エンジニアリングフィブリンベースの組織の筋線維芽細胞と制約の適用からの構築と細胞とコラーゲン（再）組織を誘導するためにひずみ

この手順の全体的な目標は、細胞とコラーゲンの再編成を研究するために使用できるフィブリンベースのコンストラクトを作成することです。これは、まずドナー組織からヒト静脈伏在細胞を単離し、それらを培養中で増殖させることによって達成されます。2番目のステップは、ベルクロストリップを柔軟なメンブレンに接着することです。

6つのウェルプレートの下部に、コンストラクトを保持する正方形のスペースを中央に作成します。次に、フィブリノーゲントロンビン細胞と蛍光標識ビーズの混合物をベルクロストリップ間の空間に加え、重合させてゲルを形成します。最後のステップは、細胞を調整し、コンストラクトに一軸周期ひずみを適用するか、静的ひずみを解放することにより、配向マトリックス形成を誘導することです。

ベルクロポストからフィブリンゲルを一方向にトリミングします。最終的には、共焦点顕微鏡を使用してコンストラクトを経時的にモニタリングすることにより、細胞およびコラーゲンの再編成の変化を説明する結果を得ることができます。この方法は、コラーゲンリモデリング分野における、異なる細胞タイプによるコラーゲンの形成速度と再配向の速度に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。

まず、材料の二次使用に関するガイドラインに従って、静脈saana magnaからヒトドナー組織を取得します。次に、Schnellらのプロトコルに従って、ヒト静脈伏在細胞またはH VSCを組織から単離し、それらを液体窒素に保存します。必要に応じて、250,000速解凍H VSCsを含む1つのバイアルを15ミリリットルの予熱成長を備えたT 75フラスコに入れて細胞を増殖させます。

440ミリリットルの高度なDMEMと50ミリリットルのウシ胎児血清からなる媒体。5ミリリットルの100 Xペン連鎖球菌と5ミリリットルの200ミリモルL過剰過剰症の最大。細胞がコンフルエントになるまで、約2週間、2〜3日ごとに増殖培地を交換します。

コンフルエントになったら、細胞を回収して分割し、継代します。9。計画された実験に十分な数の細胞が得られるまでトリプシンを使用します。各コンストラクトには約150万個の細胞が必要です。

十分な数の細胞が増殖したら、90%coの流暢さでそれらを回収し、細胞を1ミリリットルあたり1,500万個の細胞で増殖培地に懸濁します。必要になるまで氷の上に置きます。エラストマーと硬化剤を10対1の比率で混合して、シリコーン接着剤を調製します。

この接着剤を使用して、ベルクロの柔らかい面から引っかかった7ミリメートル×3ミリメートルのストリップをフレックスセルプレートの柔軟なメンブレンに取り付けます。中心が開いた十字型を形成するには、シリコン接着剤を摂氏60度のオーブンで一晩乾燥させ、接着剤が硬化することを確認します。次に、5ミリリットルの70%エタノールを各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートしてプレートを滅菌します。

滅菌PBSでウェルを3回すすぎます。次に、PBSをウェルとベルクロストリップから取り外します。蓋をしていないプレートを組織培養フードのUVランプの下に30分間置き、表面を滅菌します。

終了したら、プレートを覆い、使用するまで滅菌しておきます。次に、培養の最初の7日間に、130ミリグラムのアリン酸、2つのリン酸塩、500ミリリットルの成長培地を添加して、組織工学培地を調製します。また、フィブリンが分解するのを防ぐために、1ミリリットルあたり1ミリグラムのイプシロンアミノカプロン酸を添加し、フィブリノーゲンを1ミリリットルあたり10ミリグラムの実際のタンパク質の濃度に溶解し、組織工学的にアミノカプロン酸を添加して穏やかに混合する。

その後、滅菌します。0.22ミクロンのシリンジフィルターでフィブリノーゲン溶液をろ過し、使用するまで氷上に保存します。次に、アミノカプロン酸を添加した組織工学培地でストックトロンビンを最終濃度10国際単位/ミリリットルに希釈してトロンビン溶液を調製し、使用するまで氷上に保存します。

次に、100マイクロリットルの細胞懸濁液を、作製される各組織構築物用のマイクロ遠心チューブに調製します。細胞をGの350倍で7分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞をトロンビン溶液の50マイクロリットルに再懸濁し、内部参照マーカーとして使用する青色蛍光ポリスチレン微小球である4マイクロリットルを追加します。次に、50マイクロリットルのフィブリノーゲン溶液をピペットチップに吸い込みます。

ピペットの容量を100マイクロリットルに増やし、次に50マイクロリットルのフィブリノーゲン溶液を遠心分離チューブにピペットで移します。トロンビンと細胞の混合物で、100マイクロリットルの混合物を引き上げてトロンビンとフィブリノーゲンを穏やかに混合し、気泡の形成を防ぎます。溶液が完全に混合されたら、ゲル混合物をベルクロストリップにピペットで入れ、フィブリンゲルの典型的なジェリアン時間として迅速に、混合したら20秒のオーダーで、加湿された5%二酸化炭素緩衝インキュベーターで摂氏37度で30分間コンストラクトをインキュベートしますそれらをゲル化します。

次に、アミノカプロン酸を含む6ミリリットルの組織工学培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。最初の 7 日間は 2 日から 3 日ごとにメディアを交換します。1週間後、アミノカプロン酸サプリメントを培地から取り出し、組織工学培地でゲルの培養を続けます。

培養の最初の5日間で2〜3日ごとにそれを交換することで、静的なひずみの下で構築物を圧縮し、コラーゲン繊維を形成するために、繊維の制約により二軸方向に静的条件下でコラーゲンの再編成を誘発することができます。まず、12日目に細胞をさらに1週間培養し、組織構築物を2つのベルクロストリップから一方向に緩めて切断します。これにより、フィブリンが圧縮されるのとは反対方向にひずみが発生します。

あるいは、周期的なローディングのために、フレックスセルベースプレートのローディングポストのセットの上にプレートを置き、6日目にガスケットを装備すると、ローディングポストはウェルの柔軟な膜を支え、ポストのベースを引き下げて一方向にひずみを発生させることができます。次に、コンストラクトに周期ひずみを適用するためのソフトウェアプロトコルを設定します。ここに示すプログラムは、正弦波に似た断続的なひずみ用で、1ヘルツで0から5%のひずみまで3時間、3時間の休止と交互にコンストラクトを濾します。

プログラムの準備ができたら、真空ポンプの電源を入れてプログラムを開始します。コントローラーは、システム内の真空強度を調整し、サポートポストの周りの膜を引き下げて、プログラムに従ってコンストラクトに周期的なひずみを加えます。1週間のコンディショニングの後、2〜3日ごとにメディアを交換するように注意しながら1週間プログラムを実行し、長方形のポストを90度回転させて3日間ひずみの方向を変えることでコラーゲンの再編成を誘発します。

アクティブなリアルタイムのコラーゲンリモデリングを視覚化するには、セルトラッカーオレンジを追加します。細胞質とCNA 35 OG 4 88を染色するために4マイクロモルの濃度を添加します。1マイクロモルの濃度を添加して、コラーゲン繊維を視覚化します。

これらのプローブは、細胞の生存率やコラーゲン形成を妨げません。次に、細胞をインキュベーター内で摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、培養プレートをインキュベーターから取り出し、共焦点レーザー走査型顕微鏡に運び、細胞とコラーゲンを視覚化します。

表面のゲルと足場の最大約60ミクロンのゲルを撮影して、これらのレベルでの組織化の経時変化を確認します。次に、プレートをインキュベーター内の機械的調整セットアップに戻します。この手順を数日ごとに繰り返して、刺激に応答した細胞再編成の進行状況を追跡します。

重合前にフィブリノーゲン混合物に添加された蛍光マイクロスフェアは、フィブリンネットワークに閉じ込められ、静的条件下で培養し、4つのポストすべてに付着すると、異なる時点で同じ領域を可視化するための参照マーカーとしてうまく機能します。ファイバーポスト接続の2つをトリミングしてから3日後には、実際のファイバーまたはセルラーの向きは確認できません。収縮によって引き起こされる一軸ひずみは、緑色で示されたコラーゲン繊維を整列させました。

1週間にわたって一方向に周期的に濾過されたヒト静脈伏在細胞が、ここではコンストラクトの表面とゲルの60ミクロンに示されています。ひずみの向きを90度回転させると、3日後の細胞応答は、組織のコアよりも表面で速いことがわかりました。エンジニアリングを習得すると、これらのFIベースの組織構築物は約2時間で実行できます。