Name: レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学ぶレンチウイルス形質導入法を用いたマウス腸オルガノイドの遺伝子導入と下流解析。定量RT-PCR、RNAマイクロアレイ、免疫組織化学による検証が可能な信頼性の高いモデルを構築します。

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J. Heijmansは、オランダ癌財団（KFW）からの奨学金によって支えられています。G.R. van den Brinkは、欧州共同体の第7次フレームワークプログラム（FP7/2007-2013)/欧州研究理事会助成金契約番号241344に基づく欧州研究会議からの資金提供と、オランダ科学研究機構（GvdB）からのVIDI助成金によって支援されています。

トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（PEI）の調製<ol><li> H 2 O 100ml中にPEIの約150mgの溶解</li><li>溶液が透明になるまで塩酸を加えてpHを7.4に溶液を調整し、完全に溶解するまで撹拌する。これは、10〜60分を取り、1mg / mlの最終濃度に水を追加してもよい。 </li><li>ときに明確な、5ミリリットルの分量で℃の冷凍庫-80℃で滅菌した0.22μmのフィルターとストアを介してPEI溶液をフィルタリングする。 </li></ol>レンチウイルス粒子の2生産 1日目： <ol><li>細胞株の培養液162 25cm 2フラスコまたは大きなペトリ皿中の60％-80％集密に分割HEK293T細胞（DMEM、10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび2mMグルタミンサプリメントを補充した）。 </li></ol> 2日目： <ol start="2"><li>一緒に添加することにより、総プラスミドDNAの45μgのを含有するDNAトランスフェクション溶液を準備レンチウイルスパッケージングベクター（pVSVgの7μgの、のpRSVのREV5μgの、PMDLの13μgの）と、興味や関心のあるshRNAの遺伝子をコードするレンチウイルスプラスミド20μgの。 DMEMを用いて、1ミリリットルの容積に調整します。 </li><li> DMEMの930μlに1 mg / mlのPEIの90μLを添加することにより、PEIのトランスフェクション溶液を調製し、室温で5分間インキュベートする。 </li><li> PEI溶液へのDNAのトランスフェクション溶液を加える。ボルテックスまたは回数を反転し、DNAトランスフェクション溶液を得るために、室温で5分間インキュベートする。 </li><li> HEK293T細胞へのDNAのトランスフェクション溶液2mlを滴下すると、37℃で加湿細胞培養インキュベーター中で4時間インキュベートする。 </li><li> 4時間後、PEIを除去して、培地をリフレッシュ。これは、新たな培地を添加する前に細胞を洗浄する必要はない。 注：PEIは4時間よりも長く細胞毒性およびインキュベーション時間はHEK293T細胞に害を引き起こす可能性がある。 </li></ol> 4日目： <ol start="7"><li> Supeのを交換してください新しい培地でrnatant。上清（ウイルスを含む）を保持する。これは、ステップ2.10において使用される。 </li><li> 15ミリリットルのフラスコに上清を入れてください。死細胞、500×gで5分間遠心分離を削除するには。 </li><li>大60ミリリットル注射器を用いて0.45μmのフィルターで上清を押してください。 4℃で一晩保管してください。 </li></ol> 5日目： <ol start="10"><li>上澄みの第二のバッチを収集。ステップ2.8から2.9のように遠心分離し、フィルター。 </li><li> 90分間超遠心機50,000×gでのステップ2.9と超遠心管中で2.10と遠心機からの上清をプール。 </li><li>非常に慎重に超遠心管を含むカプセルを取り出し、遠心内側チューブの向きを覚えて、層流フードに入れた。 </li><li>ペレットは、チューブの上側になるような方法で慎重に超遠心管とデカント媒体を保持開放カプセル。ウイルスのペレットが視覚化するのが難しい場合がありますので、何に覚えているチューブの側面は、ペレットを形成しているでしょう。マイクロピペットを取り、超遠心分離管の底部の側に表示されている不透明な茶色のペレットを攪拌しないように注意しながら、媒体の最後のビットを削除する。 </li><li> 10 mMのニコチンアミド、10μMCHIR99021、10μMのY27632及び8 / mlのポリブレンを補足したオルガノイド培養液500μlにこのペレットを再懸濁。高力価ウイルスを直接オルガノイドをtransductするために使用されるので、この培地中で再懸濁することが重要である。 </li><li>オプション：-80℃における250μLの2回に分けて等分し、この中でウイルスを凍結する。 </li></ol>オルガノイド3.レンチウイルス形質導入 0日目： <ol><li>約50の小さなオルガノイドを得ることを目指し、新たな井戸に形質導入2日前オルガノイドのフル0.95センチメートル2うまく分割します。以前に公開されたプロトコル1（ 図3A、B）に応じてオルガノイド分割します。 </li><li>嚢胞ハイパー増殖陰窩（ 図3C）を取得するために、10μMCHIR99021および10 mMのニコチンアミドを含む培養培地をオルガノイドサプリメント。 注：たてスプリットオルガノイドはCHIR99021の存在下で増殖させた場合嚢胞性陰窩は、最高の開発します。 </li></ol> 2日目： <ol start="3"><li>それによってP1000マイクロピペットとの混合物を破壊し、ピとマトリゲルとメディアダウンによる収穫オルガノイド。 15ミリリットルチューブに混合物を配置します。 </li><li>遠位開口部を溶融することにより減少されたパスツールピペットを用いてさらに混乱させる。遠心分離機は、100×gで5分間ペレット化しオルガノイド。 注：遠心機の大きさに依存は、異なる遠心分離速度を使用しています。これは、破壊されたオルガノイドを混合物から分離された正確な速度を求める必要がある。 </li><li>上清を除去し、予め温めておいた500μlのを追加する1×トリプシン（0.25％トリプシンに似ています）。トリプシンでオルガノイドを再懸濁し、インキュベート37℃の水浴中で3分間。 </li><li>細胞株の培養培地中の3.5を加えてトリプシンを不活性化（DMEM、10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよびグルタミンを補充した）。 500×gで5分間遠心。 </li><li>メディアの約20μlのペレットを残して上清を取り除きます。 48ウェルプレート上のウェルに培地のこの最後の少量オルガノイドを転送します。 </li><li>ステップ2.14で説明したように、伝達媒体中の高力価レンチウイルスを追加し再懸濁し、3.10に進みます。低い形質導入効率に遭遇した場合は、ステップ3.9を添加してもよい。 注：効率的な形質導入のために、典型的オルガノイドの1ウェルに高力価レンチウイルス250μlのの1アリコートを追加します。このプロトコールのステップ2に記載したように、これは、単一の生産からのすべての収穫レンチウイルスの50％を占める。 </li><li>オプション：32に予め温め遠心機でオルガノイドを含む48ウェルプレートを置くことによってピノキュレーションを行い、形質導入効率を向上させるために6; C、1時間、600×gで回転させる。 </li><li>培養インキュベーター中オルガノイド、ウイルス混合物を入れて形質導入を可能にするために培養インキュベーター中、37℃で1時間インキュベートする。 </li><li>オプション：さらに培養インキュベーター中、37℃でさらに3時間インキュベートオルガノイドを、形質導入効率を向上させることができる。 </li><li>オルガノイド培養液の1ミリリットルを追加し、オルガノイドウイルス混合物を再懸濁し、オルガノイドをペレットに850×gで5分間微量マイクロ遠心チューブと遠心分離機に移す。 </li><li>上清を除去し、氷冷マトリゲル20μlのペレットを再懸濁。それは暖かくなったときに材料が固化するので、回数のために冷PBSアップピペットで氷下で冷却されたピペットチップを使用しています。 </li><li> 48ウェルプレートにウェルの中央に小滴を入れて、固化し、15分間37℃で培養インキュベーター中でインキュベートする。 </li><li> 15分後、慎重に補充したオルガノイド培養培地250μlを添加する10 mMのニコチンアミド、10μMCHIR99021および10μMY27632。小型破砕オルガノイドの断片は24時間以内に小さな嚢胞オルガノイドに形成することになる。 </li></ol> 5日目： <ol start="16"><li>メディア更新し、選択抗生物質で補う（ピューロのために、4 / mlのを使用します）。 </li></ol> 7日目： <ol start="17"><li>選択抗生物質を補充した標準オルガノイド培養液、ための媒体を交換してください。 注：出芽は2~3週間CHIR99021の撤退後に完了します。選択後、オルガノイド、選択抗生物質なしに成長させることができる。 </li></ol>定量的RT-PCRまたはマイクロアレイ4.オルガノイドRNAの準備<ol><li> RNA調製のために、製造者のプロトコールに従って市販のキットを使用する。オルガノイドから培地を除去し、バッファRLT350μlのを追加し、ストレートオルガノイドを含むマトリゲルのドームにβメルカプトエタノールを補充した。 materiを再懸濁P1000のマイクロピペットを用いてピペッティングすることによりRLTでアル。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、さらにRNAの準備を行います。 </li><li>オプション：製造業者のプロトコールに従って50μgの総RNAの初期入力を必要とする、オベーションピコWTAシステムを使用して増幅することによってRNAの収量を増加させる。 </li><li>オプション：RNAマイクロアレイの前に、品質管理のために、製造業者のプロトコールに従って8.5以上（ 図5）のRNA完全性番号（RIN）を目指して、真核生物全RNAナノチップを使用して2100バイオアナライザー上で実行したサンプル。 </li></ol>パラフィン包埋し、免疫組織化学5.処理オルガノイド<ol><li>パラフィン、液体を保持する穴に前加温アルミニウムブロックを70℃のインキュベーター中に嵌合する直径12mmのガラス管を埋め込むオルガノイドの開始前。 </li><li>そのまま埋め込まれたオルガノイドを残して、完全に成長したオルガノイドで単一のウェルを取り、培地を除去。 </li><li> 1ミリリットルを追加PBS中の4％パラホルムアルデヒドのストレートによく、どこでも1時間一晩に4℃で固定してください。 </li><li>氷冷PBS 1mlのホルムアルデヒドを交換してください。 オプション：このステップの後、4℃で1週間までのPBSで固定オルガノイドを保つ。 </li><li> 1mlのPBSで固定オルガノイドを再懸濁し、ガラスバイアルに入れる。 </li><li>オルガノイドは、1分間の底に沈むPBSをデカントし、エオシン溶液の液滴のカップルが埋め込みプロセスを通してオルガノイドの可視化を可能にするために溶解した70％エタノールで代わっ。 </li><li>室温で70％エタノールでオルガノイドのままにしておきます。 30分後、慎重にあるため若干のピンクがかったエオシン色の目でオルガノイドを視覚化することができるという、デカンテーションによって70％のエタノールを除去。 96％エタノールに埋め込むソリューションを交換してください。 </li><li>手順を繰り返し5.7、次の1と埋め込みソリューションを交換するたびに。続いて、次のソリューションを通じてオルガノイドを渡す：70％エタノール、90％エタノール、96％エタノール、100％ETHAをタノール、100％エタノール、キシレン、キシレン。 </li><li>最後のキシレン洗浄をデカントし、チューブにパラフィンを注ぐ。 30分間、70℃でアルミブロックを温め前にすぐにチューブを入れて、新しいクリーンなパラフィンでパラフィンを交換してください。 </li><li>大きな開口部を予め温めパスツールピペットを用いて、パラフィンブロックの型にオフパラフィン及びピペットオルガノイドを注ぐ。ブンゼンバーナーを使用して、パスツールピペットを暖かく保つ。流動パラフィンの小さな層にパラフィンブロック金型内のすべてのオルガノイドを置きます。 </li><li>できる限り、温め解剖針を用いてパラフィンブロック金型の中心に向かってすべてのオルガノイドを操作してみてください。ブンゼンバーナーを使用して、解剖針を暖かく保つ。 </li><li>鋳型内のオルガノイドの局在化​​が良好である場合に、パラフィン層を固化するためにわずかに金型を冷却する。 </li><li>上に多くのパラフィンを注ぐことにより、ブロックを終了し、標準的な組織学的埋め込みカセットを追加します。 </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+B%2C+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin1%2C+a+novel+intestinotrophic+mitogen%2C+ameliorates+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871(2013).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li>
<li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li>
<li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li>
<li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

現在のビデオプロトコルは、プライマリ腸上皮からオルガノイドのレンチウイルス形質導入および定量的RNA技術と免疫組織化学を使用して、これらのオルガノイドの下流の分析を記載する。 レンチウイルス形質導入は、多くの場合、培養プレート中の付着または浮遊細胞で行われる。オルガノイドの三次元構造は、ウイルス粒子に浸透し、それらを困難にするので、有効性を高めるために多くの方法が使用されている。 CHIR99021を使用したオルガノイドの前処理は、形質導入後、増殖し、それによって生存能力を向上させます。これは、単一の細胞が生存率の低下しておりますので、トリプシン処理した後に小細胞クラスターを維持することが重要である。マウスレトロウイルスを用いたウイルスの形質導入とは対照的に、レンチウイルス形質導入は、より効率的であり、通常、ES細胞10に増加伝達効率に公知の技術をスピノキュレーションを必要としない。マウスレトロウイルスまたはWHを使用する場合レンチウイルス形質導入の収量が低い効力エン、スピノキュレーションは、任意の形質導入率を高めるために利用することができる。最大限2 0.9...

腸上皮は、それが癌や幹細胞の研究から幅広い関心を引き付けるために引き起こした最も急速に増殖する身体組織の一つである。 2009年には技術が3次元構造1を保全、マトリゲルに小腸陰窩の長期的な文化を生成するために出版された。これらの構造は、腸のオルガノイドと呼ばBMPのシグナル伝達経路阻害剤のノギン（ノグ）を含む定義された成長因子の数は、1（Rspo1）をrspondinはWntシグナル伝達経路の増強剤を補充した周囲の媒体との、標準的な技術を用いて培養することができ上皮成長因子（EGF）は、すべての腸の増殖2-4を増強することが見出さ。 オルガノイドは、それらが非変異している点で、伝統的な癌細胞株を上回る幹細胞の階層構造を維持している、発生期の小さなint型で見つかったすべての細胞系統にそのまま携帯分極、展示分化を表示estinal上皮。これらは導入遺伝子を担持するように形質導入され得るか、またはRNA干渉は5構築ので、コストと速度のファセットトランスジェニックマウスを用いた実験を上回るため、特定の遺伝的要素を研究するために使用される。オルガノイドにおけるトランスジェニック発現は、マウスレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは6,7のいずれかを用いて行うことができる。による有糸分裂細胞もっぱら8を形質導入することが可能なマウスレトロウイルスの制限のため、レンチウイルス形質導入は、より頻繁にオルガノイドのように感染することが困難である細胞のために使用される。 ウイルス形質導入および安定的に発現するトランスジェニックオルガノイド分析および免疫組織化学、定量的RNAを含む、下流の分析の多数のために使用することができる。総合すると、主要な腸上皮細胞からオルガノイドの文化は、特定の実験室の要件なしに実装するのは簡単ですルーチン技術へと進化してきました、およびCEにおける新規標準となっている腸上皮の研究におけるLL文化。 オルガノイドでのウイルス形質導入およびその後の下流の分析の技術は、実行することが、我々は、培養オルガノイドのレンチウイルス形質導入のための方法を示し、このビデオプロトコルを生成したオルガノイド実験を支援するために面倒である。我々はさらに、収率を増加させるので、RNA技術または免疫組織化学を用いて、下流の分析の性能を向上させることができる方法を正しい処理オルガノイドを示す。説明される技術は、同様に、結腸オルガノイドに適用することができるが、プロトコルでは、小腸の陰窩から誘導されるオルガノイドが独占的に使用された。

<table><tbody><tr><td>ポリエチレン イミン</td><td>ポリサイエンス</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培地</td><td>ロンザ</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>ロンザ</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td></td><td>BD BD 356231</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl システイン</td><td>Sigma</td><td>A9165-1G</td><td></td></tr><tr><td>マウス Egf</td><td></td><td>PMG8045</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>glutamax 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Y27632&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>シグマ</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>シグマ</td><td>N0636</td><td></td></tr>トリ<tr><td>プシン</td><td>ロンザ</td><td>BE02-007E</td><td></td></tr><tr><td>プロマイシン</td><td>シグマ</td><td>P7255Rneasy</td><td></td></tr><tr><td>ミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-メルカプトエタノール</td><td>メルク</td><td>8,057,400,250</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Pico WTAシステム</td><td>NuGen</td><td>3300-12</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル円錐形12&nbsp;mm×75&nbsp;mm 5&nbsp;ml</td><td>VWR</td><td>LSUKM12</td><td></td></tr><tr><td>エオシン イエロー</td><td>VWR</td><td>1,159,350,025</td><td></td></tr></tbody></table>

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

オルガノイドと呼ばれる腸管絨毛構造は、適切な成長因子を補給することで、3次元的に持続的な培養を維持することができます。オルガノイドは、恒常性幹細胞の分化、細胞の極性、および成体腸上皮に知られているすべての最終分化細胞タイプの存在の点で元の組織と非常に類似しているため、上皮に関する実験的研究において不可欠なリソースとして機能します。オルガノイドでレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用して導入遺伝子または干渉RNAを発現させる可能性は、腸上皮および腸幹細胞の機能解析の機会を増やし、速度とコストにおいて従来のマウストランスジェニックを上回っています。現在のビデオプロトコルでは、ドキシシリン誘導性導入遺伝子、または過剰発現または遺伝子ノックダウンのためのIPTG誘導性ショートヘアピンRNAを使用して示されるレンチウイルスベクターによる小腸オルガノイドの形質導入を利用する方法を示します。さらに、オルガノイド培養では、実験的処理によっても減少する可能性のある微小な細胞数が得られることを考慮し、定量的RT-PCR、RNA-マイクロアレイ、免疫組織化学を目的としたダウンストリーム分析のためのオルガノイドの処理方法について説明します。腸管オルガノイドでの導入遺伝子発現と遺伝子ノックダウンを可能にする技術は、これらの腸上皮構造が持つ研究の可能性に貢献し、オルガノイド培養を細胞培養の新たな標準として確立します。

オルガノイドレンチウイルス形質導入 レンチウイルス粒子を使用したオルガノイド形質導入の技術は前と形質導入時のオルガノイドの正しい取り扱いに依存します。オルガノイド（ 図3A）を培養し、それらは単一の陰窩（ 図3B）に破砕した。既報の通り、GSK3阻害剤CHIR99021の存在下で培養されたこれらの単一陰窩は、嚢胞性陰窩9（ 図3C）をとなった。その後オルガノイドは、単一の細胞にウイルス粒子の侵入を可能にするためにトリプシン処理した。レンチウイルス粒子を細胞に形質導入​​する際に、多くの方法は、スピノキュレーションまたは長期インキュベーションなどの伝達効率を向上させることを試みてもよい。高力価PGK-eGFPをレンチウイルスは、蛍光顕微鏡法によって形質導入効率の可視化を可能にするために使用した。このプラスミドオルガノイドの形質導入効率が高く、100％に近づいた（FIGUR電子4E、F）。レンチウイルス粒子（ ...

このビデオプロトコルでは、一次腸上皮のオルガノイドにおけるレンチウイルス形質導入と、定量的RT-PCR、RNA-マイクロアレイ、免疫組織化学によるこれらの培養物の処理と下流分析について、段階的に説明します。

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

本手順の全体的な目的は、腸管オルガノイドの下流解析に向けて、マウス初代腸上皮から安定的に導入されたオルガノイドを作製することである。まず、HEK 293 T細胞にレンチウイルスパッケージングベクターと目的遺伝子をコードするレンチウイルスプラスミドを導入し、高タイターのレンチウイルス粒子を産生させる。次に、培養したマウス腸管オルガノイドを複数の成長因子で前処理し、嚢胞状の過増殖クリプトを得る。次に、高タイターのレンチウイルスを用いてオルガノイドを形質導入し、導入後のオルガノイドをマトリゲル内で培養します。最終ステップとして、十分に成長した形質導入オルガノイドをパラフィンに包埋し、後続の免疫組織化学分析に供します。最終的に、レンチウイルスによるオルガノイドの形質導入は、信頼性が高く、再現性があり、かつ迅速な腸上皮のin vitroモデルにおいて遺伝子改変を導入するために用いられます。がん細胞株などの既存の手法と比較して、この手法の主な利点は、オルガノイドが変異のない置換幹細胞階層であることです。細胞極性においては、小腸上皮のあらゆる異なる細胞型に分化することが可能です。さらに、導入されたオルガノイドを用いることで特定の遺伝的要素を研究でき、コストと速度の面でトランスジェニックマウスの使用を上回る利点があります。レンチウイルス粒子の作製は5日間のプロトコルであり、まずHEK 293T細胞を162 cm²のフラスコを用い、細胞培養培地にてコンフルエンシーが60～80%になるように播種することから始まります。翌日に向けて、細胞を37 °Cの加湿細胞培養インキュベーター内で一晩培養します。翌日、プロトコルの本文に記載されている通りに、DNAトランスフェクション溶液およびポリエチレンイミン（PEI）トランスフェクション溶液を調製します。DNAトランスフェクション溶液をPEI溶液に加え、ボルテックスミキサーで攪拌するか、数回転倒混和し、室温で5分間インキュベートします。DNAトランスフェクション溶液とPEIの混合液2 mLをHEK 293T細胞に滴下し、37°Cで4時間インキュベートします。培地を更新します。PEIを除去するため、細胞を37°Cで2日間インキュベートし、4日目に50 mLチューブに上清を回収します。細胞に新しい培地を加え、フラスコをインキュベーターに戻します。回収した上清を500 Gで5分間遠心分離します。死細胞を除去するため、60 mLの大型シリンジを用いて、SUPERNATを0.45 µmのフィルターでろ過します。ろ過した上清を4 °Cで一晩保存し、翌日に使用します。2回目の上清についても、1回目と同様に回収、遠心分離、およびろ過を行います。2回分の上清を超遠心管にまとめます。50,000 GSで90分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、超遠心管が入ったカプセルを非常に慎重に取り出し、ラミナーフローフード内に設置します。超遠心管を保持しているカプセルを開き、ペレットがチューブの上側に来るようにして、培地を慎重にデカントします。ウイルスのペレットは視認しにくい場合があるため、チューブのどちら側にペレットが形成されたかを覚えておくことが重要です。次に、マイクロピペットを使用して、超遠心管の底部の側に見える不透明な褐色のペレットを乱さないように注意しながら、残りの培地を除去します。このペレットを、ニコチンアミドキナーゼ阻害剤およびpoly brain resusを添加した500 µLのオルガノイド培養培地で再懸濁します。導入の2日前には高タイターウイルスを直接オルガノイドの導入に使用するため、この培地で懸濁することが重要です。0.95 cm²のウェルいっぱいにあるオルガノイドを、48ウェルプレートの新しいウェルに分注します。既報のプロトコールに従い、オルガノイド培養にて約50個の小型オルガノイドを得ることを目的とする。培地にはグリコゲン合成酵素キナーゼ阻害剤およびニコチンアミドを添加する。嚢胞性過増殖陰窩を得るため、導入当日にオルガノイドを2日間培養します。P 1000マイクロピペットを用いてオルガノイドを回収します。Matrigelと培地をピペッティングして上下に混ぜ合わせ、混合物を分散させます。混合物を15 mLチューブに入れます。先端の開口部を加熱して狭めたピペットを用いて、混合物をさらに分散させます。100 Gで5分間遠心分離し、オルガノイドをペレット化します。その後、上清を除去し、予熱した1x trypsinを500 µL加えてオルガノイドを再懸濁し、3分間インキュベートします。37 °Cのウォーターバス内で、細胞株培養液を3.5 mL添加してトリプシンを不活化し、500 ×gで5分間遠心分離します。上清を除去し、約20 µLの培地の中にペレットを残します。この少量の培地に懸濁したオルガノイドをウェルに移します。48ウェルプレートを用いて、あらかじめ調製した導入培地中の高タイターレンチウイルスをオルガノイドに加え、再懸濁させる。オルガノイドとウイルスの混合液を培養インキュベーターにて37 °Cで1時間インキュベートし、導入を行う。1時間後、オルガノイド培養培地1 mLを混合液に加え、再懸濁させた後、混合液をマイクロ遠心チューブに移し、850 ×gで5分間遠心分離する。オルガノイドをペレット化するために、上澄みを除去してペレットを再懸濁させます。20 µLの氷冷Matrigelに懸濁し、ドロップレットをウェルの中心に配置します。48ウェルプレートを用い、37 °Cで15分間インキュベートしてください。液滴が15分後に凝固した後、ニコチンアミドおよびキナーゼ阻害剤を添加したオルガノイド培養培地250 µLを慎重に加えます。パラフィンを液状に保つため、アルミブロックをインキュベーター内で70°Cに予熱します。十分に成長したオルガノイドが入ったシングルウェルから培地を取り除き、埋め込まれたオルガノイドをそのままにして、1 mLの4%パラホルムアルデヒド（PBS溶液）をウェルに直接加えます。その後、パラホルムアルデヒドを1 mLのPBSに交換します。固定したオルガノイドをPBSで再懸濁し、ガラスバイアルに移します。オルガノイドが底に沈殿するまで1分間静置します。次に、PBSをピペットで吸い出し、数滴のエオシン溶液を溶解させた70%エタノールと置換します。包埋プロセス全体を通してオルガノイドを可視化できるように、オルガノイドを70% ethanolに浸し、室温で30分間静置します。70% ethanolをピペットで慎重に除去します。エオシンによるピンク色のおかげで、オルガノイドを目視で確認することができます。埋め込み溶液を96%ethanolに置換し、この状態で室温に30分間放置します。続いて、オルガノイドを70%ethanol、90%ethanol、96%ethanol、100%ethanol、100%ethanol、キシレン、キシレンの順で順次浸漬させます。最後のキシレン洗浄液を捨て、ガラスバイアルにパラフィンを注ぎ入れます。バイアルを直ちに70 °Cに予熱したアルミブロックに入れ、30分間保持します。30分後、予熱したPEまたはピペットを用いて、パラフィンを新しい清潔なパラフィンに交換します。パラフィンを捨て、予熱したペストまたは開口部の広いピペットを使用して、オルガノイドを液状パラフィンの層があるパラフィンブロック型の中へピペットで移します。ブンゼンバーナーで解剖針を温め、すべてのオルガノイドができるだけパラフィンブロックモールドの中心に位置するように操作します。モールド内でのオルガノイドの配置が適切であれば、モールドを軽く冷却してパラフィン層を凝固させます。その上にさらにパラフィンを注いでブロックを完成させ、標準的な組織包埋カセットを取り付けます。本プロトコルでは、腸上皮オルガノイドにレンチウイルスを導入しました。通常のオルガノイドは、共通の絨毛ドメインから複数の隠窩が突出したK crypt絨毛構造として成長します。これらのオルガノイドをGSK-3β阻害剤であるCHIR 99021で処理すると、増殖が促進され、オルガノイドへの導入後に隠窩が嚢胞状になります。レンチウイルスによるEGFP過剰発現を用いることで、オルガノイドは蛍光EGFPを発現します。導入効率が低い場合に実施される、接種やウイルス培養時間の延長といった導入効率向上ステップは、すでに効率が高いため不要です。その後、これらのオルガノイドはRNA解析および免疫組織化学染色に供されます。この代表的な画像はマウス腸管オルガノイドの切片であり、固定前の1時間のBRDU処理後にBRDU染色を行ったものです。このビデオを視聴することで、レンチウイルスまたはレトロウイルス粒子を用いて、初代腸上皮からのオルガノイドに導入を行う方法について十分に理解できるはずです。

a-protocol-for-lentiviral-transduction-downstream-analysis-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

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このプロトコルは、単一細胞RNAシーケンシング(scRNAEq)技術を用いて、単細胞レベルで宿主/病原体相互作用を特徴付けるために、彼らの補助的またはバソラターレ側からヒト腸器官に感染する方法を説明する。...

バイオセーフティレベル3(BSL-3)条件下での病原体感染と単一細胞シーケンシングに対する消化管オルガノイドの適応

このプロトコルは、マウス小腸オルガノイドの樹立、マウス小腸固有層からの1型先天性リンパ系細胞の単離、および腸上皮細胞と1型先天性リンパ系細胞との間の双方向相互作用を研究するための両方の細胞型間の3次元(3D)共培養を確立するための詳細な指示を提供する。...

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遺伝子コードされたカルシウムインジケーターを用いたウイルス感染ヒト腸オルガノイド単分子膜のライブカルシウムイメージング

このプロトコルは、ヒト腸オルガノイド技術とシングルセルトランスクリプトーム解析を組み合わせて、これまで未踏の腸内生物学に関する重要な洞察を提供します。...

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この記事では、新規プロトコルと試薬の高いコンテンツの分析を用いてニューロンとアストロサイトの共培養での化合物および治療の神経毒性効果の感度測定のために設計されたセットを説明します。結果は、高含有量の分析は、神経毒性評価のためのエキサイティングな新技術を表すことを示している。...

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

学ぶレンチウイルス形質導入法を用いたマウス腸オルガノイドの遺伝子導入と下流解析。定量RT-PCR、RNAマイクロアレイ、免疫組織化学による検証が可能な信頼性の高いモデルを構築します。

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

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