前立腺細胞の方向性のある移動を研究するためにカスタム設計された電気走チェンバースを利用
2014年12月7日
私たちは、特注のガルバノタキシスチャンバー内で移動し、不死化された前立腺細胞に生理的な電場を適用する方法を提示します。この方法を使用して、2つの系統の非腫瘍形成性前立腺細胞が、フィールド内で異なる程度の移動方向性を示すことを示します。
この手順の全体的な目標は、印加電界中の細胞の方向性移動を評価するアッセイであるGalvan Axxisを実行することです。これは、最初にGalvan axxisチャンバーを組み立て、次に目的の細胞を播種することによって達成されます。2番目のステップでは、チャンバーを密閉し、タイムラプスイメージングのために電界を印加します。
最後のステップでは、個々のセルの移動速度と電界に対する角度を追跡します。最終的には連署します。を使用して、セルが電場にどのように応答するか、およびセルがカソードに方向に移動するかどうかを示すことができます。
この技術の主な利点は、二次分析のためにテキサスに投与した後の細胞回収が容易であることと、高倍率で蛍光標識細胞を使用して遊走を撮影することが容易であることです。この方法の視覚化は、チャンバーの組み立て手順をデモンストレーションなしでは習得するのが難しいため、この方法の視覚化は非常に重要です。プラスチック製のガルバンアクシスチャンバーを2つのプロパノールで拭くことから始めます。
次に、シリンジを使用して、チャンバーの底面にある円形の開口部の周りにマリングレードのシリコンシーラーを塗布します。シーラントの上に大きなカバーグラスを配置し、綿アプリケーターの端で所定の位置に押し込み、綿棒で余分な接着剤を拭き取ります。次に、ひし形のポイントマーカーを使用して小さなカバーガラスをカットし、6 x 25ミリメートルのスペースを作り、チャンバーを裏返します。
次に、シリンジを使用して2本のシリコンのストライプを塗布し、底面ガラスの2つの円形開口部の間にセル接着用の10 x 25 mmのチャネル表面を作成します。次に、円形の開口部の間に2つのガラススペースを接着し、新しい綿のアプリケーターでスペースを押し下げ、示したように余分な接着剤を拭き取ります。シリコーン接着剤が硬化するまで、チャンバーを24時間試してください。
翌日、チャンバーを蒸留水に一晩浸して接着剤から酢酸残留物を取り除き、細胞をチャンバーに播種します。先ほど示したように、チャンバーを2つのプロパノールで乾かして拭きます。滅菌PB S3で洗浄し、チャンバー内の2つの円形開口部間の液体の流れを確認します。
チャンバーが良好な状態にあることを確認した後、滅菌培養皿に包み、チャンバーを摂氏37度に15分間置きます。チャンバーが電子平衡化している間に、摂氏37度で5ミリリットルのトリプシンEDTAを使用して、前立腺細胞を培養皿から取り外します。5分後、5ミリリットルの10%FBSで反応を中和します。
PBSでは、分離した細胞を15ミリリットルのチューブに移し、5分間遠心分離します。200倍、Gで、培地を吸引し、次にペレットを1ミリリットルの培地に再懸濁します。次に、細胞をカウントした後、培地とシードを使用して細胞濃度を1ミリリットルあたり4細胞に8×10に調整します。
各チャンバーに350マイクロリットルの細胞懸濁液。細胞をチャンバー内で一晩、37°Cと5%の二酸化炭素で濡れたKimワイプを塗布した培養皿でインキュベートします。翌日、まず各ガルバンAXSチャンバーについて摂氏37度までの10ミリリットルの培養物を温めることにより、上部チャンバーの組み立てを開始します。
培地が温まっている間に、インキュベーターからGalvan axxisチャンバーを摂氏37度の温熱プレートに移し、チャンバーを培地ですすいでください。付着していない細胞を除去するには、チャンバー内に400マイクロリットルの培地を残し、シリンジを使用して両方のガラススペースの上に高真空グリースを塗布します。カバーガラスと綿のアプリケーターでチャンバーを密封し、ガラス表面を乾燥させます。
次に、高真空グリースをシリンジで塗布し、カバーガラスとチャンバーの隙間を塞ぎます。次に、培地を内側のリザーバーに加えます。気泡を取り除き、リザーバー間の液体の流れを確認します。
寒天ブリッジに2インチのPVCチューブを一対切断するには、それらを裏返してから、ピースを100ミリリットルのビーカーに入れます。次に、200ミリグラムのバクトトゥ寒天培地を50ミリリットルのフラスコに加え、10ミリリットルの培地で2%寒天ゲルを作ります。30秒間電子レンジで加熱した後、トランスファーピペットを使用して寒天ゲルをプラスチックチューブにロードし、寒天ブリッジを室温で10分間放置して寒天を固めます。
次に、ギャルチャンバーの外側のリザーバーに2ミリリットルの培養液を追加し、寒天ブリッジを内側と外側の培地リザーバーに挿入して電流を流し、移動のタイムラプスイメージングを実行します。まず、ガルバンチャンバーを顕微鏡ステージ上の摂氏37度の環境チャンバーに移し、チャンバーをテープで固定し、10倍の対物レンズの下の細胞に焦点を合わせます。次に、ガルバンAxxis電極を右側にカソードを外側のリザーバーに挿入し、ワイヤーと電極をテープで固定します。
次に、電源ボックスのスイッチを入れてチャンバーに電界を印加し、電圧計を使用してチャンバー全体の出力電圧を測定し、長さ25ミリメートルのチャンバーで2.5ボルトに達します。次に、チャンバー全体で10ポイントを選択して10本のタイムラプス動画を生成し、取得条件を10分間隔で2時間に設定します。その後、撮影を開始し、必要に応じて出力電流を調整して、実験中の電界強度を維持します。
実験の最後に、チャンバーをステージから取り外し、細胞を95%アルコールに固定します。次に、チャンバーを壊して開きます。カバースリップは後で使用するために保存できます。
染色とイメージング。将来の年のためにチャンバーを清掃します。Galvan Axxisを定量化するには、タイムラプス動画を回転させて、カソードを画像の上部に向けます。
セルトラッキングソフトウェアにムービーをエクスポートし、各ムービーから各時点における10〜20セルのXY位置を手動で追跡し、南北方向に対する移動距離と角度、セルトラッキングソフトウェアで電界の同じ向きが計算されます。最後に、測定値を保存し、データをデータベースアプリケーションにインポートして、結合された結果を計算します。この代表的なGalvan Axxis実験では、前立腺細胞の系統に、2時間にわたって同様の速度で移動することが決定されました。
しかし、電界に対する方向性は、PRNS one one lineで0.7プラスマイナス0.3、PNT two lineで0.2プラスマイナス0.8であり、これら2つの細胞株のガルバン軸に有意な差があることを示しており、それらの細胞シグナル伝達メカニズムが電界に対する直接的な異なる移動応答を示唆している。この技術は、研究者がエレクトロフィールドにおける細胞の方向性移動のメカニズムを探求するのに役立ちます。
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概要
この研究は、カスタムメイドのガルバノタキスカマーを使用して、遊走する不死化前立腺細胞に生理学的電界を適用する方法を提示します。結果は、2系統の非腫瘍性前立腺細胞が電界に対して異なる程度の遊走方向性を示すことを示しています。
研究の主要部分
科学の分野
- 細胞遊走
- 電気生理学
- 前立腺がん研究
背景
- ガルバノタキシスは、電界に対する細胞の向性運動です。
- この方法は、がん研究における細胞挙動の理解に役立ちます。
- 不死化前立腺細胞は、非腫瘍性細胞の挙動を研究するためのモデルとして役立ちます。
- 異なる細胞株は、電界に対して様々に反応する可能性があります。
研究の目的
- 電界下での前立腺細胞の向性遊走を評価すること。
- 異なる非腫瘍性前立腺細胞株の遊走挙動を比較すること。
- ガルバノタキシスをin vitroで研究するための信頼性の高い方法を確立すること。
使用した方法
- カスタムガルバノタキスカマーの組み立て。
- カマーへの不死化前立腺細胞の播種。
- タイムラプス撮影中に電界の適用。
- 電界に対する個々の細胞の遊走速度と方向の追跡。
主要な結果
- 2系統の非腫瘍性前立腺細胞が異なる程度の向性遊走を示しました。
- 細胞は陰極方向に遊走し、電界に対する反応を示しました。
- 遊走速度と角度の定量的分析が行われました。
- この方法は、電界下での前立腺細胞の挙動に関する洞察を提供します。
結論
- ガルバノタキスカマーは細胞遊走を研究するための効果的なツールです。
- 異なる前立腺細胞株は、電界に対する異なる遊走パターンを示します。
- この研究は、細胞挙動における電界の役割の理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic de-risking of prostate cell migration phenotypes by quantifying directional responses to physiological electric fields, supporting target validation in early discovery. The custom galvanotaxis chamber provides a reproducible, disease-relevant system for assessing intrinsic migratory behavior, which can inform lead identification strategies by highlighting functional differences between cell models. Such electrophysiological profiling adds predictive confidence to preclinical models by linking cellular signaling mechanisms to functional outputs under controlled stimuli.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing differential intrinsic features governing directional migratory responses between prostate cell lines.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative measurement of migration speed and angle relative to cathode-directed galvanotaxis.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell line-specific signaling mechanisms that modulate electrotaxis, informing target confidence assessments.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems using low-cytotoxicity, reusable PVC chambers and platinum electrodes for standardized electrotaxis screening.
- Quantitative Outputs: Generates migration speed and directional persistence metrics via time-lapse imaging and cell tracking software, enabling reliable compound evaluation.
- Scalability: Facilitates platform reuse through agar bridge-mediated current conduction and motorized stage imaging, supporting assay standardization across runs.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses SV40-immortalized prostate cell lines (pRNS-1-1 and PNT2) as a disease-relevant system to model non-tumorigenic cell behavior under electrophysiological cues.
- Translational Continuity: Links discovery-stage galvanotaxis measurements to preclinical risk-adjusted advancement by revealing differential electrotaxis that may reflect underlying pathway activity.
- Mechanistic De-risking: Highlights how cellular signaling mechanisms direct differential migration responses to electric fields, reducing ambiguity in target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The galvanotaxis assay integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, providing electrophysiological readouts that complement biochemical and imaging-based screening cascades.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how prostate cell lines directionally migrate in applied electric fields, clarifying pathway-dependent migratory phenotypes.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chamber assembly, sterile equilibration, and time-lapse imaging under controlled field strength (2.5 V across 25 mm chamber).
- Analytics: Enables comparative analysis via exported time-lapse movies, manual XY tracking, and calculation of migration angles relative to the electric field north-south orientation.
- Translational Research: Connects galvanotaxis outcomes to preclinical continuity by identifying intrinsic migratory differences that may predict differential responses in complex microenvironments.
- Enterprise Reuse: Positions the chamber as a reusable capability due to affordable, autoclavable components and modular design allowing glass surface modifications and cell treatments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantitative galvanotaxis metrics that reduce mechanistic ambiguity in cell migration studies.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via sealed chambers, agar bridges, and motorized stage imaging, minimizing variability in electrotaxis measurements.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by revealing cell line-specific electrotaxis profiles that inform capital allocation in early-stage target programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through differential directionality measurements (e.g., 0.7±0.3 vs 0.2±0.8) that reflect intrinsic migratory phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, microfluidic chamber assembly, and time-lapse microscopy for reliable galvanotaxis execution.
- Dependent on instrumentation including motorized microscope stages, voltage meters, and cell tracking software for quantitative directional analysis.
- Necessitates cross-team standardization of chamber sealing protocols (silicone application, agar bridge preparation) to ensure consistent current conduction.
- Involves adaptation considerations when modifying glass surfaces or testing extracellular matrix coatings on chamber substrates for cell attachment studies.
- Includes practical limitations such as the 24-hour silicone curing time and overnight chamber soaking to remove acetic acid residue before cell seeding.
