Name: 細胞挙動を研究するための溝パターンを用いたマイクロ流体デバイス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: 学ぼう、溝パターンを用いたマイクロ流体デバイスの作製法と細胞捕獲技術。低せん断応力環境で細胞ドッキングを実現し、細胞間相互作用と細胞挙動の研究に応用する方法を解説します。

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マイクロ流体デバイスのA.の微細加工<ol><li> 4インチSiウエハーは、活性酸素プラズマ（30W、Harrick科学、NYで5分）で処理される。 </li><li>ネガ型フォトレジスト（SU - 8 2015、マイクロケム、MA）は、Siウエハ上に1分間900rpmでスピンコートです。 </li><li>ウェハは、ソフトは95で焼成° Cのホットプレート上で6分とマイクロチャネルを含むマスク膜を介して4分間UVライト（200W）にさらされている。 </li><li>ウェハは、95で焼成した後℃で6分間であり、SU - 8フォトレジストの現像剤を使用して開発されています。 </li><li>マイクロチャネルを含むフォトレジストパターン付きウェーハは、ペトリ皿に配置されます。 </li><li>ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）（Sylgard 184）金型は、混合シリコーンエラストマーと硬化剤（10:1比）によって製造される。 </li><li> PDMSの混合物は、Siマスターモールドに注ぎ、気泡を除去するため真空デシケーターに配置されます。 </li><li> PDMSは、1〜2時間、70℃で硬化させる。 </li><li> PDMSモールドは、その後のSiマスターモールドから剥離されています。 </li></ol> b.デバイスの組み立て<ol><li> 40μmの厚さのトップ流体チャネルと40μm厚の底microgroovedチャンネル（25、50、75、および100μメートル、幅）は、二つの異なるSiのマスター金型から取得されます。 </li><li>流体デバイスのチャネル入口と出口がパンチされています。 </li><li>流体チャンネルとマイクログルーブのチャンネルが不可逆的に活性酸素をプラズマ（30W、Harrick科学、NYで5分）によって接合される。 </li><li>細胞外マトリックス（ECM）（すなわちフィブロネクチンは）インキュベーターで1時間（37℃）のためにマイクロ流体デバイスの内部にコーティングされています。 </li></ol> C.細胞播種と実験<ol><li> NIH - 3T3マウス線維芽細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダ​​ルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を用いて組織培養フラスコで培養されています。 </li><li>細胞はトリプシン処理し、解離する。 </li><li>解離細胞を3の細胞密度× 10 6細胞/ ml（図1）におけるマイクログルーブのチャンネルにロードされます。 <img src="/files/ftp_upload/old/270_2008_8_24_3/270_Figure-01.png" alt="図1" width="191" height="300" /> 図1 </li><li> 2 mLのメディア、100mMのH 2 O 2、およびアポトーシスアッセイ（20μLのアネキシンVと40μLヨウ化プロピジウム、Invitrogen社、カリフォルニア州）は、シリンジポンプ（1μL/分）を使用してチャネルに注入されています。 </li><li>細胞は倒立顕微鏡（ニコンTE 2000）を使用して監視し、リアルタイムです。 </li></ol>

<ol><li>Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+microfluidic-vacuum+device+for+interfacing+with+conventional+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform.</a> BMC Biotechnol. 7, (2007).</li>
<li>Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+docking+inside+microwells+within+reversibly+sealed+microfluidic+channels+for+fabricating+multiphenotype+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays.</a> Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).</li>
<li>Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+analysis+of+hydrogen+peroxide-induced+cell+death+in+primary+neuronal+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture.</a> Neuroscience. 67, 921-932 (1995).</li>
</ol>

細胞は、マイクロ流体デバイスでmicrogrooved基板内に固定し、パターン化された。過酸化水素に曝露された細胞のアポトーシスの過程をリアルタイムで観察し、アネキシンVとヨウ化プロピジウムを用いて分析した。従って、マイクログルーブのチャンネルを含むこのマイクロ流体デバイスは、ハイスループット薬物スクリーニングのための役に立つかもしれません。

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>試薬</td><td>K.R. Anderson Co.</td><td>2065622</td><td>ポリジメチルシロキサン、Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>培地</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Media </td></tr><tr><td>FBS</td><td>血清</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>ウシ胎児血清</td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>アポトーシスアッセイ</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>V13242</td><td>Annexin A、プロピジウムヨード</td></tr><tr><td>ネガ型フォトレジスト</td><td></td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 2015</td><td></td></tr><tr><td>Siウェハー</td><td>器具</td><td></td><td></td><td>4 inch シリコンウェハー</td></tr><tr><td>反応性酸素プラズマ</td><td>試薬</td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td></td><td>ウェハーを30Wで5 min処理</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>器具</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞挙動を研究するための溝パターンを用いたマイクロ流体デバイス

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

我々は、細胞の挙動を調べるためにmicrogroovedパターンを持つマイクロ流体デバイスを説明します。このマイクロ流体プラットフォームは、トップ流体チャネルおよび底microgrooved基板で構成されています。 microgroovedチャンネルを作製するために、マイクロ流体チャネルの印象を含む最上位ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）金型が整列しmicrogrooved基板に結合した。このデバイスを使用して、マウスの線維芽細胞は固定化とパターン化microgrooved基板内（25、50、75、および100μm幅）された。マイクロ流体デバイスのアポトーシスを研究するために、過酸化水素、アネキシンV、およびヨウ化プロピジウムを含むメディアは、2時間流路に灌流した。我々は酸化ストレスに曝された細胞がアポトーシスになったことがわかった。これらのアポトーシス細胞は、アポトーシスの過程で、原形質膜の外葉でホスファチジルセリンに結合することがアネキシンVにより確認した。 microgroovedパターンでこのマイクロ流体デバイスを用いて、アポトーシスのプロセスは、リアルタイムで観察し、インキュベーションチャンバー（37℃、5％CO 2）を含む倒立顕微鏡を用いて分析した。したがって、microgrooved基板が組み込まれたこのマイクロ流体デバイスは、細胞挙動を研究し、ハイスループット薬剤スクリーニングを行うために有用である可能性があります。

我々は、細胞の捕獲と文化を可能にすることができるマイクロ流体デバイスの作製のためのプロトコルについて説明します。このアプローチではこのようなマイクロ流体チャネル内の溝のようなパターン化された微細構造は、セルがドッキングすることができる内に低せん断応力領域を作成するために使用されています。

細胞挙動を研究するためのマイクログルーブパターンを備えたマイクロ流体デバイスについて記述します。このマイクロ流体プラットフォームは、上部の流体チャネルから構成され、...

私はJiangです。ハーバード大学とMITの健康・科学・技術分野のポスターフェローを務めています。この研究室での私の専門性は、細胞挙動を研究するための新規なマイクロ流体デバイスを開発することです。非常に斬新なグラジエントデバイスの作製だけでなく、それらを統合したマイクロ流体デバイスの開発も行っています。TCデバイスを用いることで、細胞間相互作用や細胞同士の相互作用、さらには細胞と細胞外マトリックスの接触を精密に制御することが可能です。したがって、TCシステムを利用することで、基礎的な細胞生物学の理解を深めると同時に、発生生物学や幹細胞バイオエンジニアリングへの応用研究を行うことができます。私はAmir Manchiです。ハーバード大学・MITヘルスサイエンス・テクノロジー部門のProfessor Haan研究室に所属する学部生です。私はマイクロ流体デバイスの研究に取り組んでおり、細胞培養や毒性試験などのさまざまな研究において、マイクロ流体デバイスが非常に有用なツールとなり得ることを原理実証として示そうとしてきました。また、流量、形状、およびその他のさまざまなパラメータに応じて、これらのデバイス内部の流体特性を研究し、最適化する試みも行っています。現在はマイクロファブリケーションルームから開始しており、ここで行うのはマイクロ流体デバイスの作製です。マイクロ流体デバイスを実現するためには、シリコンウェーハのパターンと、その上に配置するPDMSモールドが必要です。このPDMSポリマーは、実際には2つの異なる物質の混合物です。これはシリコンエラストマーベースとシリコンエラストマー硬化剤の混合物です。これら2つの混合比率は10対1とし、ベース10に対して硬化剤を1の割合で混合します。ここでは、ベースを約20g用意します。また、硬化剤を2g必要としますが、硬化剤は密度がはるかに低いため、流出速度がかなり速くなります。そのため、少し注意して操作する必要があります。現在、温度は約22°Cであり、これからベース剤と硬化剤を混合します。そこで、パイエットを使用してこれを行います。できるだけ均一に混ざるように十分に撹拌します。このPDMSポリマーを、表面にパターンが形成されたシリコンウェハーの上に注ぎます。シリコンウェハーによって、PDMSモールドにパターンが転写されます。ここには2枚のシリコンウェハーがあるのがわかるかと思いますが、その理由は、1枚がマイクロ流体デバイスの上層用で、もう1枚が下層用であるためです。マイクロ流体デバイスに2つの層が必要なのは、内部にチャネルを形成するためであり、マイクロ流体デバイスの根本的な目的は、それらのチャネル内で流れを生じさせることにあります。したがって、この混合物の中には多くの気泡が含まれているため、両方のシリコンウェハーの上にこの混合物を

a-microfluidic-device-with-groove-patterns-for-studying-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

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出典: Scheidweiler, D., 他 流体装置と顕微鏡、フローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを超えた多孔質培地内の微生物輸送を研究すること。 J. Vis.

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学ぼう、溝パターンを用いたマイクロ流体デバイスの作製法と細胞捕獲技術。低せん断応力環境で細胞ドッキングを実現し、細胞間相互作用と細胞挙動の研究に応用する方法を解説します。

細胞挙動を研究するための溝パターンを用いたマイクロ流体デバイス

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