Nailfold Capillaroscopyを使用して、毛細血管密度の定量のための再現性のコンピュータ化された方法

この手順の全体的な目的は、爪のクチクラ直下の皮膚領域における1平方ミリメートルあたりの毛細血管数を定量化することです。まず、クチクラ下の爪床のモノクロ写真を撮影します。次に、その画像をコンピュータの画像解析プログラムに取り込みます。

次に、画像を処理します。毛細血管をより詳細に可視化するため、最終ステップとして、1平方ミリメートル内のすべての毛細血管を特定し、計数します。最終的に、画像処理を用いて個人の毛細血管の量と形態を示します。この手法は、高血圧や糖尿病、その他の疾患が微小循環にどのような影響を及ぼすかなど、心血管分野における重要な疑問の解明に役立ちます。

モノクロデジタルカメラを使用し、既述の方法で毛細血管の画像を取得します。次に、毛細血管の画像取得に使用したものと同じカメラおよび倍率の撮像条件下で、ミリメートル目盛りのある定規の校正用画像を撮影します。定規の画像をコンピュータ画像解析プログラムに取り込み、定規の写真上の1 mmの線におけるピクセル数を測定します。

この数値を書き留め、1 mm × 1 mm の領域に含まれるピクセル数を算出します。次に、毛細血管画像のいずれかを開き、最適適合ヒストグラムを用いて画像を調整することで、毛細血管を暗くし、背景を明るくします。その後、ドロップダウンメニューの ROI 作成コマンドを使用して、画面上部に 1 mm × 1 mm の関心領域（ROI）を作成します。

関心領域をドラッグして、毛細血管ループが最も鮮明な位置に配置します。毛細血管ループの頂点が、関心領域の最上部に位置するように配置してください。このプロトコルにおけるこのステップの再現性と標準化の鍵は、1 $\text{mm}^2$ の関心領域ボックスを適切に配置することにあります。

標準化を維持するための目安は、ボックスを画像の毛細血管ループの頂点または先端に配置することです。正しく配置したら、ROIをクリックし、表示されるドロップダウンメニューから「crop（切り抜き）」をクリックします。次に、画像をフラット化し、以降のすべての画像調整が画像全体に均等に適用されるようにします。次に、毛細血管が最大限に可視化されるよう、画像のコントラストを75まで上げます。

また、毛細血管の輪郭を滑らかにするために、画像のデスペックル処理を行います。ヒストグラムを最適なモデルに調整して画像のコントラストを最終決定し、毛細血管が黒く、背景が白くなるようにします。各画像において、プログラムによってカウントされるべきオブジェクトとして認識させるため、「target object」機能を用いて、輪郭が明確な毛細血管の一部を手動で選択します。

次に、背景機能を使用して背景のごく一部を選択し、カウントアルゴリズムで除外する必要がある領域のリファレンスとして設定します。背景ノイズを毛細血管としてカウントすることを避けるため、カウント対象のオブジェクトの最小直径を5ピクセルに設定します。その後、カウント機能を用いて、個体ごとの画像内のすべての毛細血管を即座にカウントします。

より信頼性の高い評価を得るために、3枚から4枚の画像の平均値を算出します。時間を節約するため、マクロを作成して、1枚または複数枚の画像に対して特定の処理シーケンスを自動的に実行させます。まず、「record macro」を選択し、このビデオで説明する手順と処理に基づいてマクロに名前を付けます。その後、マクロの記録中に画像操作の手順を実行します。

今後の画像にこのマクロを使用する場合は、「run macro」をクリックするだけで、プログラムが記録された補正を目的の画像に自動的に適用します。ユーザーの入力が必要な唯一のステップは、画像のクロップ範囲の選択です。最適に処理された画像であれば、30秒以内にカウントが可能であり、背景と毛細血管、および個々の毛細血管同士を明確に区別できます。

最終的に補正された画像がここに示されています。この画像で決定された総計は、習得後、1平方ミリメートルあたり54本の毛細血管でした。この手法を用いれば、20分以内に12枚の画像を定量化および処理することが可能です。