レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

この手順の全体的な目標は、腸オルガノイドの下流分析のために、マウスの初代腸上皮から安定的に形質導入されたオルガノイドを生成することです。これは、最初にHEC 2 93 T細胞をレンチウイルスパッケージングベクターおよびレンチウイルスプラスミドでトランスセクトすることにより達成され、目的遺伝子をコードして高力価レンチウイルス粒子を産生します。第2のステップは、培養マウス腸オルガノイドをいくつかの成長因子で前処理し、嚢胞性高増殖性陰窩を得ることです。

次に、オルガノイドに高力価レンチウイルスを形質導入し、形質導入したオルガノイドをマトリゲル中でインキュベートします。最後のステップは、下流の免疫組織化学分析のために、全成長形質導入オルガノイドをパラフィンに埋め込むことです。最終的に、レンチウイルスオルガノイド形質導入は、信頼性、再現性、高速性を備えた腸上皮のin vitroモデルに遺伝的変化を生成するために使用されます。

この手法ががん細胞株などの既存の方法よりも優れている主な点は、オルガノイドが変異していない置換幹細胞階層であることです。テキスト細胞分極では、小腸上皮のすべての異なる細胞タイプに分化することができます。さらに、形質導入オルガノイドは、特定の遺伝要素の研究に用いることができるため、トランスジェニックマウスの使用やコストとスピードの面で優れています。

レンチウイルス粒子の産生は、細胞培養培地中の162平方センチメートルフラスコでHEC 2 93 T細胞を60〜80%coの流暢さに分割することから始まる5日間のプロトコルです。翌日、加湿細胞培養インキュベーターで細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。DNAトランスフェクション溶液とポリエチレンアミンまたはPEIトランスフェクション溶液を、プロトコールテキストに記載されているように調製します。

DNAトランスフェクション溶液をPEI溶液にボルテックスまたはインバートを数回加え、5分間インキュベートします。室温で。DNA TRANSFECTIONとPEI溶液を2ミリリットルのHEC 2 93 T細胞に滴下し、4時間後に摂氏37度で4時間インキュベー

培地をリフレッシュします。PEIを除去するには、4日目に細胞を摂氏37度で2日間インキュベートし、上清を50ミリリットルのチューブに集めます。新しい培地を細胞に加え、フラスコをインキュベーターに戻し、収集した上清を500Gで5分間遠心分離します。

死細胞を除去するには、60ミリリットルの大型シリンジを使用して、SUPERNATを0.45マイクロメートルのフィルターに押し込みます。ろ過したスーパーナットは、翌日に摂氏4度で一晩保存します。遠心分離機を回収し、最初のバッチに示されているように、上清の2番目のバッチをろ過します。

上清の2つのバッチを超遠心チューブにプールします。50, 000 GS で 90 分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、非常に慎重に、超遠心チューブの入ったカプセルを取り出し、層流フードに入れます。

ウルトラ遠心チューブを保持しているカプセルを開き、チューブの上側にあるペレットで培地を慎重にデカントします。ウイルスペレットは視覚化が難しい可能性があるため、チューブのどちら側が形成されたかを覚えておくことが重要です。次に、マイクロピペットを使用して、超遠心チューブの底の側面に見える不透明な茶色のペレットを攪拌しないように注意しながら、最後の媒体を取り出します。

このペレットを、ニコチンアミドキナーゼ阻害剤とポリブレインリザスターを添加したオルガノイド培養培地500マイクロリットルに再懸濁します。形質導入の2日前にオルガノイドの形質導入に高力価ウイルスを直接使用するため、この培地での懸濁液は重要です。0.95平方センチメートルのオルガノイドのウェル全体を、48ウェルプレートの新しいウェルに分割します。

以前に公開されたプロトコルに従います。オルガノイド培養で約50種類の小さなオルガノイドを得ることを目標とします。グリコーゲン合成酵素キナーゼ阻害剤とニコチンアミドを添加した培地。

嚢胞性超増殖性陰窩を取得するため。オルガノイドを形質導入採取日に2日間インキュベートし、オルガノイドをP 1000マイクロピペットでインキュベートします。マトラゲルと培地を上下にピペットで動かし、混合物を乱します。

混合物を15ミリリットルのチューブに入れます。遠位開口部が減少したPEを使用して、100Gで5分間遠心分離することによりオルガノイドを溶かし、混合物をさらに破壊します。次に、500マイクロリットルの温めた1×トリプシンで上清を取り除き、オルガノイドを再懸濁して3分間インキュベートします。

摂氏37度の水浴中で、3.5ミリリットルの細胞株培養培地遠心分離機を5分間加えて、トリプシンを不活性化します。500Gでスーパーナタンを取り除き、ペレットを約20マイクロリットルの培地に残します。この最後の少量の培地中のオルガノイドをウェルに移します。

48ウェルプレート上。前もって調製した形質導入培地中の高力価レンチウイルスをオルガノイドに加え、再懸濁します。オルガノイドウイルス混合物を培養インキュベーターで摂氏37度で1時間インキュベートして1時間後に形質導入できるようにし、オルガノイドウイルス混合物に培地であるオルガノイド培養物1ミリリットルを加えて再懸濁し、混合物を850GSのマイクロ遠心チューブ遠心分離機に5分間移します。

オルガノイドをペレット化するには、上清を取り除き、ペレットを再懸濁します。20マイクロリットルの氷冷マトラゲルに、液滴を井戸の真ん中に置きます。48ウェルプレートで、摂氏37度で15分間インキュベートします。

液滴が15分後に固まるため。250マイクロリットルのオルガノイド培養物を慎重に加えます。ニコチンアミドおよびキナーゼ阻害剤を補充した培地。

インキュベーター内のアルミニウムブロックを摂氏70度で予温し、パラフィンを液体に保ちます。完全に成長したオルガノイドを入れた1つのウェルから培地を取り出し、埋め込まれたオルガノイドをそのまま残し、PBS中の4%パラホルムアルデヒド1ミリリットルを直接ウェルに加えます。パラホルムアルデヒドを1ミリリットルのPBSに置き換えます。

固定したオルガノイドをPBSに再懸濁し、ガラスバイアルに移します。オルガノイドを1分間底に沈めます。次に、PBSをピペットで取り出し、エオイン溶液のいくつかの液滴を溶解した70%エタノールと交換します。

包埋プロセス全体でオルガノイドを可視化するには、オルガノイドを70%エタノールに室温で30分間放置します。70%エタノールを慎重にピペッティングして取り出します。オルガノイドは、ピンクがかったエオイン色であるため、目で視覚化できます。

包埋溶液を96%エタノールに交換し、この方法で室温で30分間放置します。続いて、オルガノイドを70%エタノール、90%エタノール、96%エタノール、100%エタノール、100%エタノール、キシレンおよびキシレンに通します。最後のキシレンウォッシュをデカントし、パラフィンをガラスバイアルに注ぎます。

バイアルをすぐに摂氏70度の予温アルミニウムブロックに30分間入れます。30分後、パラフィンを新しい清潔なパラフィンと交換し、プレウォーム、PE、またはピペットで交換します。パラフィンを注ぎ、予温した害虫または大きな開口部のあるピペットを使用して、オルガノイドをパラフィンブロック型にピペットで流動パラフィンの層にします。

解剖針をブンゼンバーナーで温め、パラフィンブロック型の中心に向かって、すべてのオルガノイドをできるだけ操作します。型内のオルガノイドの局在が良好であれば、型を少し冷やしてパラフィン層を固化させます。上にパラフィンをさらに注ぎ、標準の組織学的埋め込みカセットを追加してブロックを仕上げます。

このプロトコルでは、腸上皮のオルガノイドにレンチウイルスを形質導入しました。通常のオルガノイドは、共有の絨毛ドメインから出てくる多数の陰窩を持つK陰窩絨毛構造として成長します。これらのオルガノイドをGSK three B阻害剤であるCHIR 9 9 0 21で処理すると、オルガノイド形質導入後に増殖が増加し、陰窩が嚢胞性になります。

レンチウイルスEGFPの過剰発現を使用すると、オルガノイドは、接種や長期のウイルスインキュベーションなど、形質導入効果が低い場合に実行できる蛍光EGFP形質導入増強ステップを発現します。これらのステップは、すでに高い有効性を高めません。その後、これらのオルガノイドは、RNA技術および免疫組織化学のために処理されます。この代表的な画像は、マウスの腸管オルガノイドの一部片で、固定前にBRDUとインキュベートした後、BRDUに染色したものです。

このビデオを見れば、レンチウイルスまたはレトロウイルス粒子を使用して初代腸上皮からオルガノイドを形質導入する方法を十分に理解できるはずです。