Name: エンジニアリングフィブリンベースの組織の筋線維芽細胞と制約の適用からの構築と細胞とコラーゲン（再）組織を誘導するためにひずみ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-28T21:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 学ぶフィブリンゲルを用いた細胞・コラーゲン再構成のリアルタイム解析法。筋線維芽細胞を含む構築体に静的・周期的ひずみを適用し、共焦点顕微鏡で組織工学における動態を可視化する。

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本研究では、生体材料（BMM）研究所の研究プログラムで実施した。 BMMは、経済情勢、農業イノベーションのオランダの省cofundedされています。 NederlandseのHartstichtingの財政的貢献は感謝して承諾されます。

1。ヒト伏在静脈細胞の培養<ol><li> 9。シュネルらのプロトコールに従って、二次利用の材料のためのガイドラインに従ったドナーから取得した伏在静脈マグナから細胞を分離し、液体窒素中で、これらを保存する。 6ウェルプレートでの培養に2×2mmの1ドナー切断片から伏在静脈マグナの一部から。ウェルあたり2枚を使用してください。一般に十分な細胞を液体窒素中で0.25×10 6細胞を約3バイアルを充填するために得ることができる。 HVSCsはビメンチン、デスミンの発現およびα平滑筋アクチン10を表現する集団の発現を示すことによって、筋線維芽細胞として特徴付けられる。次に進む細胞数を増加させる液体窒素から細胞を解凍するためのプロトコルを開始する。 </li><li> T75組織培養フラスコに1バイアルからの細胞を配置し、アドバンストDMEM 50mlのウシ胎児血清（FBS）、5 mlのペニシリン/からなる増殖培地（GM）を加えるストレプトマイシン5mlのL-グルタマックス。 2〜3日ごとに培地を変更します。 </li><li>細胞は約14日後にコンフルエントに成長。継代1と呼ばれる液体窒素で1バイアルに保管0.5×10 6細胞、。 </li></ol> 注：細胞の凍結がHVSCsを収穫するときには必要ありませんが、もっぱら貯蔵のために使用されます。 <ol start="4"><li> T175組織培養フラスコに1バイアルからHVSCsを置き、GMを追加します。 2〜3日ごとに培地を変更します。細胞は約7日後にコンフルエントに成長。液体窒素で1バイアルに保管3×10 6個の細胞、通路2と呼ばれる。 </li><li> rollerbottleに1バイアルから細胞を配置し、GMを追加します。 2〜3日ごとに培地を変更します。細胞が約8日後にコンフルエントに成長。 One rollerbottleは約20〜30×10 6個の細胞が含まれています。通路6に培養細胞まで。細胞表現型が変化するかもしれないので、通路9よりも高く、通路のセルを使用しないでください。 </li></oL&gt; 2。フィブリンベースの組織構築のエンジニアリング<ol><li>硬化剤（10:1）とエラストマーとを混合することにより、シリコーン接着剤を準備します。ベルクロの7×3mmの長方形のセグメントをカットします。クロスを形成する、とベルクロストリップ間3mmの二乗のスペースを残して柔軟性のある膜を有する6ウェル培養プレートに接着剤はベルクロ、。 </li></ol> 注：のみベルクロのソフト面を使用し、この面を上に直面しています。とき接着ベルクロは、唯一のシリコーン接着剤でベルクロをカバー、うまく全体にのりを広げません。培養プレートは、シリコーン膜底を持っているので、プレートに簡単に接着を確保するために、柔軟性のある膜を補強するためのウェルプレートの下に何かを使用しています。 <ol start="2"><li>接着剤の硬化を保証するために60°Cのオーブンで一晩シリコーン接着剤を乾燥させる。 30分間インキュベートし、ウェルに70％エタノールを加えることによって滅菌する。 PBSで3回すすぎ、WELからすべてのPBSを削除lsコマンドとベルクロ。 30分間UV下に置き、使用するまで無菌に保つ。 </li><li>ティッシュエンジニアリングのGMから成る培地（TM）、およびL-アスコルビン酸2 - リン酸の130mgのを準備します。 </li><li> TMに1 mg / mlのε-アミノカプロン酸（ACA）を追加します。 ACAは、分解11からフィブリンを防止するために、培養の最初の7日間に使用される。あるいは、アプロチニンを使用することができる。 </li><li>塊の形成を防ぐために、フィブリノゲン、開口前に室温に到達させる。塊のフィブリノゲンことなく、より簡単に溶解します。 ACAを補っ10mgを実際タンパク質/ mlのTM 7の濃度にフィブリノゲンを溶かす。無菌フィルターフィブリノゲン溶液、複数のフィルタが必要になることがあります。使用するまで氷上に保管してください。 </li></ol> 注：あまりにも多くの泡の形成を防止するために優しくフィブリノゲン混合物を溶解する。 <ol start="6"><li> ACAを補った10 IU / mlのTM 7の濃度にトロンビンを溶かす。使用するまで氷上に保管してください。 </li> &lt;/ OL&gt; 注：氷上のストレージがトロンビンとフィブリノゲンの早期ゲル化を防ぐために必要とされる。 <ol start="7"><li> GMとカウントに再懸濁した細胞を、トリプシン処理。 </li><li>フィブリンベースの組織構造（組織工学心臓弁7のための方法に基づいて濃度）を播種するための15×10 6細胞/ mlを使用してください。シングルゲルは100μlのGOFエル、したがって1.5×10 6個の細胞で構成されています。説明するゲルの数と同数の遠心管をもたらす、ある遠心管に1.5×10 6細胞を入れた。 </li><li> 7分間350 xgで細胞を遠心し、上清を捨てる。 50μlのトロンビンで細胞を再懸濁します。この懸濁液に青色蛍光ポリスチレン微小球の4μLを加える。バイアルにフィブリノゲン液50μlを入れて。細胞を50μlのトロンビンを取るためにピペットを使用してください。 100μlにピペットの容積を大きくします。トロンビン50μlの溶液とをピペットトロンビンおよびフィブリノゲンを混ぜ、そして100μlの混合物を取るためにフィブリノゲンとバイアルへの細胞。 </li></ol> 注 ：蛍光ポリスチレン微小球は、画像解析のための内部基準マーカとして使用される。トロンビンおよびフィブリノゲンを混合する際に、注意深く混合物をピペットで気泡の形成を防止する。気泡がフィブリンゲルの穴になります。 <ol start="10"><li>へとベルクロストリップ間にゲル混合物をピペット。フィブリンゲルの典型的なゲル化時間は、一度成分が混合され、20秒程度である。 </li></ol> 注 ：混合物をウェルプレートにピペットれる前にゲル化を防ぐために、できるだけ早くこれを行います。細胞やビーズを使用する前に練習。 <ol start="11"><li> ACAで培養TMを追加する前にゲル化を可能にするために加湿95％空気/ 5％CO 2インキュベーター内で37℃で30分間懸濁液をインキュベート。 </li><li>最初の7日ごとに2〜3日は、ACAとTMを交換してください。ゲルはACAずに培養することが、一週間後には十分安定している。最初の週の後2〜3日ごとにTMを交換してください。ウェルあたりTM 6mlのを追加します。当日12細胞が可視化のために十分なコラーゲンを作り出した。 </li></ol> 3。ひずみと制約のひずみと誘導の変更の適用<ol><li>静的株は、細胞トラクションとコンパクション12により直接細胞によって適用される。コラーゲン再編を誘導するために、組織が一つの方向に2つのベルクロストリップから緩い構築カット。一方向の制約この結果（ 図1A）。構文はその後安定した十分で、コラーゲンが堆積されているので、12日目でこれを実行します。 </li><li>のFlexCell FX4000Tシステムを用いて、可撓膜と培養プレートの底部に真空を適用することにより、環状歪みを適用する。番目の一部であるローディングポスト（の上に、ベースプレートにプレートを置きます電子環状ローディング装置）。ポンプは膜に真空を適用することにより、下に横たわっている長方形のポストを介して膜を引っ張る。メンブレン（ベルクロを介して）組織構造の十字形添付ファイルや長方形のポストのために、適用された環状株は（ 図1B）一軸です。 </li><li>当初、巡回ひずみの適用は6日目に開始する前に、初期の機械的完全性を達成するために5日間静置培養を使用しています。真空ポンプ用のコントローラにプログラムは、環状染色プロトコル。例えば一軸方向13で、以前に確立された断続的な巡回ひずみプロトコルを使用します。これは3時間休憩期間と交互に3時間の期間の0〜5％の株からいきみ1Hzの正弦波、、、の断続的な歪みから構成されています。整列コラーゲン組織を誘導、7日間この巡回ひずみプロトコルを実行します。 </li><li>一般的に12日後にHVSCs、整列コラーゲンorganizatioを作り出したN。整列コラーゲン組織に到達した後、元の歪みの方向に対して垂直になるように、一軸環状歪み方向を変える。 90°長方形のポストを回してこれを行います。 </li></ol> 4。可視セルとコラーゲン<ol><li>細胞生存率またはコラーゲン形成を妨害しないプローブでアクティブなリアルタイムコラーゲンリモデリング、ラベルサンプルを可視化する。蛍光細胞質とコラーゲンを染色するためのプローブを使用します。 </li><li>共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて或いは第二高調波発生は、780 nmおよび500〜550 nmの検出で励起し自家蛍光14を用いて、コラーゲン構造を可視化するために使用することができる。 </li><li> 3時間の休息期間中に周期的に緊張したサンプルについては、セットアップとインキュベーターから培養プレートを外し、細胞やコラーゲンを可視化するために共焦点レーザー走査顕微鏡にそれらを転送します。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

細胞移入フィブリン構築物の記載モデル系は、細胞およびコラーゲンの研究のための大きな可能性を秘めている（再）組織（デ·ヨンゲら 15）、組織工学の目的で使用されるなど 。最初の細胞担体としてフィブリンを用いて、フィブリン分解した後、組織、細胞および内因性マトリックスのみを使用して作成される。この方法では、細胞は、境界剛性12、又は表示歪み回避を感知16,17の収縮力を印加することによって、本質的に静的または環状のいずれかの歪みに反応するように刺激される。 意義：コラーゲン（再）組織18を勉強する前に、フィブリン構造が使用されているではなく、周期的な歪みおよび/ ​​を適用するか、この提示方法が可能であるどちらもタイムラプスの方法で構造体を研究する能力を持つ。このモデル系で制約を提供するベルクロストリップは、19の前に使用されているしかし、柔軟な膜を有する培養プレートでこの技術を組み合わせることで、長...

心血管組織が目立つ耐荷重機能を持っています。細胞外マトリックス中のコラーゲン線維の特定のコンテンツと、組織内の耐荷重特性に寄与し、全体的な組織強度1を支配する。組織工学において、構築物の機械的調整が使用されている-典型的には（環状）緊張レジメンから成る-組織組織と機械的性質2,3を向上させることができる。事前定義されたコラーゲンのアーキテクチャを持つ組織を作成するために複雑な組織ジオメトリのひずみ誘起コラーゲン組織の完全な理解は、まだ達成されていません。これは、開発組織におけるコラーゲンリモデリングの我々の限られた知識によるものである。既存のモデルは、主に静的なひずみ4-6の使用とコラーゲンリモデリングの最終的な正味の結果に関する情報を与える。ここでは、影響を受けて、3Dで、リアルタイムの方法でコラーゲン（再）組織の研究を可能にする高度にチューニングモデルシステムを提供静的または環状株の。組織構造は、構造内のすべてのコラーゲンが内因性であることを保証する、フィブリンベースです。コンストラクトの細胞とコラーゲン組織が可視化され、内部リファレンス·システムは、私たちが時間経過解析のための細胞とコラーゲン構造を再配置することができます。これらの細胞は基づいて強化された細胞外マトリックス産生およびエンジニアリング心血管組織7マトリックス、当社設立の使用を改造する能力で知られていますので、このプロトコルでは、人間の伏在静脈細胞（HVSCs）のためのモデルシステムの使用を説明します8デヨングらの作業に

<table><tbody><tr><td>培養プラスチック</td><td>グライナー</td><td></td><td>培養フラスコとピペットを含む</td></tr><tr><td>アドバンスドDMEM</td><td>ギブコ</td><td>12491</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>グライナー</td><td>758075</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>ギブコ</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>エラストマーと硬化剤</td><td>ダウコーニングコーポレーション</td><td>3097358-1004</td><td>Silastic MDX 4-4210#</td></tr><tr><td>Velcro</td><td>Regular store</td><td></td><td>あなたはこれを通常の店で購入することができます、ソフトサイドBioflex</td></tr><tr><td>培養プレート</td><td>Flexcell Int</td><td>BF-3001U</td><td>未処理</td></tr><tr><td>のL-アスコルビン酸2-ホスファターゼ</td><td>シグマ</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&epsilon;-アミノカプロン酸</td><td>シグマ-Aldrich</td><td>D7754</td><td></td></tr><tr><td>ウシトロンビン</td><td></td><td>Sigma T4648</td><td></td></tr><tr><td>ウシフィブリノーゲン</td><td></td><td>Sigma F8630</td><td></td></tr><tr><td>0.45 シリンジフィルター</td><td>Whatmann (Schleicher and Scheul)</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン マイクロスフェア</td><td>Invitrogen</td><td>F-8829</td><td>青色蛍光灯, 10 &mu;m径</td></tr><tr><td>Flexcell FX-4000T</td><td>Flexcell Int</td><td></td><td>長方形のローディングポストを含む</td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange</td><td>Invitrogen Molecular Probes</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>CNA35-OG488</td><td></td><td></td> アイ<td>ントホーフェン工科大学生物医学工学科高分子有機化学研究所が提供</td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>LSM 510 Meta レーザー走査型顕微鏡と Two-Photon-LSM モード</td></tr><tr><td>Amphotericin</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>細胞単離に必要</td></tr></tbody></table>

エンジニアリングフィブリンベースの組織の筋線維芽細胞と制約の適用からの構築と細胞とコラーゲン（再）組織を誘導するためにひずみ

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

コラーゲン組織の開発におけるコラーゲン含有量と組織を局所組織系統および組織制約によって影響され得る。ティッシュエンジニアは、あらかじめ定義されたコラーゲンアーキテクチャと組織を作成するために、これらの原則を使用することを目指します。しかしながら、最終的な組織構造を制御するためのコラーゲンリモデリングの正確な基礎プロセスの完全な理解が欠けている。具体的には、少しは、組織の機械的荷重条件の変化に応じてコラーゲン線維の（再）配向について知られている。私たちは、さらにコラーゲンを解明するために、二軸に制約の筋線維芽細胞シードフィブリン構造から成る、in vitroモデル系で開発された私に反応して（再）配向）一軸静的荷重条件及びiiに軸戻す）二軸に制約の巡回一軸負荷はのFlexCell FX4000Tローディング装置の使用と、方向をロードに変更前と後のコンストラクト。タイムラプス共焦点イメージングは​​viに使用されます非破壊的にコラーゲン（再）配向sualize。 コンストラクトの細胞とコラーゲン組織がリアルタイムで可視化することができ、内部リファレンス·システムは、私たちが時間経過解析のための細胞とコラーゲン構造を再配置することができます。モデル·システムの様々な態様は、細胞源又は健康と病気の細胞の使用のように、調整することができる。添加剤はさらに、例えばMMPの追加やインテグリンを遮断することによって、コラーゲンの再構築のメカニズムを解明するために使用することができる。構築物の形状や大きさを容易に細胞およびコラーゲン（再）組織を研究するための高度に調整可能なモデル系で、その結果、特定のニーズに適合させることができる。

このモデルシステムは、筋線維芽細胞培養シードフィブリンゲルが可能になります。 図1Aは、静的軸制約の下で最初の培養組織を示しています。組織制約は、（ 図1A）、その後、一軸静的な制約を作成するために、2つの制約からフィブリンゲルを切断し、そして組織成形および改造によって解放される。環状株について、組織は同様に静的な二軸制約の下で培養する。 5日後に環状単軸ひずみが（ 図1B）を適用することができる。コラーゲンの再配向を誘導するために、一軸歪み方向が垂直方向（ 図1B）に変更することができる。ゲル混合物とミクロスシードは、タイムラプスイメージング（ 図2）のために事前定義された場所を再配置するために使用され、ランダムなパターンを表示します。 図2Aおよび2C細胞、コラーゲンやビーズのイメージを示す。これらの同じ画像は3日（FIGURスキャンされ後で、それぞれ電子2B）と2...

このモデルシステムは、非破壊における内因性コラーゲン（再）組織実時間を研究するために使用することができる筋線維芽細胞にポピュレートフィブリンゲルから始まる。モデル系は、それが別のセルソース、媒体添加剤と共に使用することができるように、非常に可変であり、特定のニーズに容易に適合させることができる。

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

この手順の全体的な目的は、細胞およびコラーゲンの再編成を研究するために使用できるフィブリンベースの構築物を製作することです。まず、ドナー組織からヒト大伏在静脈細胞を単離し、培養して増殖させます。次に、柔軟なメンブレン上にベルクロストリップを接着させます。6ウェルプレートの底面に、コンストラクトを保持するための正方形の空間を作成します。次に、フィブリノゲン、トロンビン、細胞、および蛍光標識ビーズの混合物をベルクロストリップの間の空間に加え、重合させてゲルを形成させます。最終ステップとして、コンストラクトに一軸方向の周期的な歪みを加えるか、または静的歪みを解除することで、細胞をコンディショニングし、配向性マトリックスの形成を誘導します。ベルクロポストからフィブリンゲルを一定方向にトリミングすることで、最終的に、共焦点顕微鏡を用いてコンストラクトを経時的にモニタリングし、細胞およびコラーゲンの再編成の変化を記述する結果を得ることができます。この手法は、異なる細胞種によるコラーゲン形成と再配向の速度に関する、コラーゲンリモデリング分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。まず、材料の二次利用に関するガイドラインに従い、ヒトドナーの大伏在静脈から組織を採取します。次に、Schnellらのプロトコールに従って組織からヒト静脈伏在細胞（H VSCs）を単離し、液体窒素中に保存します。必要に応じて、250,000個の急速解凍済みH VSCsを含む1バイアルを、15 millilitersの予熱済み増殖培地が入ったT 75フラスコに移して細胞を拡大培養します。Advanced DMEM 440 mL、胎児牛血清 50 mL、100× Pen-Strep 5 mL、および 200 mM L-glutamax 5 mLからなる培地。細胞がコンフルエントになるまで、約2週間、2〜3日ごとに増殖培地を交換する。細胞がコンフルエントになったら、回収して継代し、パッセージ9まで維持します。計画している実験に十分な細胞数が得られるまでトリプシンを用いて継代を行ってください。各コンストラクトにつき、約1.5 million cellsが必要です。十分な数の細胞が培養されたら、コンフルエンスが90%に達した時点で回収し、成長培地を用いて1mLあたり1500万個の細胞密度で懸濁させます。使用するまで氷上に保持してください。エラストマーと硬化剤を10:1の比率で混合し、シリコン接着剤を調製します。この接着剤を使用して、ベルクロの柔らかい面から切り出した7 mm × 3 mmのストリップを、Flexcellプレートの柔軟なメンブレンに貼り付けます。中心が開いた十字型にするため、シリコン接着剤を60 °Cのオーブンで一晩乾燥させ、完全に硬化させます。その後、各ウェルに5 mLの70% ethanolを加え、室温で30分間インキュベートしてプレートを滅菌します。滅菌済みのPBSでウェル内を3回洗浄します。次に、ウェル内およびベルクロストリップからPBSを除去します。プレートに蓋をせず、表面を滅菌するために組織培養フードのUVランプの下に30分間置きます。完了したら、プレートに蓋をして、使用時まで無菌状態を維持します。次に、培養の最初の7日間に使用する組織工学用培地を調製するため、500 mLの増殖培地に130 mgのアリシンと2つのリン酸塩を加えます。また、フィブリンの分解を防ぐために1 mg/mLのε-アミノカプロン酸を添加し、アミノカプロン酸を補充した組織工学用培地の中で、穏やかに混合してフィブリノゲンを実際のタンパク質濃度として10 mg/mLになるまで溶解させます。次に、フィブリノゲン溶液を0.22 µmのシリンジフィルターでろ過して滅菌し、使用まで氷上で保存します。続いて、ストックのトロンビンを、アミノカプロン酸を添加した組織工学用培地で最終濃度10 international units/mLに希釈してトロンビン溶液を調製し、使用まで氷上で保存します。次に、作製する組織構築物ごとに、先に調製した細胞懸濁液を100 µLずつマイクロ遠心チューブに入れます。細胞を350 ×gで7分間遠心分離し、上清を捨てた後、細胞を50 µLのトロンビン溶液で再懸濁させ、内部参照マーカーとして使用する青色蛍光ポリスチレン微小球を4 µL加えます。続いて、フィブリノゲン溶液を50 µLピペットチップで吸い取ります。ピペットの量を100 µLに設定し、50 µLのフィブリノーゲン溶液を遠心チューブに分注します。トロンビンと細胞の混合液を用い、気泡の形成を防ぐため、100 µLの混合液を吸い上げてトロンビンとフィブリノーゲンを静かに混合します。溶液が十分に混合されたら、速やかにベルクロストラップの中およびストラップの間にゲル混合液を分注します。フィブリノーゲンゲルは混合後の典型的なゲル化時間が20秒程度であるためです。構築物を、加湿された5% CO2バッファーインキュベーター内で37 °Cで30分間インキュベートし、ゲル化させます。次に、アミノカプロン酸を含む組織工学培地を各ウェルに6 mLずつ加え、プレートをインキュベーターに戻します。最初の7日間は、2〜3日ごとに培地を交換してください。1週間後、培地からアミノカプロン酸サプリメントを除去し、組織工学培地でゲルの培養を継続します。培養開始後の5日間は、引き続き2〜3日ごとに培地を交換します。その後、静的伸展下で構成物を凝縮・再編成させ、コラーゲン繊維を形成させます。繊維の制約により、静的条件下でコラーゲンを単一方向に再編成させるため、二軸方向に負荷をかけます。まず、細胞をさらに1週間培養します。12日目に、2本のベルクロストリップから組織構成物を単一方向に切り離します。これにより、フィブリンが凝縮し、反対方向に伸展が生じます。あるいは、周期的な負荷を加える場合は、6日目にガスケットを備えたフレックスセルベースプレート上のローディングポストセットにプレートを配置します。ローディングポストがウェルのフレキシブルメンブレンを支持し、ポストの底部を下に引くことで、単一方向への歪みを発生させることができます。次に、構築物に周期的な歪みを加えるためのソフトウェアプロトコルを設定します。ここで示すプログラムは、正弦波に似た間欠的な歪みを加えるもので、0から5%strainまで1Hzで3時間負荷し、その後3時間の休息を交互に繰り返します。プログラムの準備が完了したら、真空ポンプの電源を入れ、プログラムを開始します。コントローラーがシステム内の真空度を調節し、サポートポスト周囲のメンブレンを牽引することで、プログラムに従って構築物に周期的な歪みを加えます。このプログラムを1週間実行し、2〜3日ごとに培地を交換してください。1週間のコンディショニング後、矩形ポストを90度回転させて歪みの方向を変え、3日間かけてコラーゲンの再編成を誘導します。コラーゲンのリアルタイムな再構成を可視化するために、CellTracker Orangeを添加します。細胞質を染色するため、4 µMの濃度で添加します。また、コラーゲン線維を可視化するため、1 µMの濃度のCNA 35 OG 4 88を添加します。これらのプローブは、細胞の生存能やコラーゲン形成に影響を与えません。その後、細胞を37°Cのインキュベーターで1時間インキュベートします。インキュベート後、培養プレートをインキュベーターから取り出し、共焦点レーザー走査顕微鏡へ運んで、細胞とコラーゲンを可視化します。ゲルの表面およびスキャフォールド内部の約60 µmまでの画像を撮影し、これらのレベルにおける組織化の変化を時系列で観察します。その後、プレートをインキュベーター内の機械的コンディショニング装置に戻します。刺激に対する細胞再編成の進行状況を追跡するため、この手順を数日おきに繰り返してください。重合前にフィブリノゲン混合液に添加した蛍光マイクロスフィアは、フィブリンネットワーク内に捕捉されるため、静止条件下で培養し4本のポストすべてに接着させた際に、異なる時点における同一領域の可視化を確実にするリファレンスマーカーとして有効に機能します。2本のファイバーポスト接続部をトリミングしてから3日後では、実際の線維や細胞の配向は見られません。収縮によって生じた一軸方向の歪みにより、緑色で示されるコラーゲン線維が整列しています。1週間にわたり単一方向で周期的に伸展させたヒト大伏在静脈細胞を、構築物の表面およびゲル内60 µmの深さで示しています。伸展方向を90度回転させたところ、3日後の細胞応答は、組織の中心部よりも表面でより迅速であることがわかりました。工学的な手法を習得すれば、これらのFIベースの組織構築物は約2時間で作成可能です。

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Bioengineering

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