生後心筋細胞における細胞周期変化の可視化と核の決意

この手順の全体的な目標は、出生後の心筋細胞の細胞周期活動を視覚化し、その核性を決定することです。この方法は、心筋細胞が本当に分裂するのか、それとも倍数性が増加するだけなのか、それとも多核になるのかなど、心臓再生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、細胞周期のM期を高い時空間分解能で可視化できることと、心筋細胞の核を蛍光で同定できることです。

手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であるPatricia Freitagです。非ホモ接合性育種ペアを使用する場合は、まず蛍光顕微鏡でトランスジェニック心臓を同定し、EGFPアナリンとH2B-mCherryの発現を確認します。EGFPアナリン核シグナルは、心房の組織層を通じて焦点を合わせることにより、心房の端で最も簡単に検出できます。

心筋細胞を単離するには、新生児心臓解離キットからの酵素混合物1ミリリットルが入った1.5ミリリットルの反応チューブに適切な数の心臓を入れ、ハサミで心臓を細かく切ります。次に、溶液を15ミリリットルの反応チューブに移します。チューブを摂氏37度のほぼ水平位置に15分間置き、インキュベーションの最後に5ミリリットルのピペットで組織を5〜10回混合します。

3回目の消化の終わりに、7.5ミリリットルの培地2で反応を停止し、70ミクロンの細胞ストレーナーで細胞懸濁液をろ過します。細胞ストレーナーを3ミリリットルの培地2ですすぎ、集めた細胞と洗浄液をプールし、遠心分離によって細胞を集めます。ペレットを500マイクロリットルのミディアムワンに再懸濁してカウントします。

次いで、96ウェル平底プレート中の120マイクロリットルの培地1にウェルあたり10〜4個の細胞を1回播種し、細胞培養インキュベーターで一晩培養する前に細胞を遠心分離する。翌日、ほとんどの心筋細胞が鼓動しているはずです。トランスフェクションを開始する前に、ベンチとすべてのトランスフェクション材料をRNAse除染液で拭き取り、RNAseを除去します。

すべての材料の準備ができたら、調製したばかりのsiRNAミックスを20マイクロリットルを各ウェルに加え、細胞をインキュベーターに48時間戻します。2日後、各ウェルの上清を120マイクロリットルの培地と交換し、細胞を少なくともさらに24時間インキュベーターに戻します。インキュベーションの終了時に、細胞をPBSで1回洗浄し、続いて4%ホルムアルデヒド溶液に20分間固定します。

共焦点ビデオ顕微鏡で細胞を解析するには、プレートを共焦点顕微鏡ステージに移し、イメージングソフトウェアを起動します。A1plus設定を開き、チャンネル1、2、3、4のボックスをオンにします。プルダウン メニューで、チャネル 1 を DAPI、チャネル 2 を eGFP、チャネル 3 を RFP、チャネル 4 を Cy5 に設定します。

チャンネル電圧をクリックし、スライドバーを使用して各チャンネルの電圧を80に設定します。スライドバーを使用してオフセットをゼロに設定し、ホームボタンをクリックしてピンホールをホーム位置に設定します。プルダウンメニューでスキャンサイズを1024×1024ピクセルに設定します。

[最適化]をクリックしてXYZサイズ設定ウィンドウを開き、推奨されるステップZの下の完璧なボクセルボックスをオンにします。20倍の対物レンズを選択し、画像が露出不足でも露出過多でなくなるまでレーザー強度を調整します。すべてのパラメータを設定したら、取得メニューを開きます。[大きな画像をスキャンする]を選択し、現在の位置が[領域]の下の左上隅にあることを選択します。

次に、X と Y のフィールド数を 3 x 3 に設定し、[スキャン] をクリックします。心筋細胞の核の数を定義するには、測定、手動測定、およびカウントをクリックします。H2B-mCherryシグナルを持つ核を選択し、それによってそれらをマーキングしてカウントします。

次に、α-アクチニン陽性細胞を選択して、心筋細胞の数を決定します。核EGFPアナリンシグナルを持つG1、S、G2期の心筋細胞をカウントするには、測定、手動測定、およびカウントを選択します。EGFPアナリンとH2B-mCherry発現核をカチッとマーキングし、収縮輪や中体などの有糸分裂特異的EGFPアナリンシグナルを持つ心筋細胞を手動でカウントします。

次に、測定、手動測定、および有糸分裂特異的EGFPアナリンシグナル、細胞プラスティックシグナル、収縮リング、および中体を持つ心筋細胞をクリックしてカウントします。ネガティブコントロールと比較して、miRNAおよびsiRNAトランスフェクト心筋細胞は、細胞周期活性の誘導を示しています。内重複を行う心筋細胞は、もっぱら核内EGFPアナリン発現を示しますが、細胞分裂中の心筋細胞は、M期の典型的な局在化でEGFPアナリン発現を示します。

ランゲンドルフ装置で心臓組織を酵素的に消化した後、心房と心室を機械的に分離して独立して分析することができるため、H2B-mCherry陽性の二核心筋細胞を多く含むH2B-mCherryトランスジェニック心室心筋細胞を可視化することができます。対照的に、心房心筋細胞の大部分は単核です。酵素消化では、100%単一細胞集団がα-アクチニン染色による交差線条のパターンを明らかにすることはなく、交差線条と細胞ダブレットの連続パターンとしての二核心筋細胞との識別がさらに容易になります。

厚いスライスの心筋細胞の二核形成指数を分析するには、核が必ずしも1つのZ平面内にあるとは限らないため、スタックを手動でスクロールする必要があります。小麦胚芽凝集素染色により細胞の検出が可能になり、成体トランスジェニックマウス心臓の固定スライスの再構築borders. 3Dフックの検出と自動カウントが可能になります。 染色したH2B-mCherry陽性核を用いて、組織内の生理学的条件下での心筋細胞核の割合を決定します。一度習得すると、心臓の解離は適切に行われれば2〜3時間で完了することができます。

この手順を試みる際には、実験全体を通じて細胞の生存率を維持するために継続的に作業することを覚えておくことが重要です。この手順に従うと、マイクロRNAやその他の低分子物質の出生後の心筋細胞における増殖誘導効果をスクリーニングすることができます。