生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル
2010年5月23日
アフリカツメガエル胚上皮は、上皮形態形成時の極性の開発と形状の変化などの細胞の挙動を研究する理想的なモデルシステムです。固定試料の伝統的な組織は、ますます生細胞の共焦点イメージングによって補完されています。ここでは、カエルの組織を分離し、生きた細胞の共焦点顕微鏡を使用して、ライブ上皮細胞とその細胞骨格を可視化する方法を示しています。
本手順の全体的な目的は、胚上皮細胞の形態を解析するためのライブイメージングおよび簡便な定量化手法を実演することです。まず、すべてのツールと装置を準備します。次に、カエルの胚からX explanを切り出し、長期培養用のチャンバーに収容します。
手順の3番目のステップは、上皮細胞の高解像度画像をリアルタイムで収集することです。手順の最終ステップは、Image Jを用いて上皮細胞の形態学的詳細を定量化することです。最終的に、高解像度共焦点顕微鏡を通じて、追跡された細胞領域と膜強度を示す結果を得ることができます。こんにちは、ピッツバーグ大学バイオエンジニアリング学科のDavidson研究室のSagar Joshiです。
本日は、Xenos lavia胚上皮細胞のライブセルイメージングおよび定量分析の手順について解説します。この手順を用いて、細胞骨格のリアルタイムな変化を研究します。それでは始めていきましょう。
動物キャップを培養するためのチャンバーを準備するには、シリコングリースを使用して、カスタムアクリルチャンバーまたは小型のナイロンワッシャーを45 by 50 mmの大型カバーガラスに密閉します。チャンバーに1/3 XMBSで調製した1% BSAを1 mL加えます。小型のカバースリップ断片を同溶液でコーティングし、室温で2〜4時間、または4 °Cで一晩インキュベートします。
X explanのガラスへの接着を軽減するため、チャンバーをDFA培地で洗浄し、満たします。Xを移す直前に、カバースリップの断片を同様に洗浄してください。その後、1〜4細胞期に目的のmRNAをマイクロインジェクションし、1/3 XMBS中で目的の段階まで成長させたDFA培養胚の入ったディッシュに、それらを浸します。解剖用実体顕微鏡下で、先端を斜めにカットした転送ピペットを使用して、胚をDFAの入ったディッシュに移します。
ピンセットを用いて胚を固定し、動物極側のCapExを摘出します。ヘアループを用いて胚を一定の位置に保持してください。ヘアナイフを用いて動物極に小さな切開を加えます。
滑らかなフリックカットを繰り返し行い、切開線を広げてキャップ外胚葉を除去します。同様の方法で3〜4つの外胚葉（explan）を摘出します。その後、転送ピペットを使用して、用意した培養チャンバーに移動させます。
ヘアループを使用して、上皮がチャンバーの底面を向くように各X explanを配置します。ピンセットを用いて、カバーガラス片の中央を保持してください。
端をシリコングリースに浸します。各X explanの上にフラグメントを1つずつ配置します。少量のシリコングリースを用いて、各フラグメントを軽く固定します。
X explanを過剰な力で完全に潰さないように注意します。チャンバーにDFAを満たし、チャンバーの上端にシリコングリースを塗布します。その後、24 x 40 millimeterのカバーガラスで上部を密封します。
気泡を減らすためにチャンバー内のDFAの液量を調整し、溢れた分はティッシュで拭き取ります。これにより、X植物を密閉チャンバー内で室温で1日間、長期培養することが可能になります。共焦点顕微鏡の20倍対物レンズを所定の位置に移動させます。X外植体を含むチャンバーを顕微鏡のステージ上に配置し、明視野下で位置を固定するために、チャンバーの上に小さなバランスウェイトを置きます。
ピントを調整し、粗い位置調整を行って、表層細胞の頂端側を可視化します。蛍光観察に切り替え、より高倍率の対物レンズを使用します。剥離した上皮の静止画またはタイムラプス動画を収集するために、最適な画像が得られるよう撮影条件を調整します。
チューニングおよびイメージングに関するヒントについては、本プロトコルの記述部分を参照してください。レーザー出力は可能な限り低く維持してください。x explan上皮の画像またはタイムラプス動画をキャプチャします。
データ収集に関する提案については、プロトコルの記述部分を参照してください。共焦点画像ファイルからは、さまざまな方法でデータを抽出できます。以下に、Bio-Formatsプラグインを備えたImage J解析ソフトウェアを使用してデータファイルを分析する2つの例を示します。
上皮細胞の細胞面積を測定するには、「Analyze」メニューを展開し、「Set Measurements」をクリックします。ツールバーから選択ツールを選び、細胞の外郭を囲みます。「Analyze」メニューから「Tools」を選択し、「ROI Manager」を選択してください。関心領域（ROI）マネージャーを開くには、Control + T キーを押します。
ROIマネージャーにアウトラインを追加するには、画像から任意の数だけアウトラインを選択して追加します。次に [Save] をクリックして、ROIセットをROIマネージャーに保存します。[Measure] をクリックします。
これで、結果ウィンドウに各ROIの測定面積が表示されます。細胞膜の強度を測定するには、ImageJツールバーから直線ツールを選択します。膜に対して垂直な線を描画してください。
前の例と同様に CTRL T を押します。選択範囲をROIマネージャーに追加するには、「Analyze」メニューを開き、「Plot Profile」をクリックして、ライン上の相対強度のプロットを生成します。グラフを画像として保存するには、新しく表示されたプロットウィンドウの「Save」をクリックします。
リストメニューから「ファイル」を選択し、「名前を付けて保存」をクリックします。以上で、摘出した動物のCapEx外植片から胚性上皮細胞をライブイメージングおよび定量化する方法を説明しました。この手順を行う際は、DMEMに抗生物質と抗真菌剤を添加することを忘れないでください。細菌や真菌の増殖を防ぐため、カバーガラスで外植片を固定する際は特に注意してください。過剰な圧力をかけると、外植片を押し潰してしまう可能性があります。
また、最高品質の画像データを取得するために、共焦点顕微鏡の設定を最適化することが重要であるということを覚えておいてください。以上になります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。
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概要
本記事では、Xenopusにおける胚上皮細胞の形態を研究するためのライブイメージング技術について解説します。カエルの組織を単離する方法と、共焦点顕微鏡を用いて生存中の上皮細胞を可視化する方法に焦点を当てます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- Xenopus胚性上皮は、細胞挙動を研究するためのモデルとして利用されます。
- ライブセルイメージングは、従来の組織学的解析を補完します。
- 上皮の形態形成を理解することは、発生学的な研究において極めて重要です。
- 共焦点顕微鏡を用いることで、細胞動態のリアルタイム可視化が可能になります。
研究目的
- 上皮細胞のライブイメージング技術を実演する。
- 上皮細胞の形態学的詳細を定量化する。
- カエルの組織を単離および培養するためのプロトコルを提供する。
使用した手法
- イメージング用ツールおよび装置の準備。
- 培養のためにカエル胚から組織を切り出す。
- 上皮細胞の高解像度画像を収集する。
- Image Jソフトウェアを用いて細胞形態を定量化する。
主な結果
- 生存 epithelial cells の高解像度画像を取得した。
- 定量分析により、追跡した細胞面積および膜強度が明らかになった。
- ライブイメージングにより、形態形成中の細胞挙動に関する知見が得られた。
- カエルの組織の長期培養法を検証した。
結論
- ライブセル共焦点顕微鏡法は、上皮細胞の研究に有効です。
- これらの手法は、さまざまな発生生物学の研究に適用可能です。
- 得られた結果により、上皮の形態形成への理解が深まります。
よくある質問
産業界における重要性
Xenopus laevisの胚上皮細胞における生細胞イメージングおよび定量的解析は、初期の発見やターゲット検証に関連する形態形成プロセスの検討に有用なダイナミックなプラットフォームを提供します。高解像度共焦点顕微鏡により、細胞形態とタンパク質局在のリアルタイム測定が可能となり、発生生物学モデルにおける予測の信頼性が向上します。このワークフローは、前臨床研究におけるメカニズムのリスク低減（de-risking）およびポートフォリオの優先順位付けにおいて、上皮系のトランスレーショナルな価値を高めます。
バイオ製薬研究開発における戦略的応用
初期創薬探索およびターゲットバリデーション
- 細胞骨格の変化と細胞形態のダイナミクスをリアルタイムで直接観察することが可能になります。
- 上皮形態形成に関与する分子ターゲットの機能的検証をサポートします。
- 細胞面積および膜強度の変化を定量化することで、メカニズムの不確実性の低減（de-risking）を促進します。
- 発生経路に関する仮説駆動型の検証のためのプラットフォームを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームの定量イメージングワークフローに向けた、検証済みの生存細胞システムを準備します。
- 再現性のあるImage J解析を用い、形態学的パラメータの測定を標準化します。
- 上皮細胞の挙動に影響を与える化合物のハイスループットスクリーニングを可能にします。
- 比較研究のためのアッセイの拡張性とプラットフォームの再利用をサポートします。
翻訳・前臨床研究
- 動的な上皮プロセスの捕捉により、疾患に関連したモデルとの整合性を確保します。
- 定量的なアウトプットを通じて、発見から前臨床検証までの連続性を保証します。
- 予測的なリアルタイムの細胞リードアウトを提供することで、生物学的リスクを低減します。
- タンパク質の局在をライブイメージングすることで、バイオマーカーの同定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期の仮説検証から前臨床モデルの妥当性確認に至るまでのディスカバリー・コンティニュアム（発見の連続体）に組み込まれており、ライブセルイメージングを活用して堅牢なデータを生成します。
- 探索生物学： リアルタイムの形態解析を通じて、仮説検証および経路の解明を可能にします。
- スクリーニング： アッセイ開発および化合物評価のための、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 分析学： 比較分析のために、細胞面積および膜強度の精密な測定を行います。
- トランスレーショナルリサーチ： 疾患関連のシステムモデリングを支援し、探索研究と前臨床研究を繋ぎます。
- エンタープライズ再利用： 多様な上皮研究に活用可能な、再利用可能なイメージングおよび解析プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：上皮生物学における予測の信頼性を向上させ、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用的価値：ライブセルイメージングのワークフローにおいて、標準化、再現性、および拡張性を促進します。
- 戦略的価値：堅牢な定量データを提供することで、Go/No-go決定に根拠を与え、資本効率を高めます。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付けおよび、探索段階にあるアセットの推進を支援します。
実施上の検討事項
- 共焦点顕微鏡および定量的な画像解析の専門知識が必要です。
- 専用のイメージング装置および解析ソフトウェア（例：Image J）へのアクセスが求められます。
- イメージングおよび測定プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 異なるモデルシステムや組織型に合わせて最適化が必要な場合があります。
- データの品質を確保するため、最適な培養条件と慎重なサンプルハンドリングに依存します。
