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Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル

Full Text

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06:51 min

May 23, 2010

DOI: 10.3791/1949-v

Sagar D. Joshi¹, Lance A. Davidson^1,2

¹Bioengineering,University of Pittsburgh, ²Developmental Biology,University of Pittsburgh

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

アフリカツメガエル胚上皮は、上皮形態形成時の極性の開発と形状の変化などの細胞の挙動を研究する理想的なモデルシステムです。固定試料の伝統的な組織は、ますます生細胞の共焦点イメージングによって補完されています。ここでは、カエルの組織を分離し、生きた細胞の共焦点顕微鏡を使用して、ライブ上皮細胞とその細胞骨格を可視化する方法を示しています。

Transcript

この手順の全体的な目標は、胚性上皮細胞の形態を解析するためのライブイメージングと簡単な定量化方法を実証することです。これは、最初にすべてのツールと装置を準備することによって達成されます。手順の2番目のステップは、カエルの胚からXエクスプランを取り出し、長期培養のためにチャンバーに収容することです。

手順の3番目のステップは、上皮細胞の高解像度画像をリアルタイムで収集することです。手順の最後のステップは、Image J.を使用して上皮細胞の形態学的詳細を定量化することです。最終的には、高解像度の共焦点顕微鏡を通じて、追跡された細胞領域と膜強度を示す結果を得ることができます。こんにちは、ピッツバーグ大学生物工学科のデビッドソン研究室のSagar Joshiです。

本日は、Xenos labia胚上皮細胞のライブセルイメージングと定量解析の手順をご紹介します。この手順を使用して、リアルタイムの細胞細胞骨格の変化を研究します。それでは始めましょう。

動物用キャップキャップを培養するためのチャンバーを準備するには、シリコングリースを使用して、カスタムアクリルチャンバーまたは小さなナイロンワッシャーを45 x 50ミリメートルの大きなカバーガラスにシールします。チャンバーに3分の1のXMBSに1ミリリットルの1%BSAを追加します。小さなカバースリップフラグメントを同じ溶液でコーティングし、室温で2〜4時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。

X explanのガラスへの付着を減らすには、xsで移す直前までチャンバーをDFAメディウムですすぎ、充填し、カバースリップの破片を同じ方法ですすぎます。次に、1〜4細胞段階で所望のMR NAを所望の3分の1XMBSのステージにマイクロ注入したDFA培養胚の皿にそれらを浸します。斜めの開口部を持つトランスファーピペットを使用して、解剖実体顕微鏡下で胚をDFAの皿に移します。

鉗子を使用して胚を化生し、動物のCapEx植物を切除します。ヘアループを使用して、胚を1つの位置で支えます。ヘアナイフを使用して、動物のポールに小さな切開を行います。

滑らかなフリックカットを繰り返して切開部を伸ばし、キャップ外胚葉を取り外します。同じ方法で3つまたは4つのxexplanを物品税します。そして、トランスファーピペットを使用して、準備した培養チャンバーに移動します。

ヘアループを使用して、上皮がチャンバーの底を向くように各Xエクスプランを配置します。鉗子を使用します。カバースリップの破片をその中央に保持します。

端をシリコングリースに浸します。各X explanに1つのフラグメントを配置します。各フラグメントをシリコングリースの小さなダブで所定の位置に軽く固定します。

X explanを無理な力で完全に叩き割らないように注意してください。チャンバーにDFAを充填し、チャンバーの上端をシリコングリースでコーティングします。次に、24 x 40ミリメートルのカバースリップで上部を密封します。

チャンバー内のDFAのレベルを調整して気泡を減らし、ティッシュを使用してオーバーフローを拭き取ります。X植物は、密閉されたチャンバー内で室温で1日長期間培養することができ、共焦点顕微鏡の20倍対物レンズを所定の位置に移動します。X explanが入ったチャンバーを顕微鏡ステージに配置し、チャンバーに小さなバランスウェイトを置いて、明視野の下で所定の位置に保持します。

フォーカスを調整し、コースポジショニングを使用して、表在細胞の頂端端を視覚化します。蛍光と高出力対物レンズに切り替えます。explan上皮の単一の画像またはタイムラプスムービーを収集するには、可能な限り最高の画像が得られるように取得を調整します。

チューニングとイメージングのヒントについては、このプロトコルの記述された部分を参照してください。レーザー出力をできるだけ低く保ちます。x explan上皮の画像またはタイムラプス動画をキャプチャします。

データ収集に関する提案については、プロトコルの記述された部分を参照してください。共焦点画像ファイルは、さまざまな方法でデータをマイニングできます。ここでは、Image J解析ソフトとバイオフォーマットプラグインを使用してデータファイルを解析する方法を2つ紹介します。

上皮細胞の細胞面積を測定するには、解析メニューをプルダウンして、測定値の設定をクリックします。ツールバーから選択ツールを選択し、分析メニューでセルのアウトラインを作成し、ツールを選択してから ROI マネージャーを選択します。関心領域マネージャーを開くには、コントロール t キーを押します。

ROI マネージャーにアウトラインを追加するには、画像から必要な数のアウトラインを選択して追加します。次に、[保存] をクリックして、ROI セットを ROI マネージャーに保存します。[測定] をクリックします。

結果ウィンドウに、各ROIの測定領域が表示されます。細胞膜の強度を測定するには、画像Jツールバーから直線ツールを選択します。メンブレンを横切って垂直線を引きます。

前の例のように Ctrl T キーを押します。選択項目をROIマネージャーに追加するには、解析メニューをプルダウンし、プロットプロファイルをクリックして、ライン全体の相対強度のプロットを生成します。グラフを画像として保存するには、表示される新しいプロットウィンドウで保存をクリックします。

リストメニューをプルダウンしてファイルし、切除された動物のCapEx説明から胚性上皮細胞をライブ画像化し定量化する方法を示したばかりとして保存します。この手順を実行する際には、DFAに抗生物質と抗生物質を追加することを忘れないでください。細菌や真菌の増殖を防ぐために、必要以上の圧力がexexの説明を壊す可能性があるため、カバースリップの下に外植片を押し込むときは特に注意してください。

また、最高品質の画像データを取得するために、共焦点顕微鏡を最適に設定することを覚えておくことも重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。

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