Name: 生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: 学ぶ、3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの作製法。線維芽細胞と上皮細胞を脱細胞化ポルキンスカフォールドに播種し、気液界面で成熟層状上皮を形成する手法です。再生医療や疾患モデリングの研究に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、食道組織サンプルと私たちの仕事の支援獲得に彼らの助けのために、ミスターロジャーAckroyd氏アンドリュー·ワイマン氏とクリス·ストッダード、シェフィールド教育病院NHS財団トラストでのコンサルタント外科医に感謝しています。私たちはモデルに腫瘍細胞株を組み込んだ、彼の助けをAshrafulハクに感謝します。私たちは感謝Bardhan研究教育トラスト（BRET）とヨークシャー癌研究（YCR）からの補助金によって、この研究のための財政支援を認めます。

ヒト食道細胞は胃や食道の手術を受けた患者から得られます。組織は、研究目的のために使用されるためにインフォームドコンセントを得て、組織が適切な倫理的承認（SSREC 165/03、ヒューマン研究の組織バンクライセンス12179）の下で匿名で使用します。 ヒト食道上皮細胞の単離1。 <ol><li>層流の組織培養フード内で作業し、無菌技術を使用して、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）および3のハムF12混合することにより、上皮培養培地を調製：1の比（V：V）を。 10％の追加（v / v）のFCS、10 ngの/ mlの上皮成長因子、0.4 / mlのヒドロコルチゾン、1.8×10 -4 Mのアデニン、5μg/ mlのインスリン、5μg/ mlのトランスフェリン、2×10 -7 Mトリヨードサイロニン、1×10 -10 Mのコレラ毒素、2×10 -3 Mのグルタミン、100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および0.625 / mlのアムホテリシンBを</li><li>標準の使用滅菌技術は、T75組織培養フラスコ中に100μg/ mlのストレプトマイシンDMEM 11mlの10％FCS、2×10 -3 MのL-グルタミン、100 IU / mlペニシリン、および0.625 / mlのアンホテリシンBを入れます。同じ培地1ml中に1×10 6致死的に照射したマウス3T3線維芽細胞に12を追加し、5％CO 2、加湿雰囲気中で37℃で一晩インキュベートします。これは、上皮細胞のその後の培養のためのフィーダー層を生成します。 </li><li>メスを使用し、組織病 ​​理学者の勧告に続いて、胃や食道の手術を受けた患者から得られた食道扁平上皮粘膜の無病背景領域からの組織の約2cm 2の試料を分析。室温で無菌輸送培地50mlの容器（PBS 100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび0.625 / mlのアンホテリシンB）研究室への輸送。 </li><li>この時点で、輸送に組織を保存します便宜上4℃で最大12時間（一晩）用培地;彼らは減少し、細胞の生存率をもたらすようにしかし、より長い保存期間を使用しないでください。 </li><li>層流の組織培養フード内で作業し、無菌技術を用いて、5分間、70％エタノールに浸漬することによって、メスの刃を滅菌します。滅菌PBSですすいでください。 </li><li>滅菌ペトリ皿に組織を配置し、0.5センチメートルのストリップにカットするためにメスを使用しています。 0.1％、5 mlを加え、ペトリ皿にPBS中のトリプシン（w / v）の皿に蓋を置き、37℃で1時間インキュベートします。 </li><li>トリプシンを阻害するためにペトリ皿に組織を5mlのFCSを加えます。滅菌ピンセットで組織のストリップを持って、静かに周囲の媒体への上皮細胞を除去するためのストリップ当たり1〜2分間のメスの刃で上皮表面をこすり。掻き取った組織を除去し、脇に置きます。すべての組織片のためのプロセスを繰り返します。 </li><li> 15mL遠心管に切り離さ上皮細胞を含む培地を収集遠心分離（5分間、200×gで）。上清を捨て、および上皮培地12mlの中にペレットを再懸濁（ステップ1.1に記載）。 </li><li>捨て、ステップ1.2で調製したT75フラスコ中のフィーダー細胞層から培地を捨てます。フラスコに新たに単離された上皮細胞を含む細胞懸濁液を追加し、5％CO 2、加湿雰囲気中で37℃でインキュベートし、滅菌ピペットを使用してください。 </li><li> 24時間後にオフ注ぎ、また、細胞の破片が含まれ、培地を、廃棄し、新鮮な上皮培地12mlのと交換してください。 5％CO 2、加湿雰囲気中、37℃でインキュベーションを続け。コロニーは、次の24〜48時間にわたって表示されるように開始され、標準的な光学顕微鏡下で培養フラスコを配置することによって表示することができます。費やされた培地を捨て、新鮮な培地を等量の2〜3日ごとに交換してください。 </li><li>フラスコを80％の密集度、継代細胞13に達すると。 Cを分割モデルで使用するために細胞数を増加させるために5：1の比率でells。細胞を継代する24時間前に上皮細胞を受信する各フラスコに照射3T3細胞のフィーダー層を確立するために、ステップ1.2に従ってください。 注：通路1とのみ4との間に、以下に記載の食道モデルで上皮細胞を使用してください。 </li></ol>ヒト食道線維芽細胞の単離2。 <ol><li>クリーンベンチでの作業と滅菌技術を使用して、ステップ1.7で確保された組織を取ります。滅菌ペトリ皿に置き、滅菌メスの刃で細断することによって細かく刻みます。 （w / v）の溶液をコラゲナーゼおよびペトリ皿に蓋を置き、5％CO 2、加湿雰囲気中、37℃で一晩インキュベートし、0.5％を10mlを加えます。 </li><li>慎重に、15mlの遠心管と遠心（10分、200 XG）にダイジェストを移しオフ注ぎ、上清を破棄し、線維芽細胞培養培地（DMEM、10％FCS 10mlにペレットを再懸濁、2×10 -3 MのL-グルタミン、100 IU / mlのペニシリン/ mlストレプトマイシン100μgを、0.625 / mlのアンホテリシンB）。 </li><li> T75フラスコに懸濁液を入れ、5％CO 2、加湿雰囲気中、37℃でインキュベートします。 24時間後の破片が含まれており、新鮮な線維芽細胞培地12mlのと交換します媒体を捨てます。細胞数を増加させるために5比：彼らは1のセルを分割、80％の密集度13に到達した後2〜3日ごとに継代細胞培養液を交換してください。 注：通路4のみ10との間に、以下に記載のモデルに線維芽細胞を使用してください。 </li></ol>脱細胞化食道足場の調製<ol><li>食糧生産のために使用される、新たに屠殺ランドレース豚から屠殺場で無傷のブタ食道を取得します。一つの食道は、約30別々の構築のために十分な足場を提供します。 注：これにより大規模で時間共に必要な滅菌プロトコルをnsumingは、一度、通常10食道の最小値を取得し、処理する価値があります。 </li><li>直ちに汚染微生物負荷を低減するために、5分間、10％ポビドンヨード溶液約150ミリリットルを含む180ミリリットルの滅菌ポットに、新たに切除した食道を配置します。 / mlストレプトマイシン200 IU / mlペニシリン、200μgの、および1.25 / mlのアンホテリシンBを含む滅菌PBSの約100ミリリットルを含む第二のポットに食道を転送<ol><li>容器に蓋を交換し、室温に戻って研究室に食道を輸送。二または三食道は、その大きさに応じて、それぞれの容器に搬送することができます。 </li></ol></li><li>実験室での後、微生物汚染を最小限にするために、無菌技術を用いて層流フード内で組織を処理します。 70％エタノール中に5分間浸漬し、滅菌PBSでリンスすることにより、ピンセット、はさみとメスの刃を滅菌します。 </li><li> ESを扱います滅菌ピンセットを使用してophagus。はさみを使用して、縦方向に食道を切り開い。滅菌PBS約100 mlを含む180ミリリットルの滅菌ポットに食道を配置し、任意の破片を除去するために穏やかに振とうすることによって組織をすすぎます。 </li><li> 70％エタノールで自由に噴霧することにより、コルク解剖ボードをきれいにし、乾燥させます。 </li><li> PBSから食道を外し、滅菌針を使用して、ボード上に食道をピン、粘膜表面最上。滅菌ピンセットで食道の一端に粘膜表面をつかみ、ボードから引き離します。これは、基礎となる粘膜下組織から粘膜を分離します。 <ol><li>その後、解剖は粘膜が離れて持ち上げることができるようにするために進むにつれて、ピンを除去し、粘膜固有層に沿って長手方向に食道を分析するために、無菌手術用メスの刃を使用しています。 </li></ol></li><li>解剖粘膜を保持し、下にある粘膜下層を捨てます。 </li><li>カットオフとtの最も近位および遠位の2センチメートルを破棄それぞれ、7それらの領域における粘膜下腺より多数の厚い粘膜固有層が存在するように、彼は粘膜。 </li><li> 5cm 2の中に残った組織を切断するためにメスを使用してください。滅菌PBSの約150 mlを含む180ミリリットルの滅菌ポットにすべて切断組織を置き、組織を洗浄するために穏やかに攪拌します。一度つ以上の食道を処理する場合は、このために、複数のポット三以降の手順を使用する必要があるかもしれません。 </li><li>滅菌ピンセットを用いて、滅菌1MのNaCl、37℃で72時間、200 IU / mlペニシリン、200 / mlのストレプトマイシンおよび1.25 / mlのアムホテリシンBをインキュベートの150ミリリットルを含む180ミリリットルポットに切断組織を移します。 </li><li> 150ミリリットル滅菌PBSを含む新鮮な180ミリリットルポットに組織を配置します。上皮は目に見えて、下にある組織から分離し始めているだろう。静かに滅菌ピンセットを用いて、豚の食道から切り離し上皮を剥離し、捨てます。 <ol><li>残りのTを配置新鮮な180ミリリットルの鍋に問題とは、滅菌PBSの150ミリリットルを追加します。洗浄するために5分間穏やかに攪拌します。 PBSを捨て、新鮮なPBSでさらに2回繰り返します。 </li></ol></li><li>室温で24時間滅菌し、80％（v / v）のグリセロール溶液400mlを含む500mlのガラス瓶に、すべての組織を置きます。さらに24時間の滅菌90％（v / v）のグリセロール溶液400mlに移します。 </li><li>脱水と基底膜の完全性を維持しながら、組織を滅菌する4ヶ月以上室温で無菌の100％グリセロール溶液400ml中に保管してください。 </li></ol>培養培地の4生産<ol><li>培養液中で使用するためにキレート化された新生仔ウシ血清を準備します。 <ol><li>ガラス1 Lボトルにキレックス100の100グラムを注ぎ、脱イオン水を加えます。正確な量は重要ではないが、十分な水がキレックス粉末をカバーするために追加する必要があります。磁気撹拌機を追加し、オートクレーブ処理（121℃で滅菌するための15分）。 </li><li>ボトルを冷却することを可能にし、キレックスを解決します。クリーンベンチでは、過剰の水を注ぐ新生仔ウシ血清（NCS）の500ミリリットルを追加し、4℃で一晩攪拌したままにします。 </li><li>攪拌を停止し、キレックスこれは30分までかかることが、解決することができます。 -20℃のクリーンベンチでキレックスを乱さないように注意しながら、滅菌ピペットを用いてキレート化された血清をデカントし、10ミリリットルの分量を保存します。 </li></ol></li><li>プロ増殖性およびプロ分化製剤で終わるで始まる、クリーンベンチ内に三つの異なるメディアを準備します。 <ol><li> （V：V）：1の比率、4×10 -3 M L-グルタミン、0.5 / mlのヒドロコルチゾン、1×10 -4 M Oの -phosphorylethanolamine、2×を私は3にDMEMとハムF12から構成される複合培地を調製10 -12 Mのトリヨードサイロニン、1.8×10 -4 Mのアデニン、1.88×10 -3 MのCaCl 2、4×10 -12 Mのプロゲステロン、10μg/ mlの中sulin、を10μg/ mlのトランスフェリン、10 ngの/ mlのセレン、1×10 -3 Mのエタノールアミンおよび0.1％（v / v）のキレートNCS。 </li><li> 0.1％（v / v）の非キレート化NCSとキレート化した血清を置き換える以外はコンポジットミディアム私として複合培地IIを準備します。 </li><li>オミットプロゲステロン以外複合培地IIとして、コンポジット中IIIを調製し、2％（v / v）の非キレート化NCSに血清を高めます。 </li></ol></li></ol>ヒト食道粘膜モデルの5生産<ol><li>無菌環境を維持するために、無菌技術を用いて、層流フード内のすべての作業を実行します。滅菌PBSですすぎの前に、5分間、70％エタノールに浸漬することによって、すべてのツールを殺菌。 </li><li>それが必要になる前の日は、無細胞ブタの食道足場を再水和。各構築物を作製するための足場の一枚が必要とされます。 <ol><li>滅菌PBS 100mlを含有するポットにブタ足場の組織場所に十分な作品を再水和するために、攪拌し、10分間浸します。デカPBSをNTと新鮮なPBSと交換します。すべてグリセロールトレースの除去を確実にするために洗浄工程を5回繰り返します。 </li></ol></li><li> 37℃で一晩DMEM 100ml中の再水和組織をインキュベートすることにより、足場の無菌性をテストします。足場は、無菌であることが想定されるインキュベーション期間の終わりに、培養培地の色または濁度の変化がない場合。無菌性が確認された後、最上位の、6ウェルプレートに粘膜下側を5cm 2の無細胞の足場を置きます。 </li><li>各足場の中央に滅菌医療グレードのステンレス鋼製のリング（内径10ミリメートル、外径20ミリメートル）を置き、静かに組織との適切なシールを確保するために、滅菌ピンセットを用いて、下に押します。 </li><li>細胞懸濁液を生成するためにトリプシン-EDTA 13を用いて線維芽細胞を収穫。血球計数器14を用いて細胞数を計測します。細胞懸濁液を遠心分離（10分間、200×gで）。 appropriaに細胞ペレットを再懸濁し1mlあたり2.5×10 6細胞の最終細胞数を産生する線維芽細胞の培地のTE体積。 </li><li>各環内に5×10 5のヒト食道線維芽細胞を含む、線維芽細胞培地の0.2ミリリットルを追加します。線維芽細胞培地の約2 mlのリングの外側の周りの領域をあふれさせます。 5％CO 2、加湿雰囲気中、37℃でインキュベートします。 </li><li> 24時間後輪および線維芽細胞培地を除去し、各ウェルに、新鮮な線維芽細胞の培地の少なくとも5 mLを加え、足場は完全培地中に浸漬されることを保証します。 5％CO 2、2〜3日毎に培地を交換し、加湿雰囲気中で37℃で1週間培養物。 </li><li> 1週間後、粘膜表面の最上層に配置し、媒体を除去し、滅菌ピンセットを用いて、各足場を反転、層状洪水フードに足場を含む6ウェルプレートを取り外します。この時点を0日と呼びます。 </li><li>中心部の粘膜表面に鋼リングを配置しますステップ5.4のように組織。 </li><li>トリプシン処理13のための上皮細胞のT75フラスコを準備します。 PBSで洗浄し、前のトリプシンEDTA溶液を添加した後、各フラスコに、滅菌0.02％2mlの（w / v）のEDTA溶液を加えます。 37℃で2分間インキュベートします。添付の上皮細胞を残したまま、選択i3T3フィーダー層を分離するために静かにフラスコをタップします。 注意：一般的に、すでに前の週のモデルに組み込まれた線維芽細胞に上皮細胞と一致している患者に実用的または必要はありません。 </li><li>フィーダー層を含むEDTA溶液を捨ておよび上皮細胞13を採取するために、トリプシン-EDTA溶液を加えます。血球計数器14を用いて細胞数を計測します。細胞懸濁液を遠心分離（10分間、200×gで）。 1mlあたり5×10 6細胞の最終細胞数を産生するために、複合培地1の適切な量に細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> ×1 1を含む、複合メディアIの0.2ミリリットルを追加します。リング内の0 6上皮細胞。複合メディアIの約2 mlのリングの外側の周りの領域を洪水、5％CO 2、加湿雰囲気中、37℃のインキュベーター内に構築物を配置します。 </li><li> 24時間（1日目）の後輪とメディアを除去し、新鮮な複合メディアIの少なくとも5ミリリットルを追加し、足場が完全に水没している確保し、インキュベーターに戻します。さらに24時間（2日目）後、培地を除去し、複合培地IIの少なくとも5mlで置き換え、再度足場を確保し、完全に水没し、インキュベーターに戻すされています。 </li><li>日に4場所滅菌医療グレードのステンレス鋼製メッシュグリッド新鮮な6ウェルプレートに（2センチ×0.5センチの高ワイド×2センチ）、構造物ごとに1。スチールグリッド、粘膜表面最上の一番上に構築物を転送するために滅菌ピンセットを使用してください。 <ol><li>液体は、合成の下側に到達するが、表面になるように十分な複合培地IIIを追加空気にさらされる、これは、サンプルが空気 - 液体界面で維持されることを保証します。必要なメディアの正確な量は、足場の厚さ、ウェルの容積とステンレス鋼グリッドの正確な高さに依存して変化します。 </li></ol></li><li>実験の要件に応じて、10〜20日（24日目に14日目）のための気液界面での複合体を維持します。新鮮な培地で複合培地IIIを交換するごとに2〜3日（月曜日、水曜日、金曜日は、ユーザーフレンドリーな政権です）。 注：気液界面（9日目）で5日後、構築物が食道上皮における環境要因の影響の実験に使用されるのに十分に成熟した食道上皮を持っています。 </li><li>実験の最後に、さらなるanalys用上皮から組織学的分析および免疫組織化学染色7、または抽出タンパク質15またはRNA 11,16のための構築物を修正です。必要に応じて、細胞外シグナル伝達分子17の分析のための馴化培地を保持します。 </li></ol>

<ol><li>Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).</li>
<li>Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+on+the+effect+of+bile%2C+and+bile+and+hydrochloric+acid+mixture+on+the+esophageal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Rom.+J.+Morphol.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa.</a> Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).</li>
<li>Andl, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation%2C+migration%2C+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li>
<li>Underwood, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+primary+oesophageal+squamous+epithelial+cells+with+HET-1A+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture.</a> Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).</li>
<li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
<li>Okawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+interplay+between+EGFR+overexpression%2C+hTERT+activation%2C+and+p53+mutation+in+esophageal+epithelial+cells+with+activation+of+stromal+fibroblasts+induces+tumor+development%2C+invasion%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation.</a> Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).</li>
<li>Green, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+characterization+of+an+organotypic+tissue-engineered+human+esophageal+mucosal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model.</a> Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+induces+immortalization+of+human+esophageal+keratinocytes+without+p16INK4a+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation.</a> Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).</li>
<li>Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+buccal+mucosa+for+substitution+urethroplasty%5BTitle%5D)+AND+%22BJU.+Int%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty.</a> BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).</li>
<li>Ralston, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+contract+human+dermal+extracellular+matrix+and+reduce+soluble+fibronectin+production+by+fibroblasts+in+a+skin+composite+model%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model.</a> Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).</li>
<li>Green, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatile+exposure+to+simulated+reflux+leads+to+changes+in+gene+expression+in+a+3D+model+of+oesophageal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa.</a> Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).</li>
<li>Wang, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+culture+of+epithelial+cells+from+primary+breast+carcinomas+using+irradiated+3T3+cells+as+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Res.+Pract%22%5BJournal%5D)">Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer.</a> Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsinizing+and+subculturing+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Trypsinizing and subculturing mammalian cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e755(2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2014).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Am.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).</li>
<li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometric+bead+array%3A+a+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+abnormal+expression+of+retinoic+acid+receptor-beta%2C+p+53+and+Ki67+protein+in+normal%2C+premalignant+and+malignant+esophageal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues.</a> World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).</li>
<li>Moll, R., Divo, M., Langbein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+keratins%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The human keratins: biology and pathology.</a> Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).</li>
<li>Rice, R. H., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+in+human+epidermal+cells+of+a+soluble+protein+precursor+of+the+cross-linked+envelope%3A+activation+of+the+cross-linking+by+calcium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions.</a> Cell. 18 (3), 681-694 (1979).</li>
<li>Eves, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+invasion+in+reconstructed+human+skin+is+influenced+by+skin+cells+-+investigation+of+the+role+of+proteolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

この原稿は、食道上皮の際に環境ストレスへの暴露の影響を研究するための実験プラットフォームとして使用するのに適した生物学的に関連するヒト食道粘膜モデルの産生および特徴を説明しています。 ヒト食道粘膜モデルの成功の生産のための最も重要なステップは、次のとおりです。上皮細胞の大部分は、増殖のままであり、すでに足場上に播種する前に区別するために開始していないことを保証します。上皮の正しい成熟を確保するために、複合のための気液界面を維持します。拡張された培養期間を通して無菌性を維持します。 これにより、細胞分離のための入手可能なヒト組織の限定された量に直接足場にし、その結果細胞増殖pHを新たに単離した細胞を播種するために単一の組織試料から十分な細胞を得るために、一般的には不可能です細胞を、標準的な二次元細胞培養条件下で増殖させる場合に、ASEが必要です。これは、細胞はこの期間中に増殖ままであることを確認することが重要です。これは、培養物を完全にコンフルエントに到達させることがないことを保証する唯一の通路4までモデルのセルを使用して慎重に...

食道粘膜は、結合組織の層の上に層状、扁平上皮、粘膜固有層を含み、摂取環境ストレスに遭遇した最初のサイトの一つです。 duodenogastro食道逆流は、食道腺癌への進行のリスクの増加と関連しているバレット化生、の病因における重要な要因である一方、食物毒素への暴露は、食道扁平上皮癌の発症に関与しています。食道がんは、英国の男性と食道腺癌で8 番目の最も一般的な悪性腫瘍が急速に西洋世界1に増加しています。また、約15％の全5年生存率と疾患の予後でほとんど改善、がありました。したがってdeveloでこの食道上皮の環境ストレスへの曝露の影響とその潜在的な関与を調査するための実験的なプラットフォームが必要とされています化生または新生物のpment。 不死化または腫瘍細胞株は、研究者は、インビトロでこれらのストレスには、上皮細胞の応答を研究することを可能にするが、それらは、増殖性のままであり、食道粘膜の最上層上に見出される成熟上皮細胞に分化することができません。また、既に腫瘍形成を起こした細胞株は、環境要因に上皮内の正常細胞の初期応答に関する限られた情報を提供することができます。これは、治療的介入の可能性が最も高いとすることができるステージがあります。最後に、従来の細胞培養系は、上皮および間葉細胞の間でおよびインビボでの組織内で発生し、これらの細胞と周囲のマトリックスとの間の潜在的に重要な相互作用を捕捉することができません。 動物モデルは食道epitheliの応答を研究するためのより現実的な微小環境を提供しますUMと胃食道逆流症2の人工的誘導を組み込むことができます。しかし、これらのモデルにおける環境ストレスを操作するより困難にすることができ、それらは完全にヒトの食道内に応答を表していない場合があります。 他の実験、ヒト食道モデルは、コラーゲンの一次細胞、不死化細胞または腫瘍細胞株を利用する開発、またはコラーゲン/マトリゲル、足場を含む線維芽細胞3,4を合わせてきました。なお、この原稿に記載の無細胞食道足場よりもこれらの足場を生成するために少ない労働集約的であり、これらの器官のモデルは、コラーゲンゲル内への腫瘍細胞の浸潤を容易にすることができ、特に腫瘍浸潤5,6の研究に有用なツールを提供します観察しました。しかしながら、これらのコラーゲンゲルは、非天然の機械的特性を有し、特定の基底膜とappropriat含む元の組織の特定の機能を欠いていますEの表面トポグラフィー。これは、コラーゲンゲル骨組7を用いて、上皮と足場との間に、例えば、劣った接着をもたらす細胞の挙動に影響を与えることができます。その結果、無細胞ブタ食道足場は、より生物学的に現実的な足場と実験プラットフォームとして使用するための、より適切であるという利点と、開発されました。それはまた、これらの細胞が、多層上皮が形成するので、そのようなHET-1Aと不死化食道上皮細胞株、より食道構築物中に一次細胞を組み込むが、階層化または4,7,8を区別しない方が良いことが示されています。 したがって、このプロトコルは、組織工学皮膚や口腔粘膜9,10を製造するためのマクニールの研究室ですでに使用中の方法から適応し、初代ヒト食道上皮細胞および線維芽細胞と組み合わせた脱細胞化ブタ食道足場を内蔵しています。ティSプロトコルはCK4、CK14、Ki67をとインボルクリン染色によって示されるように、正常なヒト食道と同様の成熟した、重層上皮を生成します。得られたモデルは、環境ストレスへの応答を研究するための実験的なプラットフォームを提供し、成分11を refluxateに応答して食道上皮における遺伝子発現の変化を調査するために効果的に使用されてきました。

<table><tbody><tr><td>トリプシン</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>215240PBS</td><td>で0.1%w / v溶液を調製し、滅菌をろ過します。37で暖かい&nbsp;&deg;使用前のCウォーターバス。</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Labtech</td><td>LM-D1112</td><td>ウォーム イン 37&nbsp;&deg;Cウォーターバス使用前</td></tr><tr><td>ハムのF12</td><td>Labtech</td><td>LM-H1236</td><td>ウォーム 37&nbsp;&deg;C水浴場使用前の</td></tr><tr><td>胎児の子牛血清</td><td>Labtech</td><td>FB-1090</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td>R + Dシステム</td><td>236-EG-200</td><td>200を準備します200 & マイクロ;10 mM酢酸、1%FCS中のg / mlストック溶液</td></tr><tr><td>ヒドルコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396</td><td>PBSでストック溶液を準備し、使用前に滅菌をろ過</td></tr><tr><td>アデニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2786</td><td>PBSでストック溶液を準備し、使用前に滅菌をろ過</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2767</td><td>0.01&nbspで10 mg / ml溶液を調製します。M HCl、蒸留水で1:10希釈し、使用前にフィルター滅菌</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2036</td><td>蒸留水で原液を調製し、使用前にフィルター滅菌</td></tr><tr><td>トリヨードチロニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2752</td><td>蒸留水で原液を調製し、使用前にろ過滅菌</td></tr><tr><td>コレラ毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>水中で原液を調製</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシンB</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td>ブランド名 Fungizone</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Oxoid</td><td>BR0014</td><td>1錠を100個に溶かします&nbsp;</td></tr><tr><td>コラゲナーゼA</td><td>ロシュ</td><td>10103578001</td><td></td></tr><tr><td>ポビドンヨード溶液</td>を滅菌するためのml水とオートクレーブ <td>Ecolab</td><td>10830E</td><td>ブランド名:ビデン</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>新生仔牛血清</td><td>Gibco</td><td>26010074</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>使用前にDMEMで原液を調製し、フィルター滅菌</td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td>使用前にDMEMで原液を調製し、フィルター滅菌</td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>使用前にDMEMで原液を調製し、フィルター滅菌 使用</td></tr><tr><td>O-ホスホリルエタノールアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0503</td><td>使用前にDMEMで原液を調製し、フィルター滅菌する</td></tr><tr><td>ITS(インスリン、トランスフェリン、セレン)</td><td>ロンザ</td><td>17-838Z</td><td>複合培地調製に使用</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T3924</td><td>37&nbsp;&deg;使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>EDTA 0.02%溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008</td>ウォーム<td>37&nbsp;&deg;使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>T75培養フラスコ</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td></td></tr><tr><td>50 ml遠心分離管</td><td>フィッシャー</td><td>11819650</td><td></td></tr><tr><td>15 mlユニバーサルチューブ</td><td>SLS</td><td>SLS7504</td><td></td></tr><tr><td>180 mlポット</td><td>VWR</td><td>216-2603</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>SLS</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス製リング</td><td></td><td></td><td>自社製 - 医療グレードのステンレス鋼、内径10mm、外径20mm</td></tr>の<tr><td>スチールメッシュグリッド</td><td></td><td></td><td>自社製造 - シートには直径0.3cmの穴があり、グリッド2&nbspを生成するために曲げられています。cm(幅)×2cm(奥行き)×0.5cm(高さ)</td></tr><tr><td>KI67</td><td>ノボカストラ</td><td>KI67-MM1-L-CE</td><td>クローンMM1。1:100で使用します。</td></tr><tr><td>CK4</td><td>アブカム</td><td>ab9004</td><td>クローン 6B10。1:200で使用します。</td></tr><tr><td>CK14</td><td>ノボカストラ</td><td>LL002-L-CE</td><td>クローンLL002。1:200で使用します。</td></tr><tr><td>インボルクリン</td><td>ノボカストラ</td><td>INV</td><td>クローンSY5。1:100で使用します。</td></tr><tr><td>OE21</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>96062201</td><td></td></tr><tr><td>OE33</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>96070808</td><td></td></tr><tr><td>Het-1A</td><td>ATCC-LGC</td><td>CRL-2692</td><td></td></tr><tr><td>マウス 3T3 線維芽細胞</td><td>ATCC-LGC</td><td>CRL-1658</td><td>照射(60Gy)により増殖が停止</td></tr></tbody></table>

生産、特性評価および3d組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

食道腺癌およびその前駆体、バレット化生の両方の発生率は、西部の世界で急速に上昇しています。さらに、食道腺癌は、一般的に、近年の生存率にはほとんど改善して、予後不良を持っています。これらは、勉強する困難な状況であり、食道粘膜の障害を調査するために、適切な実験プラットフォームの欠如がありました。 ヒト食道粘膜のモデルは、従来の2D細胞培養系とは異なり、 生体内に存在する細胞-細胞及び細胞-マトリックス相互作用を再現すると、正常なヒトの場合と同様、成熟、重層上皮を生成する、マクニールの研究室で開発されました食道。簡単に言うと、モデルは、ブタ由来の無細胞食道足場内で増殖させた形質転換されていない正常な初代ヒト食道線維芽細胞および上皮細胞を利用します。このモデルの免疫組織化学的特性評価CK4、CK14によって、Ki67のとインボルクリン染色は、正常なヒト食道粘膜の組織学の適切な要約を示しています。 このモデルは、ヒトの食道粘膜の強固な、生物学的に関連する実験モデルを提供します。これは、簡単に薬剤の有効性と、アルコール、毒素、高温または胃食道refluxate部品などの環境要因への曝露の影響を含む研究課題の数を調査するために操作することができます。モデルはまた、最大20日間の関心のある物質に成熟した上皮の反復暴露の影響の研究を、 とりわけ可能、従来の2D細胞培養では達成できない、拡張培養期間を容易にします。さらに、このような食道腫瘍またはバレット化生に由来するものなどの細胞株、種々の、例えば、腫瘍浸潤および薬物responsiveneなどのプロセスを調査するためにモデルに組み込むことができますより生物学的に関連する環境でのSS。

この原稿が正常ヒト食道上皮の培養3Dモデルに、 図1に概略的に示され、必要なプロセスについて説明します。実験プラットフォームの組織学的および免疫組織化学的研究として、モデルの適合性を確認するために、正常なヒト食道扁平上皮粘膜との培養組織を比較行われています。 記載の方法により製造上皮の組織学的評価は、細胞の薄い（5〜10層にもかかわらず、正常なヒト食道（ 図2A）で観察されたものに匹敵する成熟した、多層、重層扁平上皮（ 図2B）を示します細胞は、それらが表面に向かって移動するように漸進的に平坦で、最終的に無核になってと、通常の食道用の10から20）、と比較。 増殖およびジのキーマーカーの免疫組織化学的特性評価fferentiationは、モデル上皮のミクロ解剖学が正常なヒト食道上皮に類似していることを示しています。同等のKi67発現は、基底内の細胞と即座に基底上層（ 図3Aおよび<strong...

この原稿は、生産、特性評価および正常な初代ヒト食道線維芽細胞および脱細胞化ブタの足場内に播種した扁平上皮細胞から調製した組織工学3D食道構造物の潜在的な用途を説明しています。結果は、正常なヒトの食道に似成熟重層上皮の形成を実証します。

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

この手順の全体的な目的は、実験プラットフォームとして利用するためのヒト食道上皮の3D組織工学モデルを作製することです。まず、ヒト食道組織サンプルから正常なヒト食道線維芽細胞および上皮細胞を分離します。次に、線維芽細胞を脱上皮化した無細胞の多孔性食道スキャフォールドに播種し、7日間培養します。次に、スキャホールドを反転させ、単離したヒト食道上皮細胞を添加して4日間培養します。最終ステップとして、モデルを気液界面（air liquid interface）に移してさらに5日間培養し、成熟した層状上皮を発達させます。最終的に、免疫組織化学を用いて、モデル上皮細胞で発現している増殖および分化の主要なマーカーを特性解析します。従来の2D細胞培養に対するこの手法の主な利点は、in vivoで起こる細胞・細胞間および細胞・細胞外マトリックス間の相互作用を細胞に持たせることができる点です。この手法を用いることで、正常な食道に類似した成熟した重層扁平上皮を作製することが可能です。一般的に、この方法を初めて行う方は、主に3つの理由で困難に直面します。第一に、大部分の上皮細胞がスキャフォールドに組み込まれる前に分化しないようにすることは困難な場合があります。第二に、上皮が成熟する期間に、適切な気液界面が提供されるように注意する必要があります。そして第三に、培養期間を通じてその特性を維持することが課題となる場合があります。ヒト食道上皮細胞を単離するには、採取した食道扁平粘膜組織を滅菌済みのペトリ皿に入れ、エタノール滅菌したメスを用いて組織を0.5 centimeterの帯状に切断します。次に、組織を0.1% tryinに浸し、37 degrees Celsiusでインキュベートし、1時間後に5 millilitersのFCSを加えて消化を停止させます。続いて、ピンセットで組織片を固定し、メスの刃で上皮表面を1片あたり1〜2分間優しく掻き取り、上皮細胞を周囲の培地中に放出させます。すべての組織片の掻き取りが完了したら、剥離した上皮細胞を含む培地を15 milliliter遠心チューブに移します。細胞を遠心分離した後、上清を捨て、ペレットを12 millilitersの上皮細胞用培地で再懸濁します。次に、フィーダー細胞培養液を除去し、滅菌ピペットを用いて上皮細胞をフィーダー細胞上に播種し、ヒト食道線維芽細胞を分離します。掻爬した組織片を滅菌シャーレに移し、最後にメスで組織を細切します。10 mLの0.5% Collagenase a溶液中で、37 °C、5% CO2、および加湿条件下で一晩消化させます。翌日、消化物を50 mL遠心チューブに移し、細胞を遠心分離して回収します。得られたペレットを10 mLの線維芽細胞培養培地で再懸濁します。細胞培養インキュベーター内、T 75フラスコでの培養。脱細胞化したブタ食道スキャフォールドを調製するには、まずハサミとピンセットを使用して、ブタの食道を縦方向に切り開きます。次に、組織をすすぎながら、100 mLの滅菌PBSを入れた180 mLの滅菌ポットの中で、緩やかに振盪しながら10分間食道を洗浄し、付着したデブリを除去します。コルク製の解剖ボードに70%ethanolをスプレーします。食道が乾いた状態で、粘膜面を上にしてボード上に置きます。次に、滅菌ピンセットで食道の端の粘膜表面を掴み、組織をボードから引き離して、粘膜をその下の粘膜下層から分離させます。その後、滅菌メスを用いて、固有層に沿って食道を縦方向に切開します。切開が進むにつれてピンを抜き、粘膜を持ち上げられるようにします。下層の粘膜下層を除去し、メスを用いて残った粘膜を5 cm四方の断片に切り分けます。実演した通り、150 mLの滅菌PBS中で緩やかに攪拌しながら、これらの断片を洗浄します。5分後、組織を150 mLの1 M塩化ナトリウム溶液が入った180 mLのポットに移します。37°Cで抗生物質を添加して培養します。72時間後、組織を150 mLの滅菌PBSに移すと、上皮が下層組織から目に見えて剥離し始めます。滅菌鉗子とメスを用いて剥離した上皮を取り除き、残った組織を150 mLの新しい滅菌PBSに入れた容器に移します。緩やかに攪拌しながら5分間の洗浄を3回行い、その後、組織をグリセロール中で最低4か月間保存する必要があります。足場材料を完全に滅菌するため、グリセロール中で4カ月以上滅菌済みのブタ足場材料の断片を再水和させ、食道粘膜モデルの作製を開始します。滅菌済みのPBS 100 mLを用い、10分間の攪拌を5回行います。洗浄ごとに上清を新しいPBSに交換してください。5回目の攪拌試験後、100 mLのDMEMを用いて37 °Cで一晩培養し、スキャフォールドの無菌性を確認します。翌朝、スキャフォールドを6ウェルプレートの各ウェルに粘膜下側を上にして移します。次に、滅菌済みの医療グレードステンレス製リングを各スキャフォールドの中央に配置し、滅菌鉗子を用いてリングを優しく5回押し下げ、組織との十分な密着を確保します。0.2 millilitersの線維芽細胞培地に含まれる5つのヒト食道線維芽細胞を、各リングの中央に配置します。次に、リングの外周エリアにさらに2 milliliters以上の線維芽細胞培地を満たし、スキャフォールドを細胞培養インキュベーターでインキュベートします。24時間後、リングを取り除き、各ウェルの培地を5 milliliters以上の新鮮な線維芽細胞培地に交換します。足場材が完全に浸った状態になるように培地を加えます。1週間後、培地を除去し、ピンセットを用いて足場材を反転させ、粘膜側を上にします。リングを再び足場材の上に配置し、0.2 millilitersの複合培地に懸濁させた上皮細胞を、各リングの中央に1回分ずつ加えます。リングの外側を約2 mLの複合培地1で充填し、コンストラクトをインキュベーターに戻します。24時間後、リングを取り除き、各ウェルの培地を少なくとも5 mLの新鮮な複合培地1に交換し、スキャフォールドが完全に浸っていることを確認してください。さらに24時間後、培地を少なくとも5 mLの複合培地2に交換します。4日目に、滅菌済みの医療用グレードステンレス製メッシュグリッドを新しい6ウェルプレートの各ウェルに配置し、作製物を粘膜側を上にしてグリッド上に移します。最後に、サンプルが気液界面に維持されるよう、表面を空気にさらしたまま、作製物の底面に届く量まで複合培地3を加えます。この手順で最も困難なのは、気液界面を構築することです。パイペットチップが液体に浸かっている方が視認しやすいため、グリッドが滅菌済みのパイペットチップと液体で接しているかどうかが不明確な場合があります。あるいは、液体が動いている方が視認しやすいため、プレートを静かに揺らし、サンプルを覆い隠すことなくグリッド上に液体が存在することを確認してください。これにより、上皮の論理的な評価の結果、成熟した多層扁平上皮が示されました。これは正常なヒト食道で観察されるものと類似していますが、より薄く、細胞は表面に向かって移行するにつれて徐々に扁平になり、最終的に核を消失します。増殖および分化の主要マーカーの免疫組織化学的特性評価により、本モデル上皮の微細解剖学的構造が正常なヒト食道上皮と同様であることが示されました。例えば、サイトケラチン14の同様の発現が、天然の食道とモデル上皮の両方で観察され、染色は基底層の細胞に限定されていました。このモデルは、一次上皮細胞を癌細胞に置換することで腫瘍細胞を組み込むように正常に改変されており、本モデルの柔軟性が実証されています。例えば、扁平上皮癌細胞は、構築物上に明確な黄色い領域として視認できる上皮を形成し、その上皮内には大きな裂隙が見られます。これは、機能不全のcellia分子の存在を反映していると考えられます。モデル内に食道腺癌細胞が含まれている場合、大量の足場材料の分解が起こり、足場の薄層化として目視で確認できます。気液界面で2週間培養した後、H&amp;E染色解析によって、細胞下の領域で足場の厚みが明らかに減少していることが確認されました。この手順に続き、ノーザンブロット法やウェスタンブロット法などの他の遺伝子発現解析手法を同一組織に適用することで、「上皮は環境ストレスにどのように反応するか」といった問いに対する答えを得ることができます。したがって、本手法は、構築後のさらなる詳細な検討を行うための非常に有用なリソースとなります。この手法は、バレット metaplasiaに関心を持つ研究者が、特定の逆流成分への曝露が正常なヒト食道における遺伝子発現に及ぼす影響を研究するための道を切り開きました。

production-characterization-potential-uses-3d-tissue-engineered-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオでは、組織工学アプリケーションのための、その生化学的構造と組成が保存された脱細胞化ブタ食道足場の準備を示しています。...

脱細胞化ブタ食道足場調製:ブタ食道から無細胞足場を生成する技術

このビデオでは、脱細胞化したブタの足場内で初代ヒト食道線維芽細胞と扁平上皮細胞を共培養することにより、ヒト器官型食道構築物を生成するin vitro培養技術について説明しています。これらの3D培養モデルは、in...

食道3Dいかだ培養モデル:ヒト食道粘膜モデルを生成するための体外培養技術

試験系として、ヒトの3D腫瘍組織を作成するための方法が記載されている。これらの技術は、脱細胞化生体血管柄足場（BioVaSc）、初代ヒト細胞およびフローバイオリアクターにおける動的条件下で、ならびに、静的条件下で培養することができる腫瘍細胞株に基づいている。...

人間の3次元の組織工学<em&gt; in vitroで</em&gt;腫瘍テストシステム

三次元（3-D）環境中で増殖する細胞は、2-D環境（ 例えば 、フラスコまたはディッシュ）で細胞培養上顕著な改善を示します。ここでは、回転-壁容器（RWV）バイオリアクターが提供する微小重力下で培養ヒト腸粘膜の多細胞3次元器官モデルの開発について説明します。...

微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

条件付き再プログラミングを利用した人の小児食道上皮細胞の拡大は、欠陥やけがを治療し、治療的スクリーニングアッセイのためのリザーバとして機能する自家移植のために食道の構築物を設計するために利用することができる細胞の患者特有の人口を持つ研究者を提供します。...

ティッシュ・エンジニアリングと疾病調査に使用するための小児のヒト食道上皮細胞の条件付き再プログラミング

食道再建は困難な処置であり、食道粘膜や筋肉の再生を可能にし、人工移植として移植できる組織工学的食道の開発が必要である。ここでは、足場製造、バイオリアクター栽培、各種外科技術など、人工食道を生成するためのプロトコルを紹介します。...

ラットにおける円周食道再建のための組織工学型移植片

このプロトコルでは、化学的発がんによって誘発される正常、腫瘍前、および扁平上皮がんの病変を表すマウスの口腔食道3Dオルガノイドを生成および特性評価するための重要なステップについて説明します。...

3Dオルガノイドによる口腔食道扁平上皮癌のモデリング

オルガノイド-線維芽細胞共培養は、 in vivo...

オルガノイド共培養を用いた食道線維芽細胞の機能特性評価と可視化

ここでは、基本的な3次元(3D)腸細胞株モデルシステムの構築と、固定された腸当等物の光学顕微鏡的評価のためのパラフィン包埋プロトコルについて説明します。選択したタンパク質を染色することで、1回の実験で複数の視覚的パラメータを解析し、前臨床薬物スクリーニング研究に活用することができます。...

免疫成分を用いた基本的な3次元(3D)腸管モデルシステム

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

メルトエレクトロスピニングライティング(MEW)、ポリカプロラクトン(PCL)スキャフォールド、フィブリンハイドロゲルをhiPSC由来の心筋細胞および線維芽細胞と組み合わせた3D心筋組織を作製するための再現性の高い方法を紹介します。この手法は、スキャフォールドアーキテクチャを正確に制御し、前臨床薬物試験や心疾患モデリングに適用できます。...

ポリカプロラクトン足場およびhiPSC由来心細胞の溶融エレクトロスピニングライティングを用いたヒト心筋組織作製

学ぶ、3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの作製法。線維芽細胞と上皮細胞を脱細胞化ポルキンスカフォールドに播種し、気液界面で成熟層状上皮を形成する手法です。再生医療や疾患モデリングの研究に有用です。

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

さらに動画を探す