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ミ コバクテリウム・アブセプサスに感染したゼブラフィッシュ胚を考えてみましょう。マイコバクテリウム・アブセプスは中枢神経系を標的とし、細菌や宿主免疫細胞を含む膿瘍を形成します。
胚を氷で孵化して固定し、その後麻酔薬を過剰投与して心臓や神経活動を止め、死に至らせる。
残留麻酔を取り除くために胚を洗浄してください。
洗剤溶液を加えて細胞膜を破壊し、胚を溶解します。
溶解液を針で切って組織を均質化し、細菌を放出します。
遠心分離機で上清液を捨て、細菌の凝集を防ぐために界面活性剤溶液に再懸浮させます。
細菌の懸濁液を連続的に希釈し、寒天プレートに広げます。
培地には抗生物質が補われ、抗生物質耐性を持つ マイコバクテリウム 細胞が増殖する間、他の微生物の増殖を抑制します。
培養することでコロニー形成を促進し、胚の細菌負荷を定量化することが可能になります。
所望の時点でコロニー形成単位(CFU)を列挙するには、感染状態ごとに5個の胚を採取し、それぞれの胚を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移します。胚を氷で10分間培養して凍結麻酔します。胚を300〜500ミリグラム/リットルのトリカインで安楽死させた後、滅菌水を使って新しいチューブで胚を2回洗浄します。
次に、各胚に2%のトリトンX-100を1×PBSで除去し、26ゲージの針で組織を均質化して完全な溶解を行います。
サスペンションを遠心分離した後、1×PBSTを使ってペレットを再懸浮させます。次に、Middlebrook 7H10OADC の均質酸塩のプレートシリアル希釈を、BBL MGIT PANTAを補足しました。
プレートは30度Cで4日間孵化してからコロニーを数えます。