Name: 生後心筋細胞における細胞周期変化の可視化と核の決意 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学ぶ 生後心筋細胞の細胞周期変化と核の決定法。トランスジェニックマウスを用いて蛍光顕微鏡で高解像度に可視化し、心筋細胞が分裂するか倍性変化するかを区別します。心臓再生研究に有用です。

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技術支援について、S. Grünberg氏(ドイツ、ボン)とP. Freitag氏(ドイツ、ボン)に感謝します。

<ol><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Raulf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+unequivocal+identification+of+cardiac+myocyte+nuclei+and+analysis+of+cardiomyocyte+cell+cycle+status%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status.</a> Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).</li>
<li>Field, C. M., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin%2C+a+contractile+ring+protein+that+cycles+from+the+nucleus+to+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex.</a> J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).</li>
<li>Hesse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+cell+division+using+high-resolution+imaging+of+M-phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Commun%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle.</a> Nat.Commun. 3, 1076(2012).</li>
<li>Eulalio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+miRNAs+inducing+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration.</a> Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).</li>
<li>Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+induces+cardiomyocyte+re-entry+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle.</a> J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

心筋細胞は、細胞周期を再入力し、損傷後や組織の恒常性の間に分割することができるかどうかをめぐる論争があります。心筋細胞の基本的な売上高の値は1％1と80％7の範囲で与えられています。 40％7 - 、心臓病変後、細胞周期活性の誘導および新しい心筋細胞の生成は、0.0083％〜8と25の間の値と、境界域で報告されています。これらの不一致は、部分的に心臓の核を同定するための異なる実験的アプローチ、9組織切片の細胞分裂の間に非常に困難なプロセスによって説明することができます。心筋細胞は、細胞周期の変動を受けやすいように、倍数体および多核細胞をもたらす核内倍加およびacytokinetic有糸分裂、より本格的な細胞分裂を区別するために決定的に重要です。ために細胞分裂の同定は、そのような収縮リングとmidbodiesなどの細胞分裂の特徴を視覚化するだけでなく、二核心筋細胞のパーセンテージを決定する必要があります...

心筋細胞の核および細胞周期の状態の正確な同定は、心筋の代謝回転および再生の決意するための極めて重要です。これは、細胞周期活性を同定するための、そのようなpHH3、のKi-67、またはチミジン類似体のような核マーカーの使用のために特に当てはまります。哺乳類成体心筋細胞の増殖能が1非常に小さいので、心筋細胞核の増殖マーカーについて陽性の核の偽の身分証明書は、増殖アッセイの結果で決定的な違いを作ることができます。また、心筋細胞は倍数体および多核細胞ではなく、細胞分裂につながるような核内倍加およびacytokinetic有糸分裂などの細胞周期の変化、になりやすいです。この目的のために、一般的な細胞周期マーカーに対する抗体染色の解釈は、全ての場合において決定的ではありません。 ここで、我々は、直forwaのための方法を提示します<html> RDマウス心筋細胞の認識とそれらの核の明確な同定により生後および成体の段階でネイティブ単離された細胞と厚い組織切片でのnuclearity。そのために、MYH6プロモーターの制御下にヒトヒストンH2BおよびmCherryをからなる融合タンパク質（MYH6-H2B-MCH）の心筋細胞特異的発現を有するトランスジェニックマウス系統は、2を使用しました。 、のeGFP-anillin融合タンパク質の発現は、CMVエンハンサー（CAG-EGFP-anillin）を有するユビキタスニワトリアクチンプロモーターの制御下にあるトランスジェニック増殖インジケータマウス株、このマウス系統を交配することが可能細胞周期状態の決意。足場タンパク質のanillinは、具体的には、アクティブセル3細胞周期で発現され、細胞周期の間に、その差動細胞内局在は、M相の高解像度でライブトラッキング細胞周期の進行を可能にEF &quot;&gt; 4になるので、二重トランスジェニックマウスは、増殖性心筋細胞および細胞周期変動を受けるものとを区別するために使用することができる。これは、in vitroでの増殖を誘導する物質のスクリーニングに特に有用であることを証明。

<table><tbody><tr><td>10cmシャーレ</td><td>Sarstedt</td><td>821472</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;m セルストレーナー</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>2,3-ブタンジオン一基 (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &frac12; 注射カニューレ、ステリカン</td><td>ブラウン、メルズンゲン 4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ゲージ針</td><td>ベクトン ディキンソン GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェル プレート</td><td>ベクトン ディキンソン GmbH/ファルコン</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-メチルブタン</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>37%ホルムアルデヒド溶液</td><td>AppliChem GmbH&nbsp;</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>三方活栓</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>16494C</td><td></td></tr><tr><td>50 mLシリンジ</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-205</td><td></td></tr><tr><td>α-Aktinin EA-53, Mouse IgG</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Microplate, 96 Well,Half Area</td><td>Greiner bio-one</td><td>675986</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡 Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cryostat CM 3050S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>donkey serum</td><td>Jackson Immuno Research, Suffolk, GB</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>PromoCell、ハイデルベルク</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液 (4%)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>豚皮からのゼラチン、タイプ A</td><td>Sigma-Aldrich、Steinheim</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>ガラス カバースリップ</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>ハイデルベルガー延長管</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HistoBond 顕微鏡スライド</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (1&nbsp;mg/mL)</td> <td>Sigma Aldrich, Taufkirchen</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>Iscove'ModifiedDulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti</td><td>Nikoninstruments, D&uuml;sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG Cy5 (donkey)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>Mini shaker</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3p</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4464066</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Mold</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-slide 8-well ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>ネガティブcontrol(scrambled RNA)</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Neonatal Heart Dissociation Kit</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit</td><td>Nikoninstruments, D&uuml;sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids, NEAA</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstad</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルアルコール封入剤 DABCO&reg;, antifading</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>サンプルコンテナ</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>セロジカルピペット</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ToPro3 ヨウ化物 (642/661)</td><td>分子プローブ/ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>小麦胚芽凝集素(WGA) フルオレセイン標識</td><td>Vector Laboratories</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>&α;-アクチニン抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

生後心筋細胞における細胞周期変化の可視化と核の決意

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

心筋細胞は、エンドリデューション(核分裂や細胞質分裂を伴わないDNA合成の継続)や無細胞動態性有糸分裂(核分裂はあるが細胞質分裂はしない)など、細胞周期の変動を起こしやすいです。このような非定型的な細胞周期の変動は、細胞分裂ではなく、倍数体細胞や多核細胞をもたらします。したがって、心臓の代謝回転と再生を決定するためには、心筋細胞の核、細胞あたりの核の数、およびそれらの細胞周期の状態を正しく特定することが非常に重要です。これは、チミジン類似体Ki-67、PCNA、pHH3などの細胞周期活性を同定するための核マーカーの使用に特に当てはまります。ここでは、心筋細胞とその核性を認識し、その細胞周期活性を決定する方法を紹介します。私たちは、心筋細胞の核を明確に同定するためのMyh6-H2B-mChトランスジェニックマウス系統と、細胞分裂と細胞周期の変動を区別するためのCAG-eGFP-アニリンマウス系統の2つの公開トランスジェニックシステムを使用しています。これら2つのシステムを組み合わせることで、心臓の再生と可塑性の研究が容易になります。

in vitroでの出生後の心筋細胞の細胞周期活性に対するsiRNAを/ miRNAの効果を分析するために、二重トランスジェニックMYH6-H2B-MCH / CAG-EGFP-anillinマウスの心筋細胞は、生後3日目（P3）で単離し、でトランスフェクトしました細胞周期活性誘導miR199 5は、siRNA P27、およびsiRNA Fzr1。陰性対照（ 図1A）と比較して、miR199-（ 図1B）およびsiRNA p27-（ 図1C）の写真は、心筋細胞が細胞周期活性の誘導を示すトランスフェクトしました。 Fzr1の阻害がトランスフェクトされた細胞の核内でのeGFP-anillin融合タンパク質の蓄積をもたらし、Fzr1の損失がAPCの阻害をもたらすようにeGFP-anillinマウスモデルにおいて、Fzr1に対するsiRNAは、トランスフェクションコントロールとして使用することができます...

心筋細胞の細胞分裂と細胞周期の変動を区別するために、私たちは2つのトランスジェニックマウス系統を使用したプロトコルを提示します:Myh6-H2B-mChトランスジェニックマウスは、心筋細胞の核を明確に識別し、CAG-eGFP-アニリンマウスは細胞分裂と細胞周期の変動を区別するためのものです。

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

この手順の全体的な目標は、出生後の心筋細胞の細胞周期活動を視覚化し、その核性を決定することです。この方法は、心筋細胞が本当に分裂するのか、それとも倍数性が増加するだけなのか、それとも多核になるのかなど、心臓再生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、細胞周期のM期を高い時空間分解能で可視化できることと、心筋細胞の核を蛍光で同定できることです。手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であるPatricia Freitagです。非ホモ接合性育種ペアを使用する場合は、まず蛍光顕微鏡でトランスジェニック心臓を同定し、EGFPアナリンとH2B-mCherryの発現を確認します。EGFPアナリン核シグナルは、心房の組織層を通じて焦点を合わせることにより、心房の端で最も簡単に検出できます。心筋細胞を単離するには、新生児心臓解離キットからの酵素混合物1ミリリットルが入った1.5ミリリットルの反応チューブに適切な数の心臓を入れ、ハサミで心臓を細かく切ります。次に、溶液を15ミリリットルの反応チューブに移します。チューブを摂氏37度のほぼ水平位置に15分間置き、インキュベーションの最後に5ミリリットルのピペットで組織を5〜10回混合します。3回目の消化の終わりに、7.5ミリリットルの培地2で反応を停止し、70ミクロンの細胞ストレーナーで細胞懸濁液をろ過します。細胞ストレーナーを3ミリリットルの培地2ですすぎ、集めた細胞と洗浄液をプールし、遠心分離によって細胞を集めます。ペレットを500マイクロリットルのミディアムワンに再懸濁してカウントします。次いで、96ウェル平底プレート中の120マイクロリットルの培地1にウェルあたり10〜4個の細胞を1回播種し、細胞培養インキュベーターで一晩培養する前に細胞を遠心分離する。翌日、ほとんどの心筋細胞が鼓動しているはずです。トランスフェクションを開始する前に、ベンチとすべてのトランスフェクション材料をRNAse除染液で拭き取り、RNAseを除去します。すべての材料の準備ができたら、調製したばかりのsiRNAミックスを20マイクロリットルを各ウェルに加え、細胞をインキュベーターに48時間戻します。2日後、各ウェルの上清を120マイクロリットルの培地と交換し、細胞を少なくともさらに24時間インキュベーターに戻します。インキュベーションの終了時に、細胞をPBSで1回洗浄し、続いて4%ホルムアルデヒド溶液に20分間固定します。共焦点ビデオ顕微鏡で細胞を解析するには、プレートを共焦点顕微鏡ステージに移し、イメージングソフトウェアを起動します。A1plus設定を開き、チャンネル1、2、3、4のボックスをオンにします。プルダウン メニューで、チャネル 1 を DAPI、チャネル 2 を eGFP、チャネル 3 を RFP、チャネル 4 を Cy5 に設定します。チャンネル電圧をクリックし、スライドバーを使用して各チャンネルの電圧を80に設定します。スライドバーを使用してオフセットをゼロに設定し、ホームボタンをクリックしてピンホールをホーム位置に設定します。プルダウンメニューでスキャンサイズを1024×1024ピクセルに設定します。[最適化]をクリックしてXYZサイズ設定ウィンドウを開き、推奨されるステップZの下の完璧なボクセルボックスをオンにします。20倍の対物レンズを選択し、画像が露出不足でも露出過多でなくなるまでレーザー強度を調整します。すべてのパラメータを設定したら、取得メニューを開きます。[大きな画像をスキャンする]を選択し、現在の位置が[領域]の下の左上隅にあることを選択します。次に、X と Y のフィールド数を 3 x 3 に設定し、[スキャン] をクリックします。心筋細胞の核の数を定義するには、測定、手動測定、およびカウントをクリックします。H2B-mCherryシグナルを持つ核を選択し、それによってそれらをマーキングしてカウントします。次に、α-アクチニン陽性細胞を選択して、心筋細胞の数を決定します。核EGFPアナリンシグナルを持つG1、S、G2期の心筋細胞をカウントするには、測定、手動測定、およびカウントを選択します。EGFPアナリンとH2B-mCherry発現核をカチッとマーキングし、収縮輪や中体などの有糸分裂特異的EGFPアナリンシグナルを持つ心筋細胞を手動でカウントします。次に、測定、手動測定、および有糸分裂特異的EGFPアナリンシグナル、細胞プラスティックシグナル、収縮リング、および中体を持つ心筋細胞をクリックしてカウントします。ネガティブコントロールと比較して、miRNAおよびsiRNAトランスフェクト心筋細胞は、細胞周期活性の誘導を示しています。内重複を行う心筋細胞は、もっぱら核内EGFPアナリン発現を示しますが、細胞分裂中の心筋細胞は、M期の典型的な局在化でEGFPアナリン発現を示します。ランゲンドルフ装置で心臓組織を酵素的に消化した後、心房と心室を機械的に分離して独立して分析することができるため、H2B-mCherry陽性の二核心筋細胞を多く含むH2B-mCherryトランスジェニック心室心筋細胞を可視化することができます。対照的に、心房心筋細胞の大部分は単核です。酵素消化では、100%単一細胞集団がα-アクチニン染色による交差線条のパターンを明らかにすることはなく、交差線条と細胞ダブレットの連続パターンとしての二核心筋細胞との識別がさらに容易になります。厚いスライスの心筋細胞の二核形成指数を分析するには、核が必ずしも1つのZ平面内にあるとは限らないため、スタックを手動でスクロールする必要があります。小麦胚芽凝集素染色により細胞の検出が可能になり、成体トランスジェニックマウス心臓の固定スライスの再構築borders. 3Dフックの検出と自動カウントが可能になります。 染色したH2B-mCherry陽性核を用いて、組織内の生理学的条件下での心筋細胞核の割合を決定します。一度習得すると、心臓の解離は適切に行われれば2〜3時間で完了することができます。この手順を試みる際には、実験全体を通じて細胞の生存率を維持するために継続的に作業することを覚えておくことが重要です。この手順に従うと、マイクロRNAやその他の低分子物質の出生後の心筋細胞における増殖誘導効果をスクリーニングすることができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

心臓核密度沈降を介して分離し、フローサイトメトリーにより心筋細胞核を識別し、ソートするための中心体周辺物質1（PCM-1）に対する抗体で免疫標識されています。...

事後組織から心筋細胞核の分離

多能性幹細胞は、胚又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）のいずれかで、心筋細胞を含むヒト分化細胞の貴重な情報源を構成する。ここでは、胚様体ベースのプロトコルを介して機能的なヒト心筋細胞を得るためにそれらを使用する方法を示す、iPS細胞の心筋誘導に焦点を当てます。...

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

物品を効率よく選択的に集団の均質性および同一性を評価するための基準マーカーのフローサイトメトリー分析を行っWnt経路を変調することにより、心筋細胞へのヒト多能性幹細胞を分化するための詳細な方法論を記載している。...

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

&gt;jove_content&lt;先天性心疾患を引き起こす突然変異は、発生中の心臓構造のin...

胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

心筋細胞の代謝回転の定量化は困難です。ここで説明するプロトコルは、新心筋細胞の核生成と核倍数性の正確で高感度な定量を可能にすることにより、この課題に重要な貢献をします。...

心筋細胞のDNA合成と倍数性の同時評価：心筋細胞再生の定量化を支援する方法および売上高

私たちは、無傷の胚および出生後の心臓の奥深くにある蛍光タンパク質標識細胞を体積的に画像化するプロトコルを記述します。組織透明化法とホールマウント染色を併用することで、胚性または出生後の心臓内の単一蛍光タンパク質標識細胞を鮮明かつ正確にイメージングすることができます。...

イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

ヒト多能性のサスペンション集計ベースの心臓分化を開始する従来の方法は、細胞（hPSCs）は凝集体の大きさや形状に関して培養異質で悩まされている茎。ここでは、サイズ制御HPSCは心臓の促進条件下で培養された凝集体を生成するためにマイクロウェルを用いた心臓分化のための堅牢な方法を説明します。...

ヒト多能性幹細胞の懸濁液ベースの心臓分化のためのマイクロウェル中の凝集体サイズの最適化

この原稿は、レトロウイルスが媒介するGata4、Hand2、Mef2c、およびTbx5の送達を使用して、多様な再プログラムされた心臓サブタイプの生成と定量化のための段階的なプロトコルを説明しています。...

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

本研究の目的は、心筋細胞を成体から再現的に単離し、DNAの含有量と核形成を測定する方法を開発することです。...

免疫細胞化学とプロイド分析のための固定心からの心筋細胞の分離

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、前臨床心毒性スクリーニングに動物を使用する代替手段を提供します。前臨床毒性スクリーニングにおけるhiPSC-CMの広範な採用に対する制限は、細胞の未熟な胎児様表現型です。ここでは、hiPSC-CMを堅牢かつ迅速に成熟させるためのプロトコルを紹介します。...

成熟ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞単分子膜を用いたハイスループット心毒性スクリーニング

学ぶ 生後心筋細胞の細胞周期変化と核の決定法。トランスジェニックマウスを用いて蛍光顕微鏡で高解像度に可視化し、心筋細胞が分裂するか倍性変化するかを区別します。心臓再生研究に有用です。

生後心筋細胞における細胞周期変化の可視化と核の決意

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