Name: 前立腺細胞の方向性のある移動を研究するためにカスタム設計された電気走チェンバースを利用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学ぶカスタム電気走チェンバーを用いた前立腺細胞の方向性移動評価法。非腫瘍性前立腺細胞株の異なる電場応答性を比較し、がん研究における細胞移動メカニズムの理解に貢献します。

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前立腺細胞株は、親切にがんセンター、カリフォルニア大学デ​​ービス校で博士陵王瑜博士興-寺院カンフーによって提供されます。このプロジェクトは、NIH電気走助成4R33AI080604によってサポートされています。

1.培養前立腺細胞<ol><li>培養PRNS-1-1、5％CO 2、37℃で、10％FBSおよび抗生物質-抗真菌を補充したRPMI 1640培地中で100mm培養皿上とPNT2前立腺細胞。細胞が電気走実験のために80％の集密度に達するまで、毎日の培地をリフレッシュします。 </li></ol> 2.組立電気走チェンバース<ol><li>下部チャンバーの組み立て<ol><li> 2-プロパノールでプラスチックの電気走室を拭きます。注射器でチャンバーの底側に円形の開口部周りのマリングレードのシリコンシーラーを適用し、大規模なカバーガラス（ 図1）を取り付け。カバーガラスを押し下げると綿棒で余分な接着剤をふき取るために綿棒の裏側を使用してください。円形の開口部は、媒体と、電流が2インナーメディア貯水池の間に位置し、細胞の上に流れるようになります。 </li><li> 6ミリメートル×2を作るために小さなカバーガラスをカットダイヤモンドポイントマーカーと5ミリメートルスペーサー。 </li><li>チャンバーを裏返し。注射器および/または下部ガラス上の2の円形開口部の間の細胞接着10ミリメートル×25mmのチャネル表面を作成するための金属スパチュラでシリコン接着剤の2ストライプを適用する。 2円形の開口部との間にガラススペーサの2枚を接着。スペーサーを押し下げると綿棒および/または爪楊枝で余分な接着剤をふき取るために綿のアプリケーターの裏側を使用してください。 </li><li>シリコン接着剤が硬化するまで、24時間チャンバーを乾燥させる。接着剤から酢酸残基を除去するために蒸留水で一晩チャンバーを浸す。すぐに使用するためのチャンバを乾かしたり、清潔​​な容器に後で使用するためにチャンバーを保存する。 <img alt="ガルバノタキシスチャンバーのセットアップ図は、ガラススペーサー、ボトムカバーガラスによる組み立ての詳細を示しています。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図1"> 図1：底の電気走室の組み立て。 A）大カバーガラスを清浄室の底部に取り付けられている。B）Tガラススペーサの破片woは細胞が付着するための10ミリメートル×25 mmのチャンネルを作成するために2円形の開口部との間で接着されている。 </li></ol></li><li>電気走チャンバーに細胞を播種<ol><li>実験に必要な電気走室の必要とする数を準備します。各細胞株または処置は、単一電気走室を必要とする。 2-プロパノールとの電気走室を拭きます。滅菌PBSで3回チャンバーを洗浄し、チャンバ内の2円形の開口部との間の液体の流れを確認してください。 </li><li>無菌の細胞培養皿でチャンバを囲み、それらを15分間37℃で平衡化させる。 5分間37℃で5ミリリットル0.25％トリプシン-EDTAを使用して培養皿から前立腺細胞を剥離。 PBS中5ミリリットル、10％FBSをトリプシン-EDTAを中和する。 </li><li> 15ミリリットルチューブに細胞を移し、200×gで、37℃で5分間細胞を遠心する。上清を吸引し、培養培地1ml中に細胞を再懸濁する。 </li><li> 20μを取る計数チャンバーにロードし、細胞数を計算するために細胞溶液のリットル。培養培地で8×10 4細胞/ mlに細胞濃度を調整します。 </li><li> 37℃のインキュベーターから電気走室を取る。各チャンバーに細胞懸濁液の350μlのをシード。 </li><li>湿ったキムワイプまたは5％CO 2、37℃のインキュベーター内の湿度チャンバ内の培養皿に一晩チャンバー中で細胞をインキュベートする。 </li></ol></li></ol><img alt="37°C、5%CO2での実験分析のためのインキュベーターセットアップによる前立腺細胞遊走図。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図2"> 図2：チャンバーに細胞を播種下部チャンバはA）前立腺細胞を、トリプシン処理し、計数し、チャンバーに移し、一晩インキュベートし、乾燥し、そして洗浄されるB）トップカバーガラスを撮影する前に、チャンバをシールするために装着される。 <ol start="3"><li> A上部チャンバーをssembling <ol><li>撮影の前に上部チャンバーを組み立てます。顕微鏡は、一度に単一の電気走チャンバを撮像収容することができる。各電気走室37℃で培養培地10mlを温める。 37℃の加温プレートにインキュベーターから電気走室を転送します。 </li><li>未付着細胞を除去し、培養培地で細胞を洗浄します。チャンバ内の培地を400μlのままにしておきます。両方のガラススペーサの上に高真空グリースを適用するために注射器を使用してください。 </li><li>チャンバーをシールするために小さなカバーガラスを追加します。静かに綿棒の裏側にカバーガラスを下に押してください。綿棒と過剰メディアを拭き取ってください。 </li><li>ガラス表面を乾燥させ、カバーグラスとチャンバとの間の隙間をシールするために高真空グリースを塗布。グリースを広めるために金属スパチュラを使用してください。インナー貯水池への培地の4ミリリットルを加え、貯水池の間に液体の流れを確認してください。 </li></ol></li><li>寒天を作るブリッジ<ol><li> 2インチ長いPVC管（16分の503 ID X 5/16 OD X 1/16ウォール）のペアをカットし、反転し、100ミリリットルのビーカーにそれらを挿入します。 </li><li> 200mgのバクト寒天を測定し、2％寒天ゲルを作るために10ミリリットルの培地で50mlフラスコに追加します。 30秒間電子レンジ。転送ピペットでプラスチックチューブに寒天ゲルをロードします。寒天を固化させる10分間室温で寒天橋のままにしておきます。 </li><li>電気走チャンバの外側のリザーバへの2mlの培地を加える。電流を流すために内側と外側の媒質貯水池に寒天ブリッジを挿入します。 </li></ol></li></ol><img alt="細胞移動のための寒天ブリッジとDC電源によるチャンバーのセットアップを示すガルバノタキシス実験図。" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig3highres.jpg" width="350" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図3"> 図3：チャンバーに細胞をロケ電気走室の最終組み立てを実証するための図を。。チャンバは完全に高真空グリースでシールされている。媒体はtで添加されるOリザーバを充填すると、2つの寒天橋がチャンバ内に挿入される。その後、電気走チャンバは顕微鏡ステージに転送され、電極は電界を印加するために取り付けられている。組み立てられた電気走チャンバの側面図は、電流が寒天ブリッジとカバーガラスとの間の空間を通ってセルの上を流れることを実証するために示されている。 3.タイムラプスイメージング<ol><li>前イメージングへの空気循環2時間、5％CO 2で37℃に環境室のスイッチをオンにします。 </li><li>顕微鏡に切り替え、画像取得ソフトウェアを開始する。顕微鏡ステージを校正し、10倍の対物レンズを選択します。 </li><li>顕微鏡ステージに電気走室を移し、テープで室を確保し、細胞に焦点を当てる。右側のカソードと外側の貯水池への電気走電極を挿入します。ワイヤーとテープで電極を固定します。 </li><li>パワーBOに切り替えxは、チャンバに電界を印加する。 25ミリメートル、長室（100 MV / mm）のための2.5ボルトに到達するために、チャンバ全体の電圧計で出力電圧を測定します。出力電流を調整することによって、実験中の電界強度を維持する。 </li><li> 10タイムラプスムービーを生成するソフトウェアでフィルムにチャンバー全体で10ポイントを選択します。 2時間10分間隔で取得条件を設定する。 </li><li>撮影を開始し、必要に応じて出力電流を調整します。 </li><li>実験の最後に、ステージからチャンバを除去し、95％アルコールで細胞を固定する。きれいにカミソリの刃で開放室を破ると、それを再使用しています。 </li></ol>電気走4.定量<ol><li>タイムラプス映画や再オリエント画像のトップにカソードを回転させます。細胞トラッキングソフトウェアに映画をエクスポートします。 </li><li>手動で各映画（ 図4のA、B）から各時点で10〜20細胞の（x、y）の位置を追跡する。南北方向の相対移動距離及び角度は、電界の同じ向きは、細胞追跡ソフトウェア（ 図4C）で計算される。 注：平均移動速度は、総移動距離と総撮影時間から変換された。方向性コサイン値に角度から変換される。細胞は、ランダムな方向性と移行する場合、ネット余弦の平均はゼロに近くなります。細胞は陰極に向かって直接移行すると、余弦値は1になります。細胞は陽極に向かって直接移動する場合は、コサイン値は-1になります。 </li></ol><img alt="細胞移動の比較、ランダム移動とガルバノタキシス、方向の余弦方程式による図。" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig4highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図4"> 図4：細胞の画像を追跡線の細胞指向性を測定するために追跡A）オーバーレイ。細胞の（x、y）の位置はmanuaあるLLYタイムラプスムービーで追跡。 。細胞がランダムに移行する場合、平均余弦がゼロに近いB）しかし、細胞はカソードまたはアノードに向かって移動した場合、平均余弦の値が+（カソード）またはに近い- 。（陽極）1.0 C ）方向性は、移行の角度（θ）から変換された余弦値、によって提示されます。コサイン（θ）は、B（電界の方向に投影距離）を遠ざける距離a（移動距離）の比に等しい。 <ol start="3"><li>測定結果を保存します。組み合わせた結果を計算するために、データベース·アプリケーションにデータをインポートします。 </li><li>棒グラフ（ 図5）をプロットするためにスプレッドシートに平均移動速度と平均余弦値の結合されたデータをエクスポートします。 </li></ol>

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<li>Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electric+field+near+human+skin+wounds+declines+with+age+and+provides+a+noninvasive+indicator+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Rep.+and+Reg%22%5BJournal%5D)">The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing.</a> Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

セルの電気走応答の分析は、多くの細胞の遊走又は増殖27,28を処理するための重要な機能の指標となっている。ここでは二つの前立腺細胞株をフィルムにガラス表面にカスタムメイドのチャンバーを用いる。これらの細胞株は、電気走の異なる程度を実証し、我々は、細胞内局在または電気走媒介タンパク質の活性化は、電気走応答において観察された差が生じる、不死化細胞株を生成するプロセスの間に干渉されるかもしれないと推測している。 培養皿27,28で作ら他の電気走室の設計に比べて、現在の設計にはいくつかの利点がある。まず、ガラス表面は、イメージングのために適しており、細胞を有するカバーガラスを、免疫染色のために電気走後に取り出すことができる。本研究では、セルのグループを監視するために10倍の対物レンズの低倍率を使用する。しかし、THESとeはガラス光学素子の改善には、セル17の前縁にラメリポディアの高速伸縮を追跡する、または蛍光タンパク質で標識した細胞を追跡するために、60倍のオイル対物を有する高倍率での単一細胞を撮影することが可能である。第...

内因性の電界は、皮膚1、32、33、2、脳のような種々の組織で検出される。生理学的な電界が神経突起5,6の伸長を案内し、上皮および角膜創傷閉鎖1,7を促進導く胚発生3,4を含む特定の生物学的機能を提供しています。 インビトロ 、培養細胞に直流電界を印加する模倣生理電界指向性細胞遊走、または電気走を引き起こす。電気走線維芽細胞8、魚ケラチノサイト9、ヒト上皮および角膜ケラチノサイト10-12に検討されている、神経芽2、および神経前駆細胞14,13リンパ球。 （ - ）極印加磁界にさらされたときに、研究された細胞の大部分は、陰極に向かって一方向に移行する。しかし、高転移を含むいくつかの癌細胞ヒト乳癌細胞およびヒト前立腺癌細胞株PC-3Mは、陽極（+）極15、16に移動する。いくつかの機構が電気走を媒介するか、活性化を含む電界を感知する細胞の能力を説明するために提案されているEGFは、12を受容と、上皮ナトリウムチャネル17は 、PI3KおよびPTEN 18、及びカルシウムの放出メカニズムはまだ完全には理解されていない。15、19のイオンとは、複数のシグナル伝達経路が電気走に関与している可能性がある。 ここで実証する2次元電気走法が付着し、運動性細胞の指向性遊走を特徴付けるために、いずれか18、20。この技術は、から変更され、コンフルエント細胞のシートの個々の細胞遊走10、12、17または遊走をモニターするために有用である鵬とJaffe氏21、及び西村らカスタムメイド、透明なPVC室と10、取り外し可能なcoverslとIPSなどの免疫蛍光イメージングなどの二次分析用の電気走、後に簡単にセルの取得を可能にする。電気走室のガラス表面は、高倍率でかつ蛍光標識された細胞での撮影を可能にする、光互換性がある。また、そのような表面コーティングまたは電荷を変化させるように、ガラス表面の改質に実験計画を可能にする。第1カバーガラス製のスペーサーは、細胞上の電流の流れを最小限にするためにチャンバ内で使用されている。したがって、電流の流れの二乗に比例するジュール加熱は、実験中の細胞を過熱しないでしょう。接続寒天ブリッジは細胞と電極との直接接触を防止し、電気走時の培地のpHまたはイオン濃度の変化を防止する。 二つの非腫瘍形成性ヒト前立腺細胞株は、本研究での電気走応答を調べた。 PRNS-1-1 22とPNT2 23は、両方SV4です低または前立腺特異抗原（PSA）の発現なしに上皮マーカーのサイトケラチン5、8、18と19を表す0不死化、増殖因子依存性細胞株。両方の細胞株は、正常な上皮細胞の多角形の形態を維持するが、染色体異常は、染色体分析22、24で観察された。PRNS-1-1とPNT2はほとんどの実験で同様の挙動を共有するが、それらは腺房構造の形成との違いを示して行う電気走。 3-Dマトリックス、マトリゲル上で、PRNS-1-1細胞は、正常な前立腺組織25に類似したルーメンを有する中空腺房構造を形成する。しかし、PNT2細胞が管腔または偏上皮26せずに固体スフェロイドを形成する。 PRNS-1-1細胞はまた、現在の研究でPNT2よりも高いgalvanotactic応答を実証する。 PRNは、1-1腺房構造と電気走の形成の間の相関はgalvanotactic信号が広報を組織において役割を果たし得ることを示唆しているostate腺組織の内因性電界に応答して動き、そして、これら2細胞株とを区別するためにさらなる特性を提供する。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>pRNS-1-1 prostate cells</td><td></td><td></td><td>Lee, et al. (1994)</td></tr><tr><td>PNT2 prostate cells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95012613-1VL</td><td>Berthon, et al. (1995)</td></tr><tr><td colspan="4">Medium and solutions</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>ウォームアップ 37 °C;Cは、</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清 - プレミアム</td><td>アトランタバイオロジカル</td><td>S11150</td><td>PBSで10%、37>までウォームアップする前に。C 使用前に</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240</td> は<td>、5 ml から 500 ml の培地</td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>VWR</td><td>BDH1133-5GL</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td>-</td><td>137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4および 1.5 mM KH2PO4 を 1,000 ml の H2O、pH 7.4 までオートクレーブ滅菌、37°C まで温めます。使用前のC</td></tr><tr><td>0.25%トリプシン-EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>ウォームアップ 37 °C;C使用前に、細胞を37°Cで3〜5分間処理します。C</td></tr><tr><td colspan="4">Galvanotaxisデバイス</td></tr><tr><td>GalvanotaxisチャンバーPrecision</td><td>Plastics Inc、CA</td><td></td><td>カスタム設計(1/4 "x 2" x 3.5")、無毒、透明なPVCチャンバー。設計仕様については、著者にお問い合わせください。</td></tr><tr><td>ガルバノタキシス電極</td><td>UCD電気工場</td><td></td><td>プラチナコイル電極、フレキシブルコード付き</td></tr><tr><td>ガルバノタキシス電源ボックス</td><td>基板エンジニアリング、CA</td><td></td><td>電圧計付きカスタム設計のDC電源出力</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス、大、45 x 50 mm、No. 1.5</td><td>Fisher</td><td>12-544-F</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス、小、25 x 25 mm、No. 1</td><td>ThermoScientific</td><td>3307</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドポイントマーカー</td><td>ThermoScientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>マリングレードシリコンシーラー、クリア</td><td>3M</td><td>051135-08019</td><td></td></tr><tr><td>高真空グリース</td><td>ダウコーニング</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>6 mlシリンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-561-64</td><td></td></tr><tr><td>日菱シリンジ、1.5 ml</td><td>日菱</td><td>SG-M</td><td></td></tr><tr><td>コットンアプリケーター</td><td>Purtian Medical Products</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Qtips</td><td>ジョンソン&Johnson</td><td>729389</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 180 PVCチューブ&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>8000-9030</td><td>503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall</td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td>make 2% 寒天溶液</td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipments and Software</td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>operated with an an A-4-62 rotor</td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4</td><td>Nexcelom</td><td>自動T4</td><td></td></tr><tr><td>セロメータ計数室</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td>負荷20 &#956;l カル</td></tr><tr><td>チャーテンプウォーミングプレート</td>をカウントするセル溶液 <td>Bel-Art Scienceware</td><td>370150000</td><td>ガルバノタキシスチャンバーを 37 >C&nbsp;</td></tr><tr><td>電動ステージと環境チャンバーを備えたEclipse TE-2000顕微鏡</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor 10X/0.30 対物</td>レンズ <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga EX CCDカメラ&nbsp;</td><td>Qimaging</td><td></td><td>冷却CCDカメラ、単色、12ビット</td></tr><tr><td>圧縮空気、5%CO2</></td><td>Airgas</td><td></td><td>特別注文</td></tr><tr><td>Volocity6.3PerkinElmer</td><td></td><td></td><td>画像取得ソフトウェア</td></tr><tr><td>Improvision OpenLab 5.5.2PerkinElmer</td><td></td><td></td><td>セル追跡ソフトウェアと移行角度を測定するためにカスタマイズ</td></tr><tr><td>FileMaker Pro Advanced、8.0</td><td>FileMaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2008 for Mac</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

前立腺細胞の方向性のある移動を研究するためにカスタム設計された電気走チェンバースを利用

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

生理学的な電場は、胚発生、神経突起成長および上皮創傷治癒における細胞移動を導くような特定の生物学的機能を提供しています。 in vitroで培養細胞に直流電界を印加すると、方向性細胞遊走、または電気走を引き起こす。ここで実証する2次元電気走法は、カスタムメイドのポリ（塩化ビニル）（PVC）チャンバ、ガラス表面、白金電極と細胞が撮像された電動ステージを用いて修飾される。 PVC室と白金電極は、低い細胞毒性を示し、手頃な価格の、再使用可能である。ガラス表面と電動顕微鏡ステージは、画像の品質を改善し、細胞へのガラス表面や治療への可能な修飾を可能にする。我々は2つ​​の非腫瘍形成、SV40不死化前立腺細胞株、PRNS-1-1とPNT2の電気走を撮影。これら2つの細胞株は、同様の移行速度を示し、両方の側に移動カソードが、彼らは電気走における方向性の異なる程度を示します。このプロトコルを使用して得られた結果は、PRNは、1-1 PNT2細胞株は、それらの方向性遊走応答を支配する異なる固有の機能を有することができることを示唆している。

前立腺細胞（PRNS-1-1とPNT2）の2行は、この方法で調査した。両方のライン中の細胞は、2時（ 図5A）の過程で1.0 +/- 0.3ミクロン/分の同じような速度で移動する。しかし、電場の方向性はPNT2ライン（ 図5B）のためPRNS-1-1ラインの0.7 +/- 0.3、および0.2 +/- 0.8である。結果は、それらが位置手がかりに異なる指向性応答を生じる種々の細胞シグナル伝達機構を有していることを示唆し、これら2つの細胞株に（p &lt;0.01、100細胞を追跡した）の電気走の有意差を示す。 <img alt="ガルバノタキシスの速度と方向性の棒グラフ。pRNS-1-1 対 PNT2 グループ。実験結果。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754...

私たちは、特注のガルバノタキシスチャンバー内で移動し、不死化された前立腺細胞に生理的な電場を適用する方法を提示します。この方法を使用して、2つの系統の非腫瘍形成性前立腺細胞が、フィールド内で異なる程度の移動方向性を示すことを示します。

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

この手順の全体的な目標は、印加電界中の細胞の方向性移動を評価するアッセイであるGalvan Axxisを実行することです。これは、最初にGalvan axxisチャンバーを組み立て、次に目的の細胞を播種することによって達成されます。2番目のステップでは、チャンバーを密閉し、タイムラプスイメージングのために電界を印加します。最後のステップでは、個々のセルの移動速度と電界に対する角度を追跡します。最終的には連署します。を使用して、セルが電場にどのように応答するか、およびセルがカソードに方向に移動するかどうかを示すことができます。この技術の主な利点は、二次分析のためにテキサスに投与した後の細胞回収が容易であることと、高倍率で蛍光標識細胞を使用して遊走を撮影することが容易であることです。この方法の視覚化は、チャンバーの組み立て手順をデモンストレーションなしでは習得するのが難しいため、この方法の視覚化は非常に重要です。プラスチック製のガルバンアクシスチャンバーを2つのプロパノールで拭くことから始めます。次に、シリンジを使用して、チャンバーの底面にある円形の開口部の周りにマリングレードのシリコンシーラーを塗布します。シーラントの上に大きなカバーグラスを配置し、綿アプリケーターの端で所定の位置に押し込み、綿棒で余分な接着剤を拭き取ります。次に、ひし形のポイントマーカーを使用して小さなカバーガラスをカットし、6 x 25ミリメートルのスペースを作り、チャンバーを裏返します。次に、シリンジを使用して2本のシリコンのストライプを塗布し、底面ガラスの2つの円形開口部の間にセル接着用の10 x 25 mmのチャネル表面を作成します。次に、円形の開口部の間に2つのガラススペースを接着し、新しい綿のアプリケーターでスペースを押し下げ、示したように余分な接着剤を拭き取ります。シリコーン接着剤が硬化するまで、チャンバーを24時間試してください。翌日、チャンバーを蒸留水に一晩浸して接着剤から酢酸残留物を取り除き、細胞をチャンバーに播種します。先ほど示したように、チャンバーを2つのプロパノールで乾かして拭きます。滅菌PB S3で洗浄し、チャンバー内の2つの円形開口部間の液体の流れを確認します。チャンバーが良好な状態にあることを確認した後、滅菌培養皿に包み、チャンバーを摂氏37度に15分間置きます。チャンバーが電子平衡化している間に、摂氏37度で5ミリリットルのトリプシンEDTAを使用して、前立腺細胞を培養皿から取り外します。5分後、5ミリリットルの10%FBSで反応を中和します。PBSでは、分離した細胞を15ミリリットルのチューブに移し、5分間遠心分離します。200倍、Gで、培地を吸引し、次にペレットを1ミリリットルの培地に再懸濁します。次に、細胞をカウントした後、培地とシードを使用して細胞濃度を1ミリリットルあたり4細胞に8×10に調整します。各チャンバーに350マイクロリットルの細胞懸濁液。細胞をチャンバー内で一晩、37°Cと5%の二酸化炭素で濡れたKimワイプを塗布した培養皿でインキュベートします。翌日、まず各ガルバンAXSチャンバーについて摂氏37度までの10ミリリットルの培養物を温めることにより、上部チャンバーの組み立てを開始します。培地が温まっている間に、インキュベーターからGalvan axxisチャンバーを摂氏37度の温熱プレートに移し、チャンバーを培地ですすいでください。付着していない細胞を除去するには、チャンバー内に400マイクロリットルの培地を残し、シリンジを使用して両方のガラススペースの上に高真空グリースを塗布します。カバーガラスと綿のアプリケーターでチャンバーを密封し、ガラス表面を乾燥させます。次に、高真空グリースをシリンジで塗布し、カバーガラスとチャンバーの隙間を塞ぎます。次に、培地を内側のリザーバーに加えます。気泡を取り除き、リザーバー間の液体の流れを確認します。寒天ブリッジに2インチのPVCチューブを一対切断するには、それらを裏返してから、ピースを100ミリリットルのビーカーに入れます。次に、200ミリグラムのバクトトゥ寒天培地を50ミリリットルのフラスコに加え、10ミリリットルの培地で2%寒天ゲルを作ります。30秒間電子レンジで加熱した後、トランスファーピペットを使用して寒天ゲルをプラスチックチューブにロードし、寒天ブリッジを室温で10分間放置して寒天を固めます。次に、ギャルチャンバーの外側のリザーバーに2ミリリットルの培養液を追加し、寒天ブリッジを内側と外側の培地リザーバーに挿入して電流を流し、移動のタイムラプスイメージングを実行します。まず、ガルバンチャンバーを顕微鏡ステージ上の摂氏37度の環境チャンバーに移し、チャンバーをテープで固定し、10倍の対物レンズの下の細胞に焦点を合わせます。次に、ガルバンAxxis電極を右側にカソードを外側のリザーバーに挿入し、ワイヤーと電極をテープで固定します。次に、電源ボックスのスイッチを入れてチャンバーに電界を印加し、電圧計を使用してチャンバー全体の出力電圧を測定し、長さ25ミリメートルのチャンバーで2.5ボルトに達します。次に、チャンバー全体で10ポイントを選択して10本のタイムラプス動画を生成し、取得条件を10分間隔で2時間に設定します。その後、撮影を開始し、必要に応じて出力電流を調整して、実験中の電界強度を維持します。実験の最後に、チャンバーをステージから取り外し、細胞を95%アルコールに固定します。次に、チャンバーを壊して開きます。カバースリップは後で使用するために保存できます。染色とイメージング。将来の年のためにチャンバーを清掃します。Galvan Axxisを定量化するには、タイムラプス動画を回転させて、カソードを画像の上部に向けます。セルトラッキングソフトウェアにムービーをエクスポートし、各ムービーから各時点における10〜20セルのXY位置を手動で追跡し、南北方向に対する移動距離と角度、セルトラッキングソフトウェアで電界の同じ向きが計算されます。最後に、測定値を保存し、データをデータベースアプリケーションにインポートして、結合された結果を計算します。この代表的なGalvan Axxis実験では、前立腺細胞の系統に、2時間にわたって同様の速度で移動することが決定されました。しかし、電界に対する方向性は、PRNS one one lineで0.7プラスマイナス0.3、PNT two lineで0.2プラスマイナス0.8であり、これら2つの細胞株のガルバン軸に有意な差があることを示しており、それらの細胞シグナル伝達メカニズムが電界に対する直接的な異なる移動応答を示唆している。この技術は、研究者がエレクトロフィールドにおける細胞の方向性移動のメカニズムを探求するのに役立ちます。

utilizing-custom-designed-galvanotaxis-chambers-to-study-directional

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

3D組織培養のタイムラプスイメージングは​​、大脳皮質から分画されたタンパク質抽出物に反応して、神経節隆起に由来する個々の細胞の遊走挙動を調べることができます。...

神経節隆起を培養で生成された細胞の遊走挙動

植された細胞（幹神経堤細胞）の移行を解析するアプローチが説明されています。この方法は、安価な優しい、そのような主要なトランク神経堤細胞培養内細胞間相互作用に由来するもののような渡り鳥の極性にケモキネシスと他の影響の両方からの走化性を区別することができる。...

修正Zigmondチャンバーアッセイを使用してトランク神経冠細胞移動の解析

ECIS /タクシーと細胞走化性の測定

このプロトコルでは、走電性の間に神経前駆細胞の転座に由来する成体脳のタイムラプスイメージングを可能にするために直流電界を印加することを許可するカスタムチャンバーを構築する方法を示します。...

外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ

一次元閉じ込められた微小環境における細胞の自発的な遊走を研究するための定量的方法が記載されている。この方法は、微細加工されたチャネルを利用し、単一の実験では、異なる条件下で多数の細胞の遊走を研​​究するために使用することができる。...

微細加工チャネルにおける細胞移動の研究

細胞の移動は、人間の発達と生命の重要な部分です。細胞遊走を変化させるメカニズムを理解するために、3Dコラーゲンマトリックスの走化性を調査するための平面勾配拡散システムを提示します。...

3Dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム

多くのマイクロ流体デバイスは、エレクトロタキシスの研究で使用するために開発されています。しかし、これらのチップのいずれも、細胞に対する化学的および電界(EF)の影響を同時に効率的に研究することはできません。私たちは、エレクトロタクシス研究で使用するために、より適切に制御された共存するEFおよび化学刺激を提供するポリメチルメタクリレートベースのデバイスを開発しました。...

マルチチャンネルデュアル電界マイクロ流体チップを用いて、肺癌細胞の走電性の研究

視覚走化性アッセイは、走化性因子媒介方向の細胞遊走を制御する方法、真核細胞のより良い理解のために不可欠です。 1）リアルタイム、複数の走化性アッセイの高解像度の監視、および2）を同時に化学誘引物質勾配を可視化し、好中球様HL60細胞内シグナル伝達事象の時空間ダイナミクス：ここで、我々はのための詳細な方法について説明します。...

イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント

このプロトコルはまた、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を決定するために使用される化学誘引物質に応答した細胞遊走を測定するためのカスタマイズ可能な方法を詳述します。...

細胞移動を測定するためのカスタマイズ可能な商工会議所

ここでは、移行と時間をかけて、複数の治療条件下で神経膠腫脳腫瘍幹細胞の侵入を定量化する生細胞イメージング技術について述べる。...

住セルイメージ投射アッセイ研究神経膠腫脳腫瘍幹細胞の遊走と浸潤に

学ぶカスタム電気走チェンバーを用いた前立腺細胞の方向性移動評価法。非腫瘍性前立腺細胞株の異なる電場応答性を比較し、がん研究における細胞移動メカニズムの理解に貢献します。

前立腺細胞の方向性のある移動を研究するためにカスタム設計された電気走チェンバースを利用

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