ゼブラフィッシュ胚からの細菌の単離および培養による感染負荷の評価

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コバクテリウム・アブセプサスに感染したゼブラフィッシュ胚を考えてみましょう。マイコバクテリウム・アブセプスは中枢神経系を標的とし、細菌や宿主免疫細胞を含む膿瘍を形成します。

胚を氷で孵化して固定し、その後麻酔薬を過剰投与して心臓や神経活動を止め、死に至らせる。

残留麻酔を取り除くために胚を洗浄してください。

洗剤溶液を加えて細胞膜を破壊し、胚を溶解します。

溶解液を針で切って組織を均質化し、細菌を放出します。

遠心分離機で上清液を捨て、細菌の凝集を防ぐために界面活性剤溶液に再懸浮させます。

細菌の懸濁液を連続的に希釈し、寒天プレートに広げます。

培地には抗生物質が補われ、抗生物質耐性を持つ マイコバクテリウム 細胞が増殖する間、他の微生物の増殖を抑制します。

培養することでコロニー形成を促進し、胚の細菌負荷を定量化することが可能になります。

所望の時点でコロニー形成単位(CFU)を列挙するには、感染状態ごとに5個の胚を採取し、それぞれの胚を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移します。胚を氷で10分間培養して凍結麻酔します。胚を300〜500ミリグラム/リットルのトリカインで安楽死させた後、滅菌水を使って新しいチューブで胚を2回洗浄します。

次に、各胚に2%のトリトンX-100を1×PBSで除去し、26ゲージの針で組織を均質化して完全な溶解を行います。

サスペンションを遠心分離した後、1×PBSTを使ってペレットを再懸浮させます。次に、Middlebrook 7H10OADC の均質酸塩のプレートシリアル希釈を、BBL MGIT PANTAを補足しました。

プレートは30度Cで4日間孵化してからコロニーを数えます。

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Last updated: 27 June 2026