Name: 細胞挙動を研究するための溝パターンを用いたマイクロ流体デバイス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: 学ぼう、溝パターンを用いたマイクロ流体デバイスの作製法と細胞捕獲技術。低せん断応力環境で細胞ドッキングを実現し、細胞間相互作用と細胞挙動の研究に応用する方法を解説します。

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マイクロ流体デバイスのA.の微細加工<ol><li> 4インチSiウエハーは、活性酸素プラズマ（30W、Harrick科学、NYで5分）で処理される。 </li><li>ネガ型フォトレジスト（SU - 8 2015、マイクロケム、MA）は、Siウエハ上に1分間900rpmでスピンコートです。 </li><li>ウェハは、ソフトは95で焼成° Cのホットプレート上で6分とマイクロチャネルを含むマスク膜を介して4分間UVライト（200W）にさらされている。 </li><li>ウェハは、95で焼成した後℃で6分間であり、SU - 8フォトレジストの現像剤を使用して開発されています。 </li><li>マイクロチャネルを含むフォトレジストパターン付きウェーハは、ペトリ皿に配置されます。 </li><li>ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）（Sylgard 184）金型は、混合シリコーンエラストマーと硬化剤（10:1比）によって製造される。 </li><li> PDMSの混合物は、Siマスターモールドに注ぎ、気泡を除去するため真空デシケーターに配置されます。 </li><li> PDMSは、1〜2時間、70℃で硬化させる。 </li><li> PDMSモールドは、その後のSiマスターモールドから剥離されています。 </li></ol> b.デバイスの組み立て<ol><li> 40μmの厚さのトップ流体チャネルと40μm厚の底microgroovedチャンネル（25、50、75、および100μメートル、幅）は、二つの異なるSiのマスター金型から取得されます。 </li><li>流体デバイスのチャネル入口と出口がパンチされています。 </li><li>流体チャンネルとマイクログルーブのチャンネルが不可逆的に活性酸素をプラズマ（30W、Harrick科学、NYで5分）によって接合される。 </li><li>細胞外マトリックス（ECM）（すなわちフィブロネクチンは）インキュベーターで1時間（37℃）のためにマイクロ流体デバイスの内部にコーティングされています。 </li></ol> C.細胞播種と実験<ol><li> NIH - 3T3マウス線維芽細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダ​​ルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を用いて組織培養フラスコで培養されています。 </li><li>細胞はトリプシン処理し、解離する。 </li><li>解離細胞を3の細胞密度× 10 6細胞/ ml（図1）におけるマイクログルーブのチャンネルにロードされます。 <img src="/files/ftp_upload/old/270_2008_8_24_3/270_Figure-01.png" alt="図1" width="191" height="300" /> 図1 </li><li> 2 mLのメディア、100mMのH 2 O 2、およびアポトーシスアッセイ（20μLのアネキシンVと40μLヨウ化プロピジウム、Invitrogen社、カリフォルニア州）は、シリンジポンプ（1μL/分）を使用してチャネルに注入されています。 </li><li>細胞は倒立顕微鏡（ニコンTE 2000）を使用して監視し、リアルタイムです。 </li></ol>

<ol><li>Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+microfluidic-vacuum+device+for+interfacing+with+conventional+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform.</a> BMC Biotechnol. 7, (2007).</li>
<li>Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+docking+inside+microwells+within+reversibly+sealed+microfluidic+channels+for+fabricating+multiphenotype+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays.</a> Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).</li>
<li>Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+analysis+of+hydrogen+peroxide-induced+cell+death+in+primary+neuronal+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture.</a> Neuroscience. 67, 921-932 (1995).</li>
</ol>

細胞は、マイクロ流体デバイスでmicrogrooved基板内に固定し、パターン化された。過酸化水素に曝露された細胞のアポトーシスの過程をリアルタイムで観察し、アネキシンVとヨウ化プロピジウムを用いて分析した。従って、マイクログルーブのチャンネルを含むこのマイクロ流体デバイスは、ハイスループット薬物スクリーニングのための役に立つかもしれません。

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>試薬</td><td>K.R. Anderson Co.</td><td>2065622</td><td>ポリジメチルシロキサン、Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>培地</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Media </td></tr><tr><td>FBS</td><td>血清</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>ウシ胎児血清</td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>アポトーシスアッセイ</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>V13242</td><td>Annexin A、プロピジウムヨード</td></tr><tr><td>ネガ型フォトレジスト</td><td></td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 2015</td><td></td></tr><tr><td>Siウェハー</td><td>器具</td><td></td><td></td><td>4 inch シリコンウェハー</td></tr><tr><td>反応性酸素プラズマ</td><td>試薬</td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td></td><td>ウェハーを30Wで5 min処理</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>器具</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞挙動を研究するための溝パターンを用いたマイクロ流体デバイス

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

我々は、細胞の挙動を調べるためにmicrogroovedパターンを持つマイクロ流体デバイスを説明します。このマイクロ流体プラットフォームは、トップ流体チャネルおよび底microgrooved基板で構成されています。 microgroovedチャンネルを作製するために、マイクロ流体チャネルの印象を含む最上位ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）金型が整列しmicrogrooved基板に結合した。このデバイスを使用して、マウスの線維芽細胞は固定化とパターン化microgrooved基板内（25、50、75、および100μm幅）された。マイクロ流体デバイスのアポトーシスを研究するために、過酸化水素、アネキシンV、およびヨウ化プロピジウムを含むメディアは、2時間流路に灌流した。我々は酸化ストレスに曝された細胞がアポトーシスになったことがわかった。これらのアポトーシス細胞は、アポトーシスの過程で、原形質膜の外葉でホスファチジルセリンに結合することがアネキシンVにより確認した。 microgroovedパターンでこのマイクロ流体デバイスを用いて、アポトーシスのプロセスは、リアルタイムで観察し、インキュベーションチャンバー（37℃、5％CO 2）を含む倒立顕微鏡を用いて分析した。したがって、microgrooved基板が組み込まれたこのマイクロ流体デバイスは、細胞挙動を研究し、ハイスループット薬剤スクリーニングを行うために有用である可能性があります。

我々は、細胞の捕獲と文化を可能にすることができるマイクロ流体デバイスの作製のためのプロトコルについて説明します。このアプローチではこのようなマイクロ流体チャネル内の溝のようなパターン化された微細構造は、セルがドッキングすることができる内に低せん断応力領域を作成するために使用されています。

細胞挙動を研究するためのマイクログルーブパターンを備えたマイクロ流体デバイスについて記述します。このマイクロ流体プラットフォームは、上部の流体チャネルから構成され、...

私はJiangです。ハーバード大学とMITの健康・科学・技術分野のポスターフェローを務めています。この研究室での私の専門性は、細胞挙動を研究するための新規なマイクロ流体デバイスを開発することです。非常に斬新なグラジエントデバイスの作製だけでなく、それらを統合したマイクロ流体デバイスの開発も行っています。TCデバイスを用いることで、細胞間相互作用や細胞同士の相互作用、さらには細胞と細胞外マトリックスの接触を精密に制御することが可能です。したがって、TCシステムを利用することで、基礎的な細胞生物学の理解を深めると同時に、発生生物学や幹細胞バイオエンジニアリングへの応用研究を行うことができます。私はAmir Manchiです。ハーバード大学・MITヘルスサイエンス・テクノロジー部門のProfessor Haan研究室に所属する学部生です。私はマイクロ流体デバイスの研究に取り組んでおり、細胞培養や毒性試験などのさまざまな研究において、マイクロ流体デバイスが非常に有用なツールとなり得ることを原理実証として示そうとしてきました。また、流量、形状、およびその他のさまざまなパラメータに応じて、これらのデバイス内部の流体特性を研究し、最適化する試みも行っています。現在はマイクロファブリケーションルームから開始しており、ここで行うのはマイクロ流体デバイスの作製です。マイクロ流体デバイスを実現するためには、シリコンウェーハのパターンと、その上に配置するPDMSモールドが必要です。このPDMSポリマーは、実際には2つの異なる物質の混合物です。これはシリコンエラストマーベースとシリコンエラストマー硬化剤の混合物です。これら2つの混合比率は10対1とし、ベース10に対して硬化剤を1の割合で混合します。ここでは、ベースを約20g用意します。また、硬化剤を2g必要としますが、硬化剤は密度がはるかに低いため、流出速度がかなり速くなります。そのため、少し注意して操作する必要があります。現在、温度は約22°Cであり、これからベース剤と硬化剤を混合します。そこで、パイエットを使用してこれを行います。できるだけ均一に混ざるように十分に撹拌します。このPDMSポリマーを、表面にパターンが形成されたシリコンウェハーの上に注ぎます。シリコンウェハーによって、PDMSモールドにパターンが転写されます。ここには2枚のシリコンウェハーがあるのがわかるかと思いますが、その理由は、1枚がマイクロ流体デバイスの上層用で、もう1枚が下層用であるためです。マイクロ流体デバイスに2つの層が必要なのは、内部にチャネルを形成するためであり、マイクロ流体デバイスの根本的な目的は、それらのチャネル内で流れを生じさせることにあります。したがって、この混合物の中には多くの気泡が含まれているため、両方のシリコンウェハーの上にこの混合物を注ぐ必要があります。これらの気泡を取り除くため、真空ポンプを用いて脱泡を行います。メインの研究室エリアに戻りました。先ほどお伝えした通り、PDMS混合物の中には多くの気泡が含まれているため、これを除去する必要があります。真空チャンバー内のシリコンウェハーの上に混合物を配置します。チャンバーを閉じて真空引きを行い、その後、PDMSモールドをオーバーナイトでオーブンに入れ、硬化させます。それでは、研究室にてマイクロ流体デバイスの組み立てを行います。まず、一晩インキュベーターに入れてシリコンウェーハ上のパターンを形成させたPDMSモールドを用意します。ここでは2種類の異なるパターンを使用します。左側にあるのが上層となるマイクロチャネルで、右側にある緑色のラインパターンが下層となるものです。これにより、マイクロデバイス内部に溝が形成されます。まず、最上層がシリコンウェハーから容易に剥離できるように、これらのゲルをカットします。その後、パターンが上を向くように、シャーレにフェイスアップの状態で転写します。同様の手順を、緑色の線状パターンである溝に対しても行います。これらが最下層を形成することになります。ゲルの切り出しが終わったら、ペトリ皿に転写し、パターンの上に埃が付着するのを防ぐため、テープで固定します。次のステップは、細胞と培地を流入・流出させるために、チャネルの両端に穴を開けることです。表面が広く、自分ではパターンが見えないため、こちらを使用してチャネルを確認し、両端に穴を開けます。片側には余裕を持たせるため大きなパンチで穴を開け、もう一方の側にはポリエチレンチューブを使用できるよう小さな穴を開けます。現在はマイクロファブリケーション室におり、次のステップでは、用意した2つの異なる表面を接合します。そのために、プラズマクリーナーと呼ばれるこの装置を使用し、プラズマ処理という工程を行います。このチャンバー内ではプラズマ環境が形成され、プラズマが表面と相互作用することで、表面の弱い結合が切断され、それに代わって反応性の高い化学基が導入されます。それでは、ここから、防塵のために貼っていたテープを取り除き、これらの型をチャンバー内に入れます。ドアを完全に閉め、まず電源を入れ、次にポンプを起動させれば準備完了です。5〜10分後に続きを確認しましょう。次に装置を停止させます。ポンプと電源を切り、チャンバーを開けます。内部が負圧になっているため、音が聞こえるかもしれません。負圧によるものですので、ゆっくりとモールドを取り出します。両方のパターンの表面を上にした状態ですので、下層を左手に持ち、上層を反転させて溝の上に重ね、2つの層を押し付けます。このプラズマ処理装置を使用する利点は、接着強度と永続性にあります。ここで見ていただくと、上層のチャネルと下層の溝パターンが確認でき、次のステップに進む準備が整ったことがわかります。次に、この培養室と培養液を用意し、ディッシュの蓋を開けます。そして、フィブロネクチンを注入します。フィブロネクチンを60 µL取り出し、デバイスに注入してください。その後、デバイス内に流れを発生させてチャネル内部に薄くコーティングさせるため、出口側をゆっくりと吸引します。その後、このデバイスをインキュベーターに入れます。1時間の冷却後、インキュベーター内で振動させます。インキュベーターからサンプルを取り出し、3本のファイバーブラシを用いて分散させ、シェーディングを行います。次に培地を加え、セルカウンターを使用して細胞数を計測します。通常、デバイス内に100万個の細胞を配置します。解離後、洗浄液を数回押し出し、細胞懸濁液を回収してチャネル内部に導入します。細胞をチャネル内に効率よく導入するには、アスピレーターを用いて緩やかに流してください。上清培地と表面懸濁液を流出口から吸引することで、通常、選択的にグローバルチャネルへ細胞を播種します。その後、装置を分解してインキュベーターに1時間置き、細胞がチャネル内で完全に広がった状態にします。そして、Annexin V、プロピジウム・ヨージド、および過酸化水素を注入します。次に、時間仮説アッセイを実施します。組織培養液中のサンプルを採取し、2 mLのDMEM培地、20 µLのAnnexin V、40 µLのプロピジウム・アイオダイド、および100 mMの過酸化水素を用いて溶液を調製します。そして、Annexin V、プロピジウム・アイオダイド、過酸化水素を含む2 mLの培地を準備し、その後にシリンジで注入します。2 mLの培地と、アネキシンV、プロピジウムヨード、ハイドロペルオキシドを入れます。溶液をシールの中に注入し、気泡を除去してからC-Bearを接続します。これはガス密閉型のHamilton Warm Millシールです。こちらは3本あります。こちらは使い捨ての天井用カバーです。こちらは27ゲージの針です。これはPE 20ポリチューブです。シリンジに溶液を充填した後、何度か押し出し、その後シリンジを軽く叩いて気泡を取り除き、溶液を吸い上げます。もう一度、完全に押し出して気泡を取り除き、その後、再び緩やかに充填してください。1回分の溶液を取り、バルブを切り替えます。3方バルブを通して溶液を押し出し、チューブ内に完全に満たします。最終的に溶液がチューブの先端から出てきたら、チューブをマイクロデバイスに接続し、1 µL/minで注入を開始します。

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Biology

生物学

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