神経治療応用のための遺伝子組み換え間葉系幹細胞の特性評価

ジェニックマウス間葉系幹細胞(骨髄由来の多能性細胞)から始めます。

細胞は、神経細胞の成長と生存をサポートするGFPおよび治療用神経栄養因子を発現するように操作されています。

細胞をバッファーで洗浄し、細胞の完全性を維持するために固定します。

バッファーで再度洗浄し、溶液を加えて細胞膜と核膜を透過化し、非特異的結合部位をブロックします。

分裂細胞の核でのみ発現する細胞増殖マーカータンパク質を標的とする一次抗体を導入します。

バッファーで洗浄して、結合していない抗体を除去します。

一次抗体を標的とする蛍光色素結合二次抗体とDNA結合色素を加えて核を対比染色します。

バッファーで洗浄して、結合していない試薬を除去します。

プレートをハイコンテントスクリーニングシステムにロードし、画像をキャプチャして蛍光シグナルを検出します。

細胞増殖マーカーの発現は活発な細胞分裂を示しており、トランスジェニック細胞が神経治療への応用に適していることを示唆しています。

Ki-67細胞増殖アッセイを実行するには、0.1モルのリン酸緩衝液を使用して細胞培養物を1分間すすぎます。洗浄を繰り返した後、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を室温で20分間使用して培養物を固定します。

固定後、PFAを除去し、PBSを使用してウェルを3回、それぞれ7分間すすぎます。テキストプロトコルに従って細胞をブロックした後、各ウェルに100マイクロリットルの一次抗体溶液を塗布します。プレートを覆い、摂氏4度で一晩インキュベートします。

細胞を洗浄ごとに7分間3回洗浄した後、二次抗体を塗布し、暗所に置き、室温で90分間インキュベートします。さらに3回洗浄した後、プレートに蓋をして、イメージングまで摂氏4度で保管します。

自動イメージングを実行するには、免疫標識プレートをHCSシステムにロードし、プレートを20分間平衡化させます。HCSシステムの画像取得および解析ソフトウェアを開きます。10倍対物レンズの取得設定は、カメラビニングを1に、ゲイン設定を2にして選択します。

自動露光機能を使用して、セルが存在するZ面を見つけ、目的の各波長のオフセットを計算します。ここで示した分析では、DAPI、GFP、およびCy3の画像をキャプチャします。

ネガティブコントロールウェルが画像取得のシグナルを示さない最大強度レベルを選択します。ポジティブウェルに同じしきい値設定を使用します。最後に、テキストプロトコルに従って画像分析を実行する前に、画像をキャプチャしてデータベースに保存します。