Bioprinting細胞化は、組織特異的ヒドロゲルBioinkを使用して構築します

このプロトコルの全体的な目的は、バイオプリンティング装置で押出可能なハイドロゲルバイオインクを設計するための汎用的なアプローチを実証することです。これらのバイオインクを用いて、三次元組織構造体を作製することができます。本手法は、バイオプリンターで押出可能な材料を提供するために必要となる機械的特性をどのように制御するかなど、バイオプリンティング分野における重要な課題の解決に寄与します。

本手法の主な利点は、市販のコンポーネントをモジュール形式で組み合わせることで、シンプルかつ効果的なバイオプリント可能なハイドロゲルバイオインクを作製できる点にあります。これらの技術の応用例としては、薬剤、毒素、および疾患の影響を正確にモデル化できる3D組織オルガノイドの作製が挙げられます。本手法は3D肝 constructs をバイオプリントするための枠組みを提供しますが、筋肉、肺、結腸などの他の組織タイプにも適用可能です。

一般的に、この手法に不慣れな方は、ハイドロゲルバイオインクの作製に使用する試薬が多岐にわたるため苦労されるかもしれませんが、実際には非常に簡単です。本手順のデモンストレーションは、私たちのチームのポストドクターであるYoung-Joon Seolが行います。まず、別途記載されている方法に従い、ハイドロゲル調製に使用する組織特異的な細胞外マトリックス消化液を準備します。

次に、光開始剤を水に重量対容量比0.1%で溶解させます。ハイドロゲルバイオインクを作製するには、まずヒアルロン酸ハイドロゲルキットに含まれるベース材料成分を、光開始剤水溶液の各分注量に溶解させます。その後、ECM溶液、2%チオール化ヒアルロン酸、2%チオール化ゼラチン、架橋剤、および肝細胞培養培地を、ここに示す比率で混合します。バイオインクの押し出し特性を向上させるため、混合物に未修飾ヒアルロン酸1.5 mg/mLおよびゼラチン30 mg/mLを添加します。

その後、使用直前に得られた混合物を高速度で10秒間ボルテックスします。バイオプリント装置でバイオインクをテストする前に、まずラボベンチ上で押し出し特性を確認します。標準的なシリンジを用いてバイオインクのサンプルを滴下し、その後、20〜30ゲージの針をシリンジに取り付けます。

バイオインクを架橋させ、その後、針からバイオインクを押し出して、滑らかに押し出されたハイドロゲルフィラメントを作成します。凹凸がほとんどない、あるいは全くないフィラメントが形成できれば、バイオプリンティングに使用可能な状態です。調製したバイオインクをバイオプリンターにロードするには、滅菌済みのプリンターカートリッジにバイオインクをピペットで分注してください。

バイオインクがカートリッジ内で自発的に第1段階の架橋反応を起こすため、押出の前に30分間静置させます。次に、カートリッジをプリントセットアップに装着し、カートリッジに空気圧源を接続します。押出適合性を評価するために、このような7 mm × 7 mmの平行線グリッドのような単純なパターンを用意してプリントします。

プリントヘッドがXY平面上を約300 millimeters per minuteの速度で移動する間、カートリッジに20 kilopascalsの圧力をかけてバイオインクを押し出します。押し出された材料に塊があったり不規則であったりする場合は、第一段階の架橋材料を軟化させるために、添加する架橋剤の量を減らしてください。適切に調製されたバイオインクの処方はスムーズに押し出され、精密な堆積と構造形成が可能になります。

付属のテキストプロトコルに記載されているハンギングドロップ法を用いて、96ウェルプレートで3D初代肝細胞スフェロイドを調製します。3日間の培養後、ピペットを用いてハンギングドロッププレートから肝細胞スフェロイドを回収し、滅菌済みの15 milliliterコニカルチューブに移します。スフェロイドがコニカルチューブの底に沈殿するまで1〜2分間静置します。

次に、ピペットを用いて培地を慎重に吸引します。調製したばかりのハイドロゲルバイオインク溶液を、目的とする3Dプリント構造物の体積の110〜125%量、スフェロイドが入ったコニカルチューブに分注します。その後、ピペッティングによってスフェロイドを慎重に上下に混ぜ、ハイドロゲルバイオインク溶液中に再懸濁させます。

均一に懸濁させた後、ピペットを用いてスフェロイド溶液をバイオプリンターカートリッジに移し、30分間、一次架橋段階を行います。架橋の次の段階で、バイオプリンティング装置を使用して、一次肝スフェロイドを含む目的のハイドロゲル構造を作製します。積層ごとに、プリントされたバイオインクに2〜4秒間UV光を照射し、二次架橋メカニズムを始動させます。

これによりコンストラクトが安定し、剛性が所望のレベルまで向上します。溶液中のPEGアルキンの濃度が全体の架橋密度を制御し、したがって最終的なコンストラクトの剛性を主に決定します。バイオプリント後、共焦点顕微鏡を用いて肝臓コンストラクト内で高い細胞生存率が観察されました。

最適な環境条件下では、生存率は85%以上であるはずです。さらに、構築物を肝組織を示すマーカーで染色したところ、シトクロムP450アイソフォームであるCYP3A4、細胞内アルブミン、上皮細胞間接着タンパク質であるE-cadherin、および肝臓で高度に発現するタンパク質であるDPP4のすべてにおいて陽性発現が観察されました。培地中の尿素およびアルブミン濃度を測定したところ、構築物は14日間のタイムコースにわたって尿素とアルブミンの両方を一定レベルで分泌していることが分かりました。このことは、組織特異的なハイドロゲルバイオインクが肝細胞の機能維持に寄与していることをさらに示唆しています。

この手法を習得すれば、適切に実施することで開始から終了まで約2時間で完了させることができます。ただし、これは使用するバイオプリンティング装置に依存することが多いです。本手順を実施する際は、実演されたステップを他の組織タイプやバイオプリンティング装置に適応させる必要がある場合が多いことに留意してください。

この手順に従い、他の組織タイプのバイオプリンティングをサポートするために、別のハイドロゲルバイオインク処方を調製することが可能です。これらの技術開発は、薬剤スクリーニングや疾患モデリングのためのマルチオルガノイド・ボディオンチッププラットフォームの構築への道を開きました。このビデオを視聴することで、多段階架橋を用いることで3D組織構造体のバイオプリンティングに使用可能な材料を設計し始める方法について、十分な理解を得られたはずです。

紫外線を用いた操作は視力に極めて深刻な影響を及ぼす可能性があるため、本手順の実施中は、常にUV保護ゴーグルの着用などの予防措置を講じてください。