早期着床後のマウス胚への細胞やDNAの正確​​ローカライズ転送する方法

これらの手順の全体的な目標は、細胞またはDNAを着床後早期のマウス胚に正確に移植する方法を実証することです。これらの方法は、in vitro培養細胞のin vivo可能性や特定の胚期における特定の遺伝子の機能の試験など、発生生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、彼らは特別な機器を必要とせず、可能な初期のポージングプランテーションマウスのブライオの実験的な操作をレンダリングすることです テキストプロトコルに従ってE 7.5またはE 8.5の日に妊娠中の女性を犠牲にした後、はさみと鉗子を使用して子宮を隔離し、2対の細かい鉗子を持つM 2媒体で満たされた30ミリメートルの皿に入れます。

子宮筋層を慎重に引き裂き、次に脱落膜を剥がし、余分な胚の空洞に穴を開けないように注意します。鉗子を使ってライカーの膜をつまんで取り除き、ゆっくりと胚から分離します。次に、実体解剖顕微鏡の下で、胚をチェックして、卵黄嚢羊膜とop胎盤円錐が無傷であることを確認しますピペットで、胚をM2のきれいな皿に移し、30ミリメートルのプラスチック製のペトリ皿の蓋を氷または氷のプラットフォームに置いて、胚を部分的に冷やします。

テキストプロトコルに従って培地と培養胚を調製し、培養細胞をマウス胚に移植します。まず、200 マイクロリットルのピペットチップを使用して、6 ウェル培養プレートから GFP を遍在的に発現する赤芽球幹細胞を物理的に掻き取ります。細胞を胚の入った皿に移します。

手で引いたグラフト毛細血管を吸引器チューブに取り付けて、マウスピペットがマウスピペットを優しく吸い込み、20個を超える細胞の1つ以上の細胞塊をグラフト毛細血管に引き込みます。次に、細胞をそっと吹き出して、大きな塊を分散させます。約10〜20個の細胞を含む塊を1つ選択し、それをグラフト毛細血管に引き込みます。

繰り返しになりますが、一対の鉗子を使用して、塊を毛細血管の開口部に近づけます。胚を所定の位置にゆるく保持し、移植毛細血管を目的の領域に挿入します。開口部を作成します。

移植毛細血管から塊を静かに排出し、10〜20個の細胞の短いひもを胚に留まらせます。M two mediumの同じ皿に胚を残し、蛍光化合物解剖顕微鏡とカメラを使用して移植された胚を画像化します。胚が過度の光や熱にさらされるのを避けるために、イメージング時間を最小限に抑えてください。

ペーストを用いてイメージングした直後に、最小限の量のM two培地で胚を予め平衡化した培地に移し、エレクトロポレーション実験を行う前に、テキストプロトコルのガイドラインに従って培養し、水平マイクロピペット極性を使用して、先端が細く開口部が10マイクロメートル未満のDNA注入ピペットを引っ張り、組織の損傷を回避する。ガラスキャピラリーエレクトロポレーションでは、マイクロフォージを使用して、DNA注入ピペットの開口部を内径20または30マイクロメートルにカットし、先端がきれいでエッジが折れないようにします。各白金電極を細い絶縁線に取り付け、絶縁テープで覆ったマイクロインジェクションニードルホルダーに挿入します。

手作りのキャピラリー電極を準備するには、直径0.2ミリメートルのプラチナワイヤーを、直径20または30マイクロメートルの固定開口部を持つエレクトロポレーションガラスキャピラリーに挿入します。電流を集中させ、血漿DNAを胚の小さな関心領域に送達します。L型電極に直径0.2mmの白金線を曲げ、L字型の水平部分の長さが約1mmのL字型に仕上げます。

ニードルホルダーを標準のマイクロマニピュレーション機器ホルダーに取り付けます。キャピラリー電極を電源のアノードに接続します。L字型電極をマルチメータのアノードに接続します。

次に、マルチメータのカソードを電源のカソードに接続します。エレクトロポレーションガラスキャピラリーを上部から1〜2ミリメートル以内にPBSで満たし、ストレートプラチナ電極をガラスキャピラリーにキャピラリーの底に達するまで挿入します。PBSを充填した30mmシャーレの表面にL字型電極を固定します。

DNA注入には空気圧ピコポンプを使用してください。外側の卵芽球からの注入針を胚の羊水腔に挿入し、約5マイクロリットルのDNA溶液を空洞内または完全にいっぱいになるまで注入します。胚を破裂させないように注意してください。

次に、胚を電極の間に慎重に配置し、DNAが送達される正確な位置に毛細血管電極を移動します。200ボルトを6パルスで、各パルスの持続時間を50ミリ秒ごとに使用し、各パルスの間に1秒間隔で胚をエレクトロポレーションしました。すぐに胚を事前に平衡化した培地に移してから、次の胚のエレクトロポレーションを繰り返します。

エレクトロポレーションの2時間後にエレクトロポレーションされた生細胞または死細胞を検出します。ここに示すテキストプロトコルによれば、EGFPを遍在的に発現するエピPSCを有する胚がE 7.5に移植され、ex vivoで24時間培養されます。10〜16個のfscをE 7.5胚に移植すると、宿主胚内にうまく組み込まれて増殖しました。

しかし、より多くの細胞を移植してもキメラ現象が改善するわけではなく、実際にはここで示したように、取り込まれていない塊が生じます。このGFP発現プラスミドのエレクトロポレーションに示されているように。GFP陽性細胞は、エレクトロポレーションの1〜2時間後に検出されました。

原始線条末期後期胚の遠位梅芽細胞をエレクトロポレーションすると、標識細胞は培養24時間後に神経胚葉に寄与し、これは胃期胚の卵芽細胞の既知の運命マップに対応する。この図は、エレクトロポレーションに他のタイプの電極を使用する場合と同様に、毛細血管電極も標的領域である程度の細胞死を引き起こしたことを示しています。この領域は隣接する領域に比べて色が濃く見えたため、死細胞の核を膜不透過性の遠赤色蛍光ダイで標識しました。

キャピラリーエレクトロポレーション技術により、エレクトロポレーション部位付近の死細胞が少数しか発生しないことを確認。これらの手順を試みる際には、2時間以内に胚の培養を開始することが重要です。培養の最後にマウスから子宮を分離した後、胚を固定することができます。

セクショニング染色などの他の方法は、ドナーやエレクトロブレード細胞の宿主胚への寄与などの追加の質問に答えるために実行できます。このビデオを見た後、私たちはDNAを移植後早期のマウス胚に細胞を正確に移植する方法をよく理解しているはずです。