末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

この手順の全体的な目標は、血液細胞から神経幹細胞を直接誘導することです。これは、最初に血液からCD 34陽性造血前駆細胞を濃縮することによって達成されます。第2のステップは、転写因子を含むセンディウイルスをCD34細胞にトランスフェクションすることです。

次に、選択培地を用いて神経幹細胞を作製します。最後のステップは、誘導された神経幹細胞をニューロン、アストログリア、およびオリゴデンドロサイトに分化させることです。最終的には、免疫蛍光顕微鏡を使用して、得られた細胞の特性評価を行います。

この手法の主な利点は、線維芽細胞から直接ニューロンの持続時間、IPS生成など、既存の方法よりも優れていることですが、この方法はIPSの生成と計算の面倒なプロセスをバイパスしますが、ニューロンに関連し、分化できる大量のニューロン細胞を提供します。私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、付着したトランスフェクションCT 34細胞が実際に初代培養神経原生細胞と非常によく似ていることに気付いたときで、この手順は私の人生の技術者である海兵隊員であることを示しています。テキストプロトコルの指示に従って末梢血単核細胞からCD 34細胞を単離した後、ResusによるCD 34細胞の培養プロセスを開始し、CD34細胞をCD34培地に懸濁し、次いで細胞を1ミリリットルの培地中のウェル当たり10〜5番目の細胞の3倍で24ウェルプレートに播種する。

5%二酸化炭素を含む摂氏37度の組織培養インキュベーターで24時間インキュベートした後、浮遊細胞を回収し、細胞懸濁液を室温でGの110倍で遠心分離します。次に、上清を捨て、細胞を新鮮なCD 34維持培地に再懸濁します。新しい24ウェルプレートを1ミリリットルの培地でウェルあたり10〜5番目の細胞で1回見、5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度でさらに5日間インキュベートし、培地の半分を隔日で交換します。

5日目にここに示すように、CD 34細胞がウェルの底にある間に、上清の上半分を慎重に吸引します。播種後、CD34細胞を回収し、細胞をGの170倍で室温で10分間遠心分離し、上清を廃棄し、前回と同様に細胞を再懸濁し、1ミリリットルの培地中に1ウェルあたり10〜5番目の細胞を1回ずつ新鮮な24ウェルプレートに播種する。次に、cyto tune IPS Sendiリプログラミングキットを解凍します。

まず、チューブの底を摂氏37度の水浴に10秒間浸し、次に室温で完全に解凍します。チューブを短時間遠心分離し、氷の上に置きます。仙台ウイルス混合物は、分析証明書に記載されている各ウイルスの推奨量を該当ロットに混合して調製します。

15の感染の多様性が推奨されます。センダイウイルスミックスをCD34細胞の各ウェルに加える。次に、プレートを静かに振ってウェルを混合します。

24時間後に5%二酸化炭素インキュベーターで細胞を摂氏37度でインキュベートします。形質導入効率を観察します。ここに示されているような細胞凝集体と球体は、形質導入が成功したことを示す指標であることに注意してください。

次に、組織培養インキュベーターで細胞を5〜7日間インキュベートし、付着した細胞が現れ、ここに示すように1日おきに30〜50%のコンフルエントに達するまでインキュベートします。培地の上半分を別のウェルに慎重に移すことにより、培地の半分を交換します。細胞球を新しい球体に移す場合は、等量の新鮮な培地をよく加えます。

倒立顕微鏡を使用して細胞の共流暢さを確認します。細胞が30〜50%コンフルエントになったら、上清を吸引して予備にし、各ウェルに1ミリリットルの神経前駆培地を加えて、上清遠心分離機の球を使用してバックアッププレートを作成し、予備の上清をGの170倍で10分間使用します。次に、上清を吸引し、マトリゲルでコーティングされた24ウェルプレートの神経前駆細胞中プレートにペレットを再懸濁します。

以前と同様に、細胞が60〜80%のコンフルエントに達するまで、細胞の各プレートの培地を隔日で交換します。通常は1週間後です。細胞が必要な合流点に達したら、上清を吸引し、それぞれに1ミリリットルの神経幹細胞培地を追加します。

その後、細胞スクレーパーを使用して細胞を解離し、その後、非常に穏やかなピペッティングを行います。次に、24ウェルプレートの1ウェルから細胞を6ウェルプレートの1ウェルに移します。ウェルプレート。

ウェルにさらにミリリットルの培地を追加し、すべてのウェルで手順を繰り返した後、6ウェルプレートを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。細胞が60%のコンフルエンスに達するまで、1日おきに培地の全量を交換し、その後、未分化神経幹細胞の一部を凍結するために示したように、細胞を1対3の比率で解離およびリフレートします。まず、神経幹細胞培地に20%ジメチルスルフオキシドまたはDMSOを加えて幹細胞凍結培地を調製し、氷上に置きます。

次に、6ウェルプレート内の細胞を解離します。セルスクレーパーを使用し、穏やかなピペッティングを行います。細胞数のために懸濁液のアリコートを予約し、次に細胞が回転している間に室温で170倍Gで細胞を遠心分離し、血液、サイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して懸濁液のアリコート中の細胞をカウントし、1ミリリットルあたり6個の細胞に10の1倍の細胞濃度を与えるために必要な培地の量を計算します。

スピンが終了したら、上清を捨て、ペレットを神経幹細胞培地に10〜6細胞/mLの1回で再懸濁します。次に、等量の凍結培地ピペットを5倍10倍にして5番目の細胞に1ミリリットルの容量でクライオバイアルに加え、製造元の指示に従って細胞を凍結容器で凍結します。6ウェルプレートの神経幹細胞が80%のコンフルエントに達したら、ゴム製のポリスマンを使用して神経幹細胞を切り離し、穏やかなピペッティングで解離します。

細胞懸濁液を滅菌チューブにプールします。ヘモ、サイトメーター、または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、神経幹細胞培地を使用して細胞懸濁液の濃度を1ミリリットルあたり10倍から5番目の細胞に調整します。次に、細胞懸濁液の1ミリリットルをポリDリジンにピペットで移し、24ウェルプレートの1ウェルにラミネートコーティングカバースリップをピペットで移し、所望のウェル数で手順を繰り返します。

前と同じように24時間インキュベートします。インキュベーション時間が経過したら、培地を吸引し、神経分化と交換します。培地は摂氏37度、二酸化炭素5%で2週間インキュベートし、2週間後に週に2回培地を交換します。

ニューロン幹細胞は、ここに示すように完全に分化し、免疫蛍光染色などの下流アプリケーションの準備が整っている必要があります。最初の2つの画像は、神経幹細胞が巣を作り、SOXを2つ発現していることを示しています。3 番目の画像は OCT 4 が表現されていないことを示していますが、DPI は核マーカーとして使用され、スケール バーは 200 ミクロンを表しています。

ビデオで概説されている分化プロトコルに従った後、分化したニューロンはニューロンマーカーのβ 3チューブリンを発現します。ヒトの神経幹細胞は、グリア細胞に分化することもできます。アストロサイトに分化すると、細胞はアストロサイトマーカーGFAPを発現します。

最後に、この画像では、細胞がオリゴデンドロサイトに分化し、オリゴデンドロサイトマーカーを発現しています。おお、4つ。一度習得すれば、末梢血からの人工ヒト神経幹細胞の生成は約3週間で行うことができます。

適切に実施されれば、神経幹細胞はさらに分化したニューロンであり、その方法が不明瞭なのは、長くて複雑なIPS生成プロセスであり、その開発後に患者固有のニューロン培養を生成するための簡単なオプションになる可能性があります。この手法は、神経科学の分野の研究者が、特に個々の患者サンプルから、特定の疾患における遺伝的差異をよりよく表す可能性のある、さまざまな神経疾患に対する個々の細胞培養モデリングを探求するための道筋です。