再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

眼刺激性試験の全体的な目的は、物質および混合物をその眼刺激性の可能性に基づいて分類およびラベル付けすることです。この手順では、3次元再構築角膜様組織モデルを使用します。試験キットが届いた後、アッセイ培地で一晩事前インキュベーションを行い、翌日に組織を水和させます。その後、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、および目的の試験化学物質を、組織表面に2連（duplicate）で局所適用します。

一定期間の曝露後、洗浄によって試験化学物質を除去します。組織を新鮮なアッセイ培地で後インキュベートし、その後MTTアッセイによって化学物質の毒性を評価します。最終的に、試験物質処理組織の相対的な生存率を陰性対照処理組織と比較することで、試験物質の刺激性を評価することができます。

迅速眼刺激試験などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、実験動物を用いないことです。本手法では、正常なヒト細胞で構成される、in vitroの再構成角膜様眼組織モデルを利用します。あらゆる種類の物質および混合物に適用可能であり、眼刺激または深刻な眼損傷を誘発する化学物質を、それ以外の材料から識別することができます。

分類および表示を必要としない非刺激性物質。再構築ヒト角膜様上皮組織（EpiOcular）は、細胞に栄養素を供給するための多孔質膜を備えたインサート内で調製されます。

再構成組織は、漸進的に層形成されるが角化していない細胞によって、角膜上皮をモデル化した非角化上皮を形成します。ヒト角膜様上皮キットを受け取ったら、24ウェル配送容器内の組織を室温に慣らしてください。15分後、無菌条件下で24ウェル組織プレートが入ったバッグを開き、アグロスゲルとインサートの間に気泡がないかすべての組織を確認します。カットしてください。テープを開けます。

滅菌ガーゼを用いてカバーを取り除き、組織表面を確認します。次に、37 °Cに温めたキットのアッセイ培地1 mLを、あらかじめラベルを貼った6ウェルプレートの各ウェルに分注します。その後、滅菌ピンセットを使用して、インサートに入った組織を滅菌ガーゼで軽く押さえ、輸送液を完全に取り除いてから、6ウェルプレートの各ウェルに個別に配置します。

1時間後、培地を1 mLの新鮮な37 °Cのアッセイ培地と交換し、組織を標準的な培養条件下で一晩インキュベートします。翌日、各組織の頂端面に20 µLのカルシウム・マグネシウムフリーDPBSを滴下します。DPBSが組織全体に広がらない場合は、ピンセットでインサートを軽く固定し、プレートを軽く叩いて、生理食塩水が組織表面全体を濡らすようにしてください。

プレートを30分間インキュベートします。次に、液体試験物質で組織を処理するために、タイムテーブルに従って陰性対照、陽性対照、および適切な試験物質をそれぞれ50 µLずつ2連（duplicate）で添加します。処理剤が組織表面全体を覆うように注意し、その後、固体試験物質で組織を処理するためにインサートを30分間インキュベートします。

まず、インサートを滅菌済みの表面に移動させます。空気中の固形粒子による汚染を防ぐため、プレートは蓋をしたままにしておきます。次に、水平にしたスプーンを用いて、タイムテーブルに従い、テスト物質 50 milligrams を重複した組織上に局所的に塗布し、処理剤が組織表面全体を覆うように注意してください。

あるいは、先端を切断した1 mLの充填済みシリンジを使用します。粉末を培養物に直接配置してください。固形試験物質を適用した直後にプランジャーを押し下げて粉末を塗布し、インサートを6ウェルプレートに戻して、組織を洗浄するために6時間インキュベートします。

処理後、曝露インキュベーションの終了時に、被験物質1つにつき150 milliliterのビーカー3個に100 millilitersのDPBSを満たします。曲がったピンセットでインサートの上端を掴み、ウェルから取り出します。次に、ピンセットを使用して、同じ処理のインサート2つを上端から持ち上げ、処理液を清潔な吸収材の上にデカンテーションします。

次に、インサートを1つ目のDPBSが入ったビーカーに浸し、円を描くように回しながら2秒間組織を洗浄します。その後、インサートの大部分にDPBSが入った状態で引き上げ、液体をビーカーに戻します。1つ目のビーカーでこの洗浄を2回繰り返します。

その後、最後の洗浄と同様の手順で、DPBSが入った2つ目と3つ目のビーカーでインサートをそれぞれ3回ずつすすぎます。各インサートを約45度の角度に傾け、開口部を下に向けて、上端を吸水材に触れさせて残っているDPBSを捨てます。その後、すぐに組織を5 mLの室温のアッセイ培地に浸します。

浸漬期間の終了後、あらかじめラベルを貼った12ウェルプレートからアッセイ培地をデカントし、インサートを吸収材でブロットします。次に、インサートを、1ウェルあたり1 mLの温めたアッセイ培地を含む新しい6ウェルプレートに移し、インキュベーターに入れてMTT生存率アッセイを開始します。その後、インサートを、0.3 mLの調製直後のMTT溶液を含む24ウェルプレートに移します。

転移させる前に、インサートを吸収材で軽く叩いて水分を取り除きます。インサートの下に溜まった気泡を出し、3時間後に組織をインキュベーターに戻し、インサートの底部を吸収材の上に置きます。次に、非着色液体試験物質の浸漬抽出では、あらかじめラベルを貼った24ウェルプレートに、1ウェルあたり2 mLの適切な抽出液を入れてインサートを浸します。固体または液体の着色物質の非浸漬抽出についても同様に行います。

あらかじめラベルを貼った6ウェルプレートに、1ウェルあたり1 mLの抽出液を入れておき、そこにインサートを移します。次に、蒸発を防ぐためにヒートシーラーまたはパラフィルムでプレートを密閉し、室温で2〜3時間、オービタルシェーカーを用いて抽出します。浸漬抽出の最後には、緩やかに振盪させてください。組織を突き刺し、各インサート内の液体をウェルに戻した後、組織が入ったインサートを廃棄します。

各ウェルの抽出液を混合し、非浸漬抽出の最後にある概略図に示されるように、各サンプルから200 µLずつ2回分を、あらかじめラベルを貼った96ウェルプレートの適切なウェルに分注します。インサートと組織を、刺さずに廃棄し、それぞれに1 mLの抽出液を加えます。ウェル内の抽出液を十分に混合し、先ほど示した通り、各サンプルから200 µLずつ2回分を、ラベル貼りのある96ウェルプレートの適切なウェルに分注します。

最後に、リファレンスフィルターを使用せずに、96ウェル分光光度計を用いて570 nanometerの波長でサンプルの吸光度を測定し、それぞれの組織生存率を算出するために結果をスプレッドシートに入力します。ここにあるテキストプロトコルに示されている通り、試験化学物質による干渉に伴う補正を考慮してください。本実験では、10種類の試験物質および陰性・陽性対照を用いて実施された眼刺激性試験の代表的な結果を示しています。100%の組織生存率に対応する陰性対照の平均吸光度は1.31であり、陽性対照の相対的組織生存率は31.2%でした。試験物質1、2、4、7および8は60%以上の組織生存率を示し、これらの物質は非刺激性として分類されました。また、試験物質3、5、6、9および10についても同様です。

一方で、組織生存率が60%以下であったため、これらは刺激物として分類されました。本実験における重複組織間の組織生存率の差は、試験物質2を除き、試験したすべての物質で20%未満でした。したがって、試験物質2を除くすべての試験物質の結果は、眼刺激性試験のすべての許容基準を満たしていたため、適格であると判断されました。

このビデオを視聴することで、化学物質の危険性特定ラベル付けにおける、in vitro 再構築ヒト角膜様組織モデル4を用いたDICATION試験の実施方法について十分に理解することができます。この手順は、階層的試験戦略の一環として、EOC D試験ガイドラインに導入されています。