Name: 開発インビトロアッセイは、間葉細胞受けた上皮間葉移行の収縮機能を評価します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 学ぶ ゲル収縮アッセイを用いて、炎症性サイトカイン誘導上皮間葉移行後の間葉細胞の収縮機能を評価する方法です。A-549肺上皮細胞を使用し、特別な装置を必要とせず、高コンテンツで再現性のある結果が得られます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

技術的な助けをくださった小山正博士に感謝します。本研究は、日本学術振興会科研費 Numbers 23249045, 15K09211, 15K19172;厚生労働省からの呼吸不全研究グループへの助成金。アレルギー疾患と免疫学の研究助成。

1.準備と文化肺上皮細胞の<ol><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）、100 IU / mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養A549ヒト肺上皮細胞（付着細胞株）。 </li><li>取り外し、廃棄し、細胞培養培地を培養皿から5で1回洗浄 - リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlの。洗浄後、すぐにPBSを吸引。 </li><li> 3分間CO 2を 2 mlのトリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（0.05％）を添加し、37℃でインキュベートし、5％。 </li><li> 4分間室温でチューブは150×gで遠心分離、細胞培養培地を含む遠心管で剥離した細胞を収集します。 </li><li>細胞は、細胞培養培地2mlにペレット再懸濁し、細胞計数のためのサンプルを削除します。細胞生存率をチェックするためにトリパンブルー染色と血球計数器を用いて細胞数をカウントします。 </li><li>上のシードA549細胞0.5の密度で10cmのポリスチレンプレート-ゲル収縮アッセイ用培地10mlで1.0×10 6細胞/皿。 0.5の密度で6ウェルのポリスチレンプレート上の細胞をシード- 1.0×10 5細胞/ウェルとEMT確認のための培地2ml。 24時間37℃で細胞を、5％CO 2でインキュベートします。 </li></ol> 2. EMT手順<ol><li>ステップ1.6に播種ゲル収縮アッセイ用プレートにTGF-β1（5μg/ mlの）を10μlおよびTNF-αを10μl（10μg/ ml）を追加します。ステップ1.6に播種EMT確認用のプレートにTGF-β1（5μg/ mlの）2μlのとTNF-αの2μlの（10μg/ ml）を追加します。 37℃でインキュベートし、48時間、5％CO 2。 </li></ol> PCRとウエスタンブロッティングによるEMT手順の3.確認<ol><li>位相差顕微鏡を用いて処理した細胞の（石畳-等からのスピンドル形状に）形態の変化を確認してください。 注：ノームをアルA549細胞は、上皮細胞の特徴である敷石状や三角形の外観を持っていますが、TGF-β1及びTNF-αで刺激した後、細胞が長く表示され、スピンドルはそれが間葉系細胞14,15に似ている形。 </li><li>このようなE-カドヘリンなどの上皮マーカー、およびそのようなN-カドヘリン、ビメンチン、およびPCRまたはウェスタンブロット法を用いて、α平滑筋アクチンなどの間葉系マーカーの発現を評価します。 <ol><li> RNA抽出キット16を用いて細胞から全RNAを抽出し、製造業者のプロトコルに従って逆転写酵素17を用いてcDNAを合成します。 </li><li>リアルタイムPCRシステム18と製造業者の説明書に従って単量体シアニン色素PCRキットを用いてmRNAレベルの発現を測定します。 GAPDHに特異的なプライマー（グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）、ACTA2（α-アクチン-2）、CDH1（E-カドヘリン-1、E-カドヘリン）、及びVIM（ビメンチン）を表1に示します。 </st&gt;栄。 </li><li>溶解する溶解緩衝液（ 表2）1％プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む溶液を用いて細胞。タンパク質アッセイキット19,20を使用して、すべてのサンプルのタンパク質濃度を測定し、ポリアクリルアミドゲルへのタンパク質の同じ量を適用します。 <ol><li> SDSゲル電気泳動し、PVDF膜21へのタンパク質のセミドライトランスファーを行います。 2時間 - 1のためのブロッキング緩衝液中で一次抗体で膜をインキュベートします。インキュベーション後、洗浄緩衝液で2回、膜を洗浄し、二次抗体を有する膜で1時間インキュベートします。 注：これらの研究において使用される抗体および希釈液のためのマテリアル/機器の表を参照してください。ブロッキング緩衝液の構成要素については、 表2を参照してください。 </li><li>二回洗浄緩衝液で膜を洗浄します。冷たいCCDカメラ11,23を用いてウェスタンブロッティング検出キット22を有する膜の写真を撮ります。 </li></ol></li></ol></li></ol> 4。 EMTを評価するためのゲル収縮アッセイ<ol><li>細胞培養容器からの馴化培地を吸引し、5でよく洗う - 死んだ細胞を除去するためにPBSの10ミリリットル。洗浄後、すぐにPBSを吸引。 </li><li> 3分間CO 2を 0.05％トリプシン/ EDTAの2ミリリットルを加え、37℃でインキュベートし、5％。 </li><li> DMEMを150×gで4分間室温でトリプシンインヒビター（1mg / mlの）、遠心管をを補っ含む遠心チューブに剥離した細胞を収集します。 </li><li>蒸留水で1型コラーゲンゲルを混合し、DMEMを濃縮4×1.75 mg / mlでのコラーゲン濃度を達成するためにボリュームを調整するために、1×DMEM濃度。このステップの間に氷の上でのゲル媒体を保つようにしてください。 注：タイプ1コラーゲンゲル（3 mg / mlで）のほか3.5ミリリットルを混ぜ、ゲル培地の6ミリリットルを作成するには、4×1.5mlのDMEMを濃縮し、蒸留水1ミリリットル。 </li><li> 500μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、細胞計数のためのサンプルを削除します。カウントトリパンブルー染色を用いて血球計数器を用いて細胞の数は、細胞生存率をチェックします。 </li><li>よく3.0×10 5細胞/（6.0×10 5細胞/ ml）の細胞密度を達成するために、ボリュームを調整し、穏やかに、しかしすぐにゲル化することなく、ピペットでそれを混合するためにゲル媒体を追加します。 </li><li>きちんとした円筒状の形を作るために迅速かつ慎重に、24ウェル、無処理プレートの各ウェルに混合物の0.5ミリリットルを分注します。任意の気泡がゲル（ 図1A）を汚染することを可能にしないように注意してください。 注：細胞を含むゲル培地は、粘性であり、容易に十分にゲル化し、フォームの三日月形することができます。 </li><li> 37℃の細胞インキュベーターで15分間プレートをインキュベートし、5％CO 2および95％湿度で完全にゲル化します。 </li><li> 1方向の周囲を描画する方法で滅菌スパチュラを移動することによって破壊することなく、プレートからゲルを外します。スパチュラを用いて、優しくを60mm組織培養皿にゲルを移しますTGF-β1を含むまたは含まないDMEM / 1％FBS（5ng / ml）およびTNF-α（10ng / mLの）の5 mlを含みます。 </li><li>ゆっくりゲルは媒体上に浮いていることを確認するために料理を振ります。 37℃、5％CO 2および95％湿度で、細胞インキュベーター中でインキュベートします。 </li></ol>ゲルサイズの5測定<ol><li>画像解析システムを用いて、0、24、48、及び72時間後のコラーゲンゲルの大きさを測定します。 <ol><li>ゲルドキュメンテーションシステム（ 図2A）をオンにし、遮光キャビネットに皿を置きます。そして、キャビネット内の皿の蓋を取ります。 </li><li>関連するゲル解​​析ソフトウェアを開きます。キャビネット内のゲルの画像を表示するには、メニューバーにある「画像取得ボタン」をクリックしてください。そして、ゲル（ 図2B）の写真を撮るために、メニューバーの「取得」をクリックします。 </li><li>メニューバー（ 図2C）で「検出ボタン」をクリックして、測定領域（黄色の円の私を調整マウスをドラッグすることによりn個図2C）。次に、メニューバーの「自動検出ボタン」をクリックします（ 図2Dでボタンを参照してください）。ソフトウェアは自動的にヒートマップ（ 図2D）を示すゲルを検出します。 </li><li>画像処理によりゲルの輪郭線を抽出し、アウトライン（ 図2E）で囲まれた領域を計算するために「OK」をクリックします。領域が計算された後、計算された領域は、別個のポップアップウィンドウに表示されています。 注：ゲルは、撮像中に重なる場合は、滅菌ピペットチップを用いて穏やかにゲルを移動します。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).</li>
<li>Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+the+pathogenesis+of+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis.</a> The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).</li>
<li>Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+and+endothelial-to-mesenchymal+transition%3A+from+cardiovascular+development+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease.</a> Circulation. 125, 1795-1808 (2012).</li>
<li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139, 871-890 (2009).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Forino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta1+induces+epithelial-mesenchymal+transition%2C+but+not+myofibroblast+transdifferentiation+of+human+kidney+tubular+epithelial+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+experimental+pathology%22%5BJournal%5D)">TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture.</a> International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+miR-200+in+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis.</a> The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).</li>
<li>Reynolds, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+inflammation+and+fibrosis%3A+an+alveolar+macrophage-centered+perspective+from+the+1970s+to+1980s%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).</li>
<li>Camara, J., Jarai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+primary+human+bronchial+epithelial+cells+is+Smad-dependent+and+enhanced+by+fibronectin+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+%26+tissue+repair%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha.</a> Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).</li>
<li>Kamitani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+stimulation+with+TGF-beta1+and+TNF-alpha+induces+epithelial+mesenchymal+transition+in+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+archives+of+allergy+and+immunology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells.</a> International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).</li>
<li>Mikami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+signaling+induces+IL-8+production+in+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells.</a> PloS one. 9, e114791(2014).</li>
<li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+enhances+both+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+contraction+induced+in+A549+human+alveolar+epithelial+cells+by+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1.</a> Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).</li>
<li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%2C+myofibroblasts%2C+and+wound+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction.</a> The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).</li>
<li>Ramos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-1+reverts+epithelial-mesenchymal+transition+induced+by+TGF-%7Bbeta%7D1+through+MAPK%2FERK+kinase+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway .</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).</li>
<li>Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitable+parameter+choice+on+quantitative+morphology+of+A549+cell+in+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+reports%22%5BJournal%5D)">Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition.</a> Bioscience reports. 35, (2015).</li>
<li>Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-independent+activation+of+human+CD4%2B+45RO-+T+cells+by+anti-CD28+plus+IL-2%3A+Induction+of+clonal+expansion+and+priming+for+a+Th2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype.</a> Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).</li>
<li>Krug, M. S., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-strand+cDNA+synthesis+primed+with+oligo%28dT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT).</a> Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).</li>
<li>Morozumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+pathogens+in+clinical+samples+from+patients+with+community-acquired+pneumonia+by+real-time+PCR+with+pathogen-specific+molecular+beacon+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).</li>
<li>Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUrsitti%2C+JA+%22Current+protocols+in+protein+science%22">Current protocols in protein science</a>. Chapter 10, Unit 10.7(2001).</li>
<li>Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+methods+for+detecting+and+quantitating+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity.</a> Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).</li>
<li>Noguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrative+analysis+of+the+tumorigenic+role+of+TAZ+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).</li>
<li>Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition+%28EMT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+research%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT).</a> Respiratory research. 6, 56(2005).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+type+II+TGF-beta+receptor+tyrosine+dephosphorylation+controls+SMAD-dependent+profibrotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling.</a> The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).</li>
<li>Saito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+expression+profiling+reveals+target+genes+of+TGF-beta+and+TNF-alpha+possibly+mediated+by+microRNAs+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells.</a> PloS one. 8, e56587(2013).</li>
<li>Dvashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+magnesium+dependent+1A+governs+the+wound+healing-inflammation-angiogenesis+cross+talk+on+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury.</a> The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).</li>
<li>Hallgren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+ROCK1+dependent+contractility+in+fibroblast+from+chronic+obstructive+pulmonary+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients.</a> Journal of translational medicine. 10, 171(2012).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-9+activates+TGF-beta+and+stimulates+fibroblast+contraction+of+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+induces+human+lung+fibroblast-mediated+collagen+gel+contraction+via+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor.</a> Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).</li>
<li>Kohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGD%282%29+modulates+fibroblast-mediated+native+collagen+gel+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).</li>
<li>Muir, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+epithelial+cells+acquire+functional+characteristics+of+activated+myofibroblasts+after+undergoing+an+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition.</a> Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).</li>
<li>Zhong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+epithelial-mesenchymal+transition+of+alveolar+epithelial+cells%3A+effects+of+misfolded+surfactant+protein%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokines+augments+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+A549+cells+by+up-regulating+TbetaR-I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).</li>
</ol>

著者らは、開示する利害の競合がありません。

本研究で開発されたプロトコルは、2つのステップを含みます。最初のステップは、第二段階は、ゲル収縮アッセイがあるが、EMTを誘導するために行われます。それは、細胞がEMTを受けたことを確認することが重要であるので、ステップ2は、形態学的および遺伝子発現の変化に優れた補数を提供します。以前の研究は、A549細胞のEMTは、TGF-β1のみ24によって誘導されたことを示しました。我々は以前に10を報告しているようしかし、TNF-α処理は、EMTおよび間葉細胞マーカーの獲得を強化します。 TGF-β媒介EMTのメカニズムはSMAD依存25であると考えられています。 TNFαは、ゲル収縮の向上につながるTGF-β1によって誘導されるEMTを強化します。 TGF-β1によって誘導されるEMTの増強のためのTNFαのメカニズムはSMAD2リンカー領域の唯一のリン酸化ではないことが報告されているだけでなく、規制26 MAPKシグナル。そこで、本研究で開発したプロトコルはstimul含まTGF-β1及びTNF-αの両方によってエーション。 <p class="...

線維症は、間質性肺疾患、心臓線維症、肝硬変、末期腎不全、全身性硬化症、および自己免疫疾患の1のような種々の慢性進行性疾患の病因に関与しています。間質性肺炎のうち、特発性肺線維症（IPF）は慢性進行性疾患であり、予後不良を示しています。 IPFの病理学的特徴は予後と関連している活性化された線維芽細胞および筋線維芽細胞からなる線維芽細胞巣の開発です。このような肺の線維芽細胞の起源は、もともと常駐肺線維芽細胞及び骨髄から循環する線維細胞を含むいくつかの間葉系細胞に由来することが提案されています。最近、上皮間葉移行（EMT）は、間葉細胞2の形成に関連することが提案されている、および線維性疾患の病因に貢献します。 これは、と考えられているEMTは、腫瘍の浸潤および転移3を含む胎児の発育、創傷治癒、および癌の進行の過程で重要な役割を果たしています。 EMTのプロセスに続いて、上皮細胞は、E-カドヘリンなどの上皮マーカーの損失により、間葉系細胞の能力を取得し、そのようなビメンチンのような間葉マーカー、およびα平滑筋アクチン（SMA）4,5の発現による。以前の研究は、EMTプロセスは腎臓6および肺7における組織線維症の発症に関連しているという証拠を示しました。さらに、慢性炎症は、線維性疾患8を促進します 。さらに、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー14（TNFSF14、LIGHT）などの炎症性サイトカイン、腫瘍壊死因子（TNF）-α、インターロイキン1βは、EMT 9-12を増強することが示されています。 コラーゲンゲル収縮アッセイ線維芽細胞は、I型に埋め込まれたコラーゲンベースの細胞収縮アッセイコラーゲンゲル三次元、収縮性を評価するためのインビトロモデルにおける理想的です。収縮は、線維芽細胞の特徴的な機能の一つであり、正常な創傷修復および線維症13に貢献しています。このアッセイでは、線維芽細胞の付着は、いくつかの条件の下で機械的張力を生成することになっている私はインテグリン依存性のメカニズムを介して型コラーゲン、その結果、組織の収縮につながると考えられています。 ここで、ゲル収縮アッセイの開発は、EMTを受けた細胞における収縮機能の獲得を評価するように適合されることが報告されています。このレポートには、この修正されたアッセイは、EMTを経た間葉細胞で収縮性を評価するのに適していることを示しています。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>シグマaldrich</td><td>11965-092</td><td>A549中</td></tr><tr><td>型FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr>変換<tr><td>成長因子-&β;1、人間、組換え</td><td>和光研究所の化学物質</td><td>209-16544</td><td></td></tr>組<tr><td>換えヒトTNF - アルファ;</td><td>R&D systems</td><td>210-TA/CF</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3195</td><td>1:3,000 希釈</td></tr><tr><td>Vimentin (D21H3) Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#5741</td><td>1:3,000</td></tr><tr><td>希釈 Anti-&alpha;-Tubulin antibody</td><td>sigma aldrich</td><td>T9026</td><td>1:10,000 希釈</td></tr><tr><td>モノクローナル Anti-Actin, &α;-Smooth Muscle antibody&nbsp;</td><td>sigma aldrich</td><td>A5228</td><td>1:10,000 希釈</td></tr><tr><td>抗N-カドヘリン抗体</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>#610920</td><td>1:1,000 希釈</td></tr><tr><td>抗マウス IgG, HRP結合全腹筋羊 (二次抗体)</td><td>GE ヘルスケア</td><td>NA931-100UL</td><td>1:20,000 希釈抗</td></tr><tr><td>ウサギ IgG, HRP結合全腹筋ロバ (二次抗体)</td><td>GE ヘルスケア</td><td>NA934-100UL</td><td>1:20,000希釈</td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN418</td><td>2% in TBS-T</td></tr><tr><td>6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid</td><td>corning</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Cell culture dish</td><td>TPP</td><td>#93100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, powder</td><td>life technologies</td><td>12100-046</td><td>For 4&times;DMEM</td></tr><tr><td>1型コラーゲンゲル</td><td>新田ゼラチン</td><td>セルマトリックス I-A</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル細胞培養プレート</td><td>AGC テクノグラス</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>ゲルドキュメンテーションシステム&nbsp;</td><td>ATTO</td><td>AE-6911FXN</td><td>ゲルイメージャー</td></tr><tr><td>ゲル解析ソフト</td><td>ATTO</td><td>Densitograph, ver. 3.00</td><td>AE-6911FXN</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%) フェノールレッド</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート 未処理</td><td>イワキ</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルーソリューション 0.4%</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RNA抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>逆転写酵素</td><td>のライフテクノロジー</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCRシステム</td><td>Stratagene</td><td>Mx-3000P</td><td></td></tr><tr><td>SYBRグリーンPCRキット</td><td>Qiagen</td><td>204145</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>life technologies</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>PVDFメンブレン</td><td>ATTO</td><td>2392390</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay kit</td><td>bio-rad</td><td>5000006JA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ポリアクリルアミドゲル</td><td>ATTO</td><td>2331810</td><td></td></tr><tr><td>ウエスタンブロッティング検出試薬</td><td>GE ヘルスケア</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>コールドCCDカメラ</td><td>ATTO</td><td>Ez-Capture MG/ST</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤</td><td>sigma aldrich</td><td>T9003-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ポリオキシエチレン (20)ソルビタンモノラウレート</td><td>和光研究所 化学薬品</td><td>163-11512</td><td></td></tr><tr><td>ポリオキシエチレン (9) オクチフェニルエーテル</td><td>和光研究所 化学品</td><td>141-08321</td><td></td></tr></tbody></table>

開発<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイは、間葉細胞受けた上皮間葉移行の収縮機能を評価します

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

線維症は、間質性肺疾患などのさまざまな慢性進行性疾患の病因に関与することがよくあります。病理学的特徴は、疾患の重症度に関連する線維芽細胞性病巣の形成です。線維芽細胞病巣からなる間葉系細胞は、もともと常在する肺内線維芽細胞や骨髄由来の循環線維細胞など、いくつかの細胞源に由来することが提案されています。近年、上皮間葉転換(EMT)を受けた間葉系細胞も線維化の病因に寄与すると考えられてきた。さらに、EMTは成長因子βのトランスフォーミングによって誘導することができ、EMTは腫瘍壊死因子αのような炎症誘発性サイトカインによって増強することができます。ゲル収縮アッセイは、線維芽細胞の特徴的機能の1つであり、創傷修復や線維化に寄与する収縮性の評価に理想的なin vitroモデルです。ここでは、EMTを受けた間葉系細胞の収縮能力を評価するためのゲル収縮アッセイの開発が実証されています。

EMTの間に、上皮細胞は、E-カドヘリンなどの上皮マーカーを失い、そのようなビメンチンおよびα平滑筋アクチン4,5などの間葉系マーカーの発現を得ることができます。 TGF-β1及びTNF-αとのA549ヒト肺上皮細胞のインキュベーションは、EMTを誘導します。通常のA549細胞の出現は、上皮細胞（ 図3A）の特徴である形状や三角形のような石畳ですが、TGF-β1及びTNF-αで刺激した後、外観は間葉に似ている長い紡錘形に変更しました細胞（ 図3B）。 上皮および間葉系マーカーの発現は、細胞がEMTを受けたことを確認するために評価しました。相対的mRNA発現は、ΔΔCT法を用いて計算しました。個々のデータは、ハウスキーピングgであるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に対して正規化しましたエン。 TGF-β1と48時間TNF-αで処理された...

ここでは、上皮間葉転換を経験した間葉系細胞の収縮機能を評価するためのゲル収縮アッセイの開発と応用について説明します。

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

この手順の全体的な目標は、in vitro 炎症性サイトカイン誘発上皮間葉転換 (EMT) を受けた間葉系細胞の収縮性を評価することです。この間葉系は、特発性肺線維症や重度の喘息における気道リモデリングなどの炎症性免疫応答によって誘発されるEMT後の基本的な細胞機能のバリエーションです。この技術の主な利点は、特定のデバイスを必要とせず、高い内容を示すことです 手順をデモントするのは、私の研究室の竹島秀之と牧田浩介の大学院生になります。まず、A-549ヒト肺上皮細胞の培養物を5〜10ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、37°Cと5%の二酸化炭素で2ミリリットルのトリプシン-EDTAで接着細胞を剥離します。3分後、細胞懸濁液を細胞培養培地が入った円錐形のチューブに移し、遠心分離機で細胞をスピンダウンします。ペレットを2ミリリットルの細胞培養培地に再懸濁し、カウント用に小さなエロコートを確保します。その後、10センチメートルのポリステレン皿あたり10ミリリットルの培地に0.5〜1回10〜6番目の細胞を播種し、細胞培養物を24時間インキュベートします。EMT導入の場合、翌日、細胞を10マイクロリットルのTGFベータ1およびTNFアルファで処理し、プレートをさらに48時間インキュベーターに戻します。4日目に、EMT誘導培養物を5〜10ミリリットルのPBSで洗浄し、次に、示したようにトリプシンEDTAで細胞を剥離します。次に、トリスプシン阻害剤を添加したDMEM中の細胞懸濁液をスピンダウンし、ペレットを500マイクロリットルのpbsに再懸濁します。次に、細胞を数え、調製したばかりのゲル培地をウェルあたり10の3倍の密度で5番目の細胞に加え、ゲル化する前にピペットで溶液を穏やかに、しかし迅速に混合します。迅速かつ慎重に、0.5ミリリットルの細胞を、きちんとした円筒形の未処理の24ウェルプレートの各ウェルに分注します。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに15分間置きます。ゲルが完全に固まったら、滅菌したスパチュアラを各ゲルの外側を一方向に円を描くように動かして、ゲルをプレートから壊さないようにします。ゲルを取り出すときは、ヘラをウェル内で前後に動かさないように注意してください。次に、スパチュラを使用して、TGFベータ1およびTNFアルファの有無にかかわらず、1パーセントFBSを添加した5ミリリットルのDMEMを含む個々の16ミリメートル組織培養皿にゲルを穏やかに移します。最後に、皿を静かに振ってゲルが培地に浮いていることを確認し、ゲルを細胞培養インキュベーターに戻します。未処理のa541細胞は、上皮細胞の特徴である丸石のような三角形の外観を示します。しかし、TGFベータ1およびTNFアルファによる刺激後、細胞は、同期性細胞で観察されるものと同様に、長い紡錘形を示します。EMT前後の上皮および間同期マーカー発現のQRTCPRは、炎症性サイトカインで48時間処理したA541細胞がCDH1の発現を有意に減少させ、VIAMおよびACTA2の発現を有意に増加させることを明らかにしています。さらに、これらのサイトカインによる刺激は、西洋の血液分析によって決定されるようにE-カドヘリンの発現を減少させますが、ビメンチンN-カドヘリンおよびアルファ平滑筋アクチンの発現は誘導されます。ゲル収縮アッセイでは、48時間後、TGFベータ1およびTNFアルファ処理細胞を含むゲルは、PBSで処理された細胞を含む制御ゲルよりも小さくなります。実際、72時間後、サイトカイン処理ゲルを含むゲルのサイズは、ゲル分析装置で測定した制御ゲルと比較して大幅に縮小します。観察されたように、ゲルの収縮ステップは、適切に実行されれば3時間で完了することができます。この手順を試行する際は、ゲル収縮アッセイを実行する前に、EMTが正常に誘導されたことを確認することを忘れないでください。観察後、この技術は、線維症や肺のリモデリングなどの炎症状態におけるEMTプロセスを変化させる方法を提供します。このビデオを見た後、EMTを持つ細胞を一種のcuagenterに放出し、培地で泡立てる方法についてよく理解しているはずです。

development-an-vitro-assay-to-evaluate-contractile-function

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

頭蓋間充織は、おそらく神経ヒダの上昇のための駆動力を提供する劇的な形態形成運動を起こす...

頭蓋間葉の細胞挙動を評価するための外植片アッセイ

簡単な方法は、種々の細胞型における間葉移行（EMT）上皮の誘導のために記載されている。免疫細胞化学によるEMT状態にある細胞の分析のための方法が含まれる。...

間葉転換を誘導し、上皮の分析

選択的スプライシング制御は、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおける必須の細胞プログラムである上皮間葉転換(EMT)に寄与することが示されています。ここでは、EMT中の選択的スプライシングの検出に誘導性EMTモデルを利用する方法について説明します。...

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

ここでは、マウス初代心外膜細胞をアウトグロース培養アッセイで単離する方法と、ex...

心外膜の伸長文化検定と<em&gt; ex vivoで</em&gt;心外膜由来の細胞移動の評価

上皮から間葉への移行(EMT)は、癌が浸潤性になることを可能にします。EMTを調査するために、血清と酵素を欠いた神経幹細胞(NSC)ベースのinvitroモデルが記載されています。この標準化されたシステムにより、細胞遊走、遺伝子およびタンパク質発現の定量的および定性的な評価が可能になります。創薬に適したモデルです。...

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

シリコーンゴム(PDMS)で製造された高スループットトラクション力アッセイを提示する。この新しいアッセイは、様々な生物学的および生物医学的プロセスおよび疾患における細胞収縮性の物理的変化を研究するのに適している。上皮間葉転移中の収縮性のTGF-β依存性の増加を測定することにより、この方法の有用性を実証する。...

PDMSを用いた高スループットトラクション力顕微鏡検査は、上皮間膜遷移に対する成長因子-βの線量依存的効果を明らかにする

このシグナル経路に関与するタンパク質および遺伝子発現を研究することにより、TGF-βシグナル伝達およびTGF...

乳がんおよび正常細胞におけるTGF-βシグナル伝達とTGF β誘発性上皮間葉間質転移の研究

細胞形態変化を観察し、免疫蛍光染色を用いたEndMT関連マーカー変化の発現を調べることにより、内皮細胞におけるTGF-β2誘導EndMTを調べる方法について述べる。CRISPR/Cas9遺伝子編集は、TGF-β2誘導EndMTにおけるその役割を調査するためにカタツムリをコードする遺伝子を枯渇させるために記述され、使用された。...

TGF β媒介性間葉転移(EndMT)およびCRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたEndMTエフェクターの機能評価

この研究は、蛍光タンパク質マイクロパターンの可視化された変位に基づいて単一細胞収縮力の単純化されたハンズオフ定量化のために、マイクロウェルフォーマットで蛍光標識エラストマー収縮性表面(FLECS)技術を利用するための柔軟なプロトコルを提示する。...

マイクロパターンエラストマーを使用したシングルセル収縮性の簡素化されたハイスループット分析

このプロトコルは、3Dエンジニアリングされた心臓および骨格筋組織を生成するための方法を提供し、前臨床薬物スクリーニングモダリティにおけるそれらの使用について説明します。記載された方法は、磁気センシングシステムを利用して、24個の組織の同時評価を並行して容易にする。...

スケーラブルな3Dエンジニアリング筋肉組織における前臨床薬物検査

学ぶ ゲル収縮アッセイを用いて、炎症性サイトカイン誘導上皮間葉移行後の間葉細胞の収縮機能を評価する方法です。A-549肺上皮細胞を使用し、特別な装置を必要とせず、高コンテンツで再現性のある結果が得られます。

開発

さらに動画を探す