Bioprinting細胞化は、組織特異的ヒドロゲルBioinkを使用して構築します

このプロトコルの全体的な目標は、バイオプリンティングデバイスを介して押し出すことができるヒドロゲルバイオインクを設計するための汎用性の高いアプローチを実証することです。その後、バイオインクを使用して、3次元組織構築物を作製できます。この方法は、バイオプリンターを使用して押出成形できる材料を提供するために必要な機械的特性をどのように制御するかなど、バイオプリンティング分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、市販のコンポーネントをモジュール方式で組み合わせて、シンプルで効果的なバイオプリント可能なハイドロゲルバイオインクを作成することです。これらの技術の応用には、薬物、毒素、および疾患の影響を正確にモデル化するために使用できる3D組織オルガノイドの作成が含まれます。この方法は、3D肝臓コンストラクトをバイオプリントするためのフレームワークを提供できますが、筋肉、肺、結腸などの他の組織タイプにも適用できます。

一般的に、この方法に不慣れな人は、ハイドロゲルバイオインクの作成に使用されるさまざまな試薬があるため、苦労するでしょうが、実際には非常に簡単です。その手順を実演するのは、私たちのチームのポスドクであるYoung-Joon Seolです。まず、他の場所で説明したように、ハイドロゲル製剤で使用する組織特異的な細胞外マトリックス消化物を調製します。

次に、光開始剤を体積比0.1%の重量で水に溶解してハイドロゲルバイオインクを形成するには、まずヒアルロン酸ハイドロゲルキットの基材成分を水光開始剤溶液の個々のアリコートに溶解します。次に、ECM溶液、2%チオール化ヒアルロン酸、2%チオール化ゼラチン、架橋剤、および肝細胞培養培地をここに示す比率で組み合わせます。バイオインクの押出特性を改善するには、1.5ミリグラム/ミリグラムの未修飾ヒアルロン酸と30ミリグラム/ミリグラムのゼラチンを混合物に加えます。

次に、得られた混合物を10秒間強にして使用する前にボルテックスします。バイオプリンティングデバイスでバイオインクをテストする前に、まず実験室のベンチで押出特性をテストします。標準的なシリンジを使用して、バイオインクのサンプルをドロップし、次に20〜30ゲージの針をシリンジに取り付けます。

バイオインクを架橋し、バイオインクを針に押し込んで、スムーズに押し出されたヒドロゲルフィラメントを実現します。もしその配合が、バンプがほとんどない、あるいは全くないフィラメントを作ることができれば、バイオプリンティングの準備ができています。バイオインク調製物をバイオプリンターにロードするには、バイオインクを滅菌したプリンターカートリッジにピペットで入れます。

バイオインクがカートリッジ内で自発的なステージ1の架橋を受けるため、押し出しの前に30分間放置してください。次に、カートリッジをプリントセットアップにロードし、空気圧源をカートリッジに接続します。この 7 x 7 mm のグリッドの平行線のような単純なパターンを準備して印刷し、押し出し適合性を評価します。

プリントヘッドがXY平面上を毎分約300mmの速度で移動しながら、カートリッジに20キロパスカルの圧力を加えてバイオインクを押し出します。押し出された材料がゴツゴツしていたり、不規則な場合は、第1段階の架橋材料を柔らかくするために、添加する架橋剤の量を減らしてください。適切に調製されたバイオインク配合物は、スムーズに押し出され、正確な堆積と構造を可能にする必要があります。

付属のテキストプロトコルに記載されているハンギングドロップ法を使用して、96ウェルプレートに3D初代細胞肝スフェロイドを調製します。培養に3日後、ピペットを使用して吊り下げ式ドロッププレートから肝臓スフェロイドを採取し、滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に移します。スフェロイドを円錐管の底に1〜2分間沈殿させます。

次に、ピペットで培地を慎重に吸引します。調製したばかりのハイドロゲルバイオインク溶液の所望の印刷された3D構築物体積の110〜125パーセントを、スフェロイドを含む円錐管に移します。次に、スフェロイドを慎重に上下にピペットで動かし、ハイドロゲルバイオインク溶液に再懸濁します。

均一に懸濁したら、ピペットを使用してスフェロイド溶液をバイオプリンターカートリッジに移し、溶液を最初の架橋段階に30分間置きます。架橋の次の段階で、バイオプリンティングデバイスを使用して、一次肝スフェロイドを含む目的のハイドロゲル構造を作成します。各層の堆積後、印刷したバイオインクをUV光に2〜4秒間さらして、二次架橋メカニズムを開始します。

これにより、コンストラクトが安定し、剛性が目的のレベルまで増加します。溶液中のPEGアルキンの濃度は、全体的な架橋密度を制御するものであり、したがって、主に最終コンストラクトの剛性を制御します。バイオプリンティング後、共焦点顕微鏡を用いて肝臓構築物における高い細胞生存率が観察されました。

最適な環境条件下では、生存率は85%以上である必要がありますさらに、肝臓組織を示すマーカーのために構築物を染色したとき、CYP3A4、シトクロムP450アイソフォーム、細胞内アルブミン、E-カドヘリン、上皮細胞間接着タンパク質、およびDPP4、肝臓で高発現するタンパク質の陽性発現がすべて観察されました。培養培地で尿素とアルブミンのレベルを試験したところ、14日間の時間経過で組成物が尿素とアルブミンの両方を一定のレベルで分泌することがわかりました。このことは、組織特異的なハイドロゲルバイオインクが肝細胞の機能維持を助けることをさらに示唆しています。

このテクニックは、一度マスターすれば、きちんと行えば開始から終了まで約2時間で完了します。ただし、これは多くの場合、採用されている特定のバイオプリンティングデバイスに依存します。この手順を試行する際、示された手順は、多くの場合、他の組織タイプやバイオプリンティングデバイスと互換性があるように適合させる必要があることを覚えておくことが重要です。

この手順に従って、他の組織タイプのバイオプリンティングをサポートするために、他のヒドロゲルバイオインク製剤を作成することができます。これらの技術の開発は、薬物のスクリーニングや疾患のモデリングのためのマルチオルガノイド、ボディオンチッププラットフォームの作成への道を開くのに役立ちました。このビデオを見れば、マルチステップクロスリンクを使用して3D組織コンストラクトのバイオプリンティングに使用できる材料の設計を開始する方法について十分に理解できるはずです。

紫外線での作業は視力に非常に危険を及ぼす可能性があるため、この手順を実行する際には常にUV保護ゴーグルを使用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。