きちんとした円筒形の未処理の24ウェルプレートの各ウェルに分注します。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに15分間置きます。ゲルが完全に固まったら、滅菌したスパチュアラを各ゲルの外側を一方向に円を描くように動かして、ゲルをプレートから壊さないようにします。

ゲルを取り出すときは、ヘラをウェル内で前後に動かさないように注意してください。次に、スパチュラを使用して、TGFベータ1およびTNFアルファの有無にかかわらず、1パーセントFBSを添加した5ミリリットルのDMEMを含む個々の16ミリメートル組織培養皿にゲルを穏やかに移します。最後に、皿を静かに振ってゲルが培地に浮いていることを確認し、ゲルを細胞培養インキュベーターに戻します。

未処理のa541細胞は、上皮細胞の特徴である丸石のような三角形の外観を示します。しかし、TGFベータ1およびTNFアルファによる刺激後、細胞は、同期性細胞で観察されるものと同様に、長い紡錘形を示します。EMT前後の上皮および間同期マーカー発現のQRTCPRは、炎症性サイトカインで48時間処理したA541細胞がCDH1の発現を有意に減少させ、VIAMおよびACTA2の発現を有意に増加させることを明らかにしています。

さらに、これらのサイトカインによる刺激は、西洋の血液分析によって決定されるようにE-カドヘリンの発現を減少させますが、ビメンチンN-カドヘリンおよびアルファ平滑筋アクチンの発現は誘導されます。ゲル収縮アッセイでは、48時間後、TGFベータ1およびTNFアルファ処理細胞を含むゲルは、PBSで処理された細胞を含む制御ゲルよりも小さくなります。実際、72時間後、サイトカイン処理ゲルを含むゲルのサイズは、ゲル分析装置で測定した制御ゲルと比較して大幅に縮小します。

観察されたように、ゲルの収縮ステップは、適切に実行されれば3時間で完了することができます。この手順を試行する際は、ゲル収縮アッセイを実行する前に、EMTが正常に誘導されたことを確認することを忘れないでください。観察後、この技術は、線維症や肺のリモデリングなどの炎症状態におけるEMTプロセスを変化させる方法を提供します。

このビデオを見た後、EMTを持つ細胞を一種のcuagenterに放出し、培地で泡立てる方法についてよく理解しているはずです。