生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

この手順の全体的な目標は、実験プラットフォームとして使用するために、ヒト食道上皮の3D組織工学モデルを作成することです。これは、まず、ヒト食道組織サンプルから正常なヒト食道線維芽細胞および上皮細胞を単離することによって達成されます。第2ステップでは、線維芽細胞を上皮無細胞、細孔徴候、食道足場に播種し、7日間培養します。

次に、足場を反転させ、単離されたヒト食道上皮細胞を培養物に4日間加えます。最終ステップでは、モデルを空気液体界面に移し、さらに5日間の培養を行い、成熟した成層上皮を発達させます。最終的に、免疫組織化学は、モデル上皮細胞によって発現される増殖および分化の主要なマーカーを特徴付けるために使用されます。

従来の2D細胞培養と比較した場合のこの手法の主な利点は、細胞がin vivoで持つ細胞、細胞、および細胞マトリックスの相互作用を持つことができることです。そして、この技術を使用して、正常な食道と同様の成熟した層状扁平上皮を作り出すことができます。一般的に、この方法に不慣れな人は、3つの理由で苦労します。

1つは、上皮細胞の大部分が足場に含まれる前に分化しないようにすることが課題となる可能性があることです。2つ目は、上皮が成熟する期間中に正しい空気液体界面が提供されるように注意する必要があります。そして3つ目は、文化期間を通じて性を維持することが難しいことです。

ヒト食道上皮細胞を単離するには、採取した食道扁平上皮粘膜組織を滅菌ペトリ皿に入れ、エタノール滅菌メスを使用して組織を0.5センチメートルのストリップに切断します。次に、37°Cで覆った0.1%tryinで組織をインキュベートし、1時間後に5ミリリットルのFCSで消化を停止します。次に、ストリップを鉗子で保持し、メスの刃で上皮表面を1ストリップあたり1〜2分間穏やかに掻き取り、上皮細胞を周囲の培地に除去しますすべてのストリップを掻き取り終えたら、剥離した上皮細胞を含む培地を15ミリリットルの遠心チューブに移します。

細胞をスピンダウンした後、センナを廃棄し、ペレットを12ミリリットルの上皮培地に再懸濁します。次に、フェッター細胞培養から培地を廃棄し、滅菌ピペットを使用してフィーダー細胞上皮細胞を播種し、ヒト食道線維芽細胞を単離します。削り取ったティッシュストリップを滅菌ペトリ皿に移し、最後にメスで組織をミンチにします。

10ミリリットルの0.5%コラゲナーゼ(摂氏37度と5%の二酸化炭素で覆われた溶液)で一晩加湿雰囲気で分解します。翌日、消化物を50ミリリットルの遠心チューブに移し、細胞をスピンダウンします。Resusは、10ミリリットルの線維芽細胞培養培地で口蓋を中断します。

細胞培養インキュベーター内のT 75フラスコでの培養。脱細胞化したブタ食道足場を準備するには、ハサミとピンセットを使用してブタの食道を縦方向に切り開くことから始めます。次に、100ミリリットルの滅菌PBSが入った180ミリリットルの滅菌ポットで食道を10分間、穏やかに振って、組織をすすぎている間に日常の破片を取り除きます。

コルクが食道で乾燥しているときに、コルク解剖ボードに70%エタノールをスプレーします 粘膜側を上にしてボード。次に、滅菌ピンセットを使用して食道の一方の端にある粘膜表面をつかみ、組織をボードから引き離して、粘膜を下にある粘膜下組織から分離します。次に、滅菌メスの刃を使用して、食道を股門に沿って縦方向に解剖し、解剖が進むにつれてピンを取り除き、粘膜を持ち上げることができます。

下にある粘膜下組織を捨て、メスを使って残りの粘膜を5センチ四方に切ります。150ミリリットルの滅菌PBSで、先ほど示したように穏やかに攪拌しながらピースを洗います。5分後、組織を1モル塩化ナトリウム溶液の150ミリリットルを含む180ミリリットルのポットに移します。

37度で抗生物質を補給。72時間後、組織を150ミリリットルの滅菌PBSに移すと、その時点で上皮が下にある組織から目に見えて分離し始めます。滅菌鉗子とメスの刃を使用して剥離した上皮を取り外し、残りの組織を150ミリリットルの滅菌PBSの新鮮なポットに入れ、穏やかに攪拌しながら5分間の洗浄を3回行うと、組織は今、グリセロールに最低4ヶ月間保存する必要があります。

足場を完全に滅菌するには、少なくとも4か月間グリセロールで滅菌したブタ足場の一部を再水和することにより、食道粘膜モデルの準備を開始します。100ミリリットルの滅菌PBSで5回、10分間の攪拌を行います。洗濯のたびに、仰臥位を新しいPBSに交換します。

5回目の攪拌試験後、37°CのDMEMの100ミリリットルで一晩インキュベーションすることにより、足場の無菌性。翌朝、足場を6ウェルプレート粘膜下側を上にして個々のウェルに移します。次に、滅菌医療グレードのステンレス鋼リングを各足場の中央に置き、滅菌鉗子を使用してリングを優しく押し下げ、組織と5回で適切に密封されるようにします。

5つのヒト食道線維芽細胞を0.2ミリリットルの線維芽細胞培地の中央に、各リングの中心に配置します。次に、リングの外側の領域に少なくともさらに2ミリリットルの線維芽細胞培地を浸水させ、細胞培養インキュベーターで足場をインキュベートします。24時間後、リングを取り外し、各ウェルの培地を少なくとも5ミリリットルの新鮮な線維芽細胞と交換します。

ミディアム、足場が完全に浸かっているように注意してください。1週間後、培地を廃棄し、鉗子を使用して足場の粘膜表面を上向きに反転させます。リングを足場に戻し、0.2ミリリットルの複合培地に6つの上皮細胞の1つの時間中心を各リングの中心に1つずつ追加します。

リングの外側の領域を約2ミリリットルの複合培地1で塞ぎ、コンストラクトをインキュベーターに戻します。24時間後、リングを取り外し、各ウェルの培地を少なくとも5ミリリットルの新鮮な複合培地(1個)と交換し、足場が完全に沈んでいることを確認します。さらに24時間後、培地を少なくとも5ミリリットルの複合培地と交換します。2。

4日目に、滅菌医療グレードのステンレス鋼メッシュグリッドを新しい6ウェルプレートのウェルに配置し、コンストラクトをグリッド粘膜面を上にして移します。最後に、表面を空気にさらしたまま、複合材料の下側に到達するのに十分な複合媒体3を追加し、サンプルが空気液体界面に維持されるようにします。手順で最も難しい部分は、空気液体インターフェースの設定です。

グリッドが液体であるかどうかが明確でない場合は、パイプが水没しているかどうかを簡単に確認できるため、滅菌からパイプの先端に触れます。あるいは、プレートが動いているときに液体が見えやすいため、プレートを静かに揺らしてみて、グリッド上に液体があり、サンプルを覆っていないことを確認することもできます。これにより、上皮の論理的評価は、成熟した多層の層状扁平上皮を示し、正常なヒト食道で観察されるものと似ていますが、細胞は徐々に平らになり、最終的には表面に向かって移動するにつれて核になります。

増殖と分化の主要なマーカーの免疫組織化学的特性評価は、モデル上皮の微小解剖学的構造が正常なヒト食道上皮のそれと類似していることを示しています。例えば、同等のサイトケラチン14の発現は、天然の食道とモデル上皮の両方で観察され、染色は基底層の細胞に限定されています。このモデルは、一次上皮細胞を癌細胞に置き換えることにより、腫瘍細胞を組み込むようにうまく変更されており、モデルの柔軟性を示しています。

例えば、扁平上皮癌細胞は、上皮内に大きな裂け目を持つ明確な黄色の領域として構築物上に見える上皮を産生し、これはおそらく、モデル内の食道腺癌細胞を含む機能不全のセリア分子の存在を反映しており、その結果、足場の薄化として目に見える大量の足場の劣化がもたらされます。気液界面での成長の2週間後、hおよびe分析で、細胞の下の領域の足場の厚さの明らかな減少として確認されたこの手順に続いて、ノーザンブロッティングまたはウェスタンブロッティングのような他の遺伝子発現方法を同じ組織に適用して、次のような質問に答えることができます。 上皮は環境ストレスにどのように反応しますか?したがって、これは、開発後により多くの質問をより深く調べるための非常に貴重なリソースを提供します。

この技術は、バレット化生に関心のある研究者が、特定の逆流成分への曝露が正常なヒト食道の遺伝子発現に及ぼす影響を研究する道を開きました。