マルチとシングルセルベース球アッセイを用いてヒト卵巣癌細胞における幹細胞特性の評価

この手順の全体的な目標は、マルチセルおよびシングルセルベースのスフィアアッセイを使用して、ヒト卵巣がん細胞の幹細胞特性を評価することです。これは、最初にSOX 2レポーターRFPレンチウイルス形質導入細胞をPur Mycin処理によって選択することによって達成され、第2ステップでは、RFP陽性細胞とRFP陰性細胞が分離され、ウェルごとに単一またはマルチセルコロニーとして事実によってプレーティングされます。次に、一次球形成を顕微鏡で解析し、一次球体培養物を解離して再めっきし、二次球形成の解析を行います。

最終的に、これらのスフィアアッセイは、スフィア形成能力を示すと推定される卵巣がん幹細胞の割合を計算するために使用されます。この方法は、がん幹細胞の可能性のある集団は何か、腫瘍バッグ全体にどのような頻度が含まれていたかなど、がん幹細胞分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は卵巣がん幹細胞の同定に関する洞察を得ることができますが、乳がんなどの他の固形腫瘍実体からがん幹細胞を単離するためにも適用できる可能性があります。

ヒト卵巣癌細胞にレンチウイルス粒子を形質導入してから24時間後、ウイルス上清を除去し、PBS培養で細胞を洗浄します。細胞を完全な培地に48時間保存します。次に、培地を変更し、5日後にピロマイシンのミリリットルあたり10マイクログラムを追加します。

翌日、1〜1000希釈で培養物をシールドで処理します。PBSで細胞を洗浄し、次に0.05%tripsin EDTAで細胞を剥離します。3分後、完全培地で反応を停止します。

細胞をカウントし、Gの300倍、室温で5分間遠心分離します。細胞を0.5〜1ミリリットルの滅菌PBSに慎重に再懸濁し、得られた細胞懸濁液を40マイクロメートルフィルターで濾します。細胞を1ミリリットルあたりの6細胞希釈の5倍10に調整し、次に超低アタッチメント96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの球体を中程度に加えて、次に単一細胞ベースの球体アッセイを行います。

シングルセルモードを使用して、プレートの各ウェルに1つのセルをソートします。次に、細胞を顕微鏡でスコアリングして、めっき効率を評価します。新鮮な球体、37°Cの培地、5%CO2で細胞をインキュベートし、毎日の基本的な線維芽細胞成長因子と上皮成長因子の補給を行います。

1週間後、光学顕微鏡で出現する腫瘍球の数と、蛍光顕微鏡で統合されたレポーターシステムからの蛍光シグナルの存在を決定します。直径が100マイクロメートルを超える球体を大きな球体と数え、直径が50〜100マイクロメートルの球体を小さな球体として数えます。セルクラスターではなく、実際の球をカウントするように注意してください。

次に、RFP陽性またはRFP陰性のセルを形成する球の割合を、継代する式に従って計算します。球体は、各ウェルの内容物を個々の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移すことから始まります。次に、各ウェルをPBSで3〜5回すすぎ、すべての球体を回収し、Gの300倍と室温で細胞を10分間スピンダウンします。

遠心分離後、スナットを取り外し、ペレットを200マイクロリットルの0.05%tripsin EDTAで37°Cのソフトシェーカーで5分間懸濁します。5分後に大きな球体が見えない場合は、100マイクロリットルのピペットチップで細胞溶液を静かに回転させ、500マイクロリットルの完全培地を加えてトリプシンを不活性化します。スピンダウンした細胞は、ペレットを球体培地に慎重に再懸濁し、得られた細胞懸濁液を40マイクロメートルのフィルターを通して排出します。

最後に、単一細胞の連続再めっきのために、100マイクロリットルの球体中の1つの一次球体から単一細胞を播種し、新しい超低付着96ウェルプレートでウェルあたり培地を調製する。次に、一次球アッセイと同じ式を使用して、二次球で球体を形成する細胞の割合を評価します。マルチセルベースのスフィアアッセイでは、RFP陽性ヒト卵巣がん細胞の約40%が、RFP陰性細胞のわずか20%と比較して、プライマリスフィアアッセイで個々の腫瘍スフィアを生じさせました。

驚くべきことに、MGEMおよびD-M-E-M-F 12ベースの培地の両方で、より少ない数のプレーティングセルからより多くの球がカウントされ、このアッセイの結果にプレーティングモダリティが大きく偏っていることが示されています。対照的に、1%メチルセルロースを添加して細胞を固定化する場合、球体形成の効率は、マルチセルベースの球体培養における細胞密度とはほとんど無関係です。RFP陽性球の細胞の約35%は、培養7日後に赤色蛍光シグナルを失い、これらの細胞が分化したことを示唆していますが、65%以上の細胞がRFPシグナルを保持していることから、自己複製能力が示唆されています。

対照的に、最初にRFP陰性の細胞から生成された球体からの細胞はRFP陰性のままであり、これらの条件下では幹細胞電位を再確立できないことを示しています。単一細胞から作製した球体に対して蛍光顕微鏡を行なった結果、これらのデータが確認され、RFP陽性細胞に由来する単一球体にはRFP陽性細胞とRFP陰性細胞の両方が含まれていることが実証されています。一方、RFPネガティブセルに由来する球体は、この手順に従って赤色信号の欠如を保持します。

抗体、染色、または定量PCRによる遺伝子発現分析などの他のミーアを実行して、重度の形成能力を持つ細胞をさらに特徴付けることができます。この手順を試行する際には、免疫抑制マウスでのin vivo移植アッセイを実施して、球体開始細胞の腫瘍幹細胞特性を検証する必要があることを覚えておくことが重要です。