早期着床後のマウス胚への細胞やDNAの正確ローカライズ転送する方法
December 25th, 2015
私たちは、初期のマウス胚の定義された部位に培養細胞を移植し、そのin vivoの可能性を決定する方法を示します。また、既知の直径のガラスキャピラリーを使用する最適化されたエレクトロポレーション法も導入し、胚のいくつかの細胞に外因性DNAを正確に送達することができます。
これらの手順の全体的な目標は、細胞またはDNAを着床後早期のマウス胚に正確に移植する方法を実証することです。これらの方法は、in vitro培養細胞のin vivo可能性や特定の胚期における特定の遺伝子の機能の試験など、発生生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、彼らは特別な機器を必要とせず、可能な初期のポージングプランテーションマウスのブライオの実験的な操作をレンダリングすることです テキストプロトコルに従ってE 7.5またはE 8.5の日に妊娠中の女性を犠牲にした後、はさみと鉗子を使用して子宮を隔離し、2対の細かい鉗子を持つM 2媒体で満たされた30ミリメートルの皿に入れます。
子宮筋層を慎重に引き裂き、次に脱落膜を剥がし、余分な胚の空洞に穴を開けないように注意します。鉗子を使ってライカーの膜をつまんで取り除き、ゆっくりと胚から分離します。次に、実体解剖顕微鏡の下で、胚をチェックして、卵黄嚢羊膜とop胎盤円錐が無傷であることを確認しますピペットで、胚をM2のきれいな皿に移し、30ミリメートルのプラスチック製のペトリ皿の蓋を氷または氷のプラットフォームに置いて、胚を部分的に冷やします。
テキストプロトコルに従って培地と培養胚を調製し、培養細胞をマウス胚に移植します。まず、200 マイクロリットルのピペットチップを使用して、6 ウェル培養プレートから GFP を遍在的に発現する赤芽球幹細胞を物理的に掻き取ります。細胞を胚の入った皿に移します。
手で引いたグラフト毛細血管を吸引器チューブに取り付けて、マウスピペットがマウスピペットを優しく吸い込み、20個を超える細胞の1つ以上の細胞塊をグラフト毛細血管に引き込みます。次に、細胞をそっと吹き出して、大きな塊を分散させます。約10〜20個の細胞を含む塊を1つ選択し、それをグラフト毛細血管に引き込みます。
繰り返しになりますが、一対の鉗子を使用して、塊を毛細血管の開口部に近づけます。胚を所定の位置にゆるく保持し、移植毛細血管を目的の領域に挿入します。開口部を作成します。
移植毛細血管から塊を静かに排出し、10〜20個の細胞の短いひもを胚に留まらせます。M two mediumの同じ皿に胚を残し、蛍光化合物解剖顕微鏡とカメラを使用して移植された胚を画像化します。胚が過度の光や熱にさらされるのを避けるために、イメージング時間を最小限に抑えてください。
ペーストを用いてイメージングした直後に、最小限の量のM two培地で胚を予め平衡化した培地に移し、エレクトロポレーション実験を行う前に、テキストプロトコルのガイドラインに従って培養し、水平マイクロピペット極性を使用して、先端が細く開口部が10マイクロメートル未満のDNA注入ピペットを引っ張り、組織の損傷を回避する。ガラスキャピラリーエレクトロポレーションでは、マイクロフォージを使用して、DNA注入ピペットの開口部を内径20または30マイクロメートルにカットし、先端がきれいでエッジが折れないようにします。各白金電極を細い絶縁線に取り付け、絶縁テープで覆ったマイクロインジェクションニードルホルダーに挿入します。
手作りのキャピラリー電極を準備するには、直径0.2ミリメートルのプラチナワイヤーを、直径20または30マイクロメートルの固定開口部を持つエレクトロポレーションガラスキャピラリーに挿入します。電流を集中させ、血漿DNAを胚の小さな関心領域に送達します。L型電極に直径0.2mmの白金線を曲げ、L字型の水平部分の長さが約1mmのL字型に仕上げます。
ニードルホルダーを標準のマイクロマニピュレーション機器ホルダーに取り付けます。キャピラリー電極を電源のアノードに接続します。L字型電極をマルチメータのアノードに接続します。
次に、マルチメータのカソードを電源のカソードに接続します。エレクトロポレーションガラスキャピラリーを上部から1〜2ミリメートル以内にPBSで満たし、ストレートプラチナ電極をガラスキャピラリーにキャピラリーの底に達するまで挿入します。PBSを充填した30mmシャーレの表面にL字型電極を固定します。
DNA注入には空気圧ピコポンプを使用してください。外側の卵芽球からの注入針を胚の羊水腔に挿入し、約5マイクロリットルのDNA溶液を空洞内または完全にいっぱいになるまで注入します。胚を破裂させないように注意してください。
次に、胚を電極の間に慎重に配置し、DNAが送達される正確な位置に毛細血管電極を移動します。200ボルトを6パルスで、各パルスの持続時間を50ミリ秒ごとに使用し、各パルスの間に1秒間隔で胚をエレクトロポレーションしました。すぐに胚を事前に平衡化した培地に移してから、次の胚のエレクトロポレーションを繰り返します。
エレクトロポレーションの2時間後にエレクトロポレーションされた生細胞または死細胞を検出します。ここに示すテキストプロトコルによれば、EGFPを遍在的に発現するエピPSCを有する胚がE 7.5に移植され、ex vivoで24時間培養されます。10〜16個のfscをE 7.5胚に移植すると、宿主胚内にうまく組み込まれて増殖しました。
しかし、より多くの細胞を移植してもキメラ現象が改善するわけではなく、実際にはここで示したように、取り込まれていない塊が生じます。このGFP発現プラスミドのエレクトロポレーションに示されているように。GFP陽性細胞は、エレクトロポレーションの1〜2時間後に検出されました。
原始線条末期後期胚の遠位梅芽細胞をエレクトロポレーションすると、標識細胞は培養24時間後に神経胚葉に寄与し、これは胃期胚の卵芽細胞の既知の運命マップに対応する。この図は、エレクトロポレーションに他のタイプの電極を使用する場合と同様に、毛細血管電極も標的領域である程度の細胞死を引き起こしたことを示しています。この領域は隣接する領域に比べて色が濃く見えたため、死細胞の核を膜不透過性の遠赤色蛍光ダイで標識しました。
キャピラリーエレクトロポレーション技術により、エレクトロポレーション部位付近の死細胞が少数しか発生しないことを確認。これらの手順を試みる際には、2時間以内に胚の培養を開始することが重要です。培養の最後にマウスから子宮を分離した後、胚を固定することができます。
セクショニング染色などの他の方法は、ドナーやエレクトロブレード細胞の宿主胚への寄与などの追加の質問に答えるために実行できます。このビデオを見た後、私たちはDNAを移植後早期のマウス胚に細胞を正確に移植する方法をよく理解しているはずです。
概要
この研究は、培養細胞を初期のマウス胚に移植する手法を実証し、DNA送達のための最適化された電気穿孔技術を紹介します。これらの方法は、胚発生中の培養細胞と遺伝子機能の生体内ポテンシャルを探求することを目的としています。
研究の主要な構成要素
科学分野
- 発生生物学
- 細胞生物学
- 発生学
背景
- 生体内での細胞挙動の理解は発生生物学にとって重要です。
- 移植と電気穿孔技術は遺伝子機能への洞察を提供できます。
- これらの方法は特殊な機器を必要としないため、アクセスしやすいです。
- 以前の研究では、胚内での細胞組み込みの成功率が様々であることが示されています。
研究目的
- マウス胚への精密な細胞とDNAの移送を実証すること。
- 培養細胞の生体内ポテンシャルを評価すること。
- 胚における遺伝子発現に対する電気穿孔の影響を評価すること。
使用した方法
- 移植後の初期マウス胚の分離。
- 手作りの毛細管を用いた培養細胞の移植。
- カスタム電極を用いた胚のプラスミドDNA電気穿孔。
- 移植された胚のイメージングによる統合と生存率の評価。
主な結果
- 培養細胞の胚への移植に成功しました。
- 電気穿孔により、標的細胞でGFPの発現が検出されました。
- 細胞の組み込みは移植された細胞数によって変化しました。
- 電気穿孔後にある程度の細胞死が観察されました。
結論
- 提示された方法は生体内での細胞挙動の研究に効果的です。
- 最適化された電気穿孔は胚発生研究における遺伝子送達を促進できます。
- これらの技術をより良い結果を得るために改良するためには、さらなる研究が必要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables precise delivery of cells or DNA into early postimplantation mouse embryos, supporting functional validation of genetic targets and assessment of cultured cell phenotypes in a physiologically relevant context. By allowing in situ analysis of genetic manipulations during gastrulation and organogenesis, it provides mechanistic insights that can de-risk target validation and phenotypic screening efforts in early discovery. The approach requires no specialized equipment, enhancing accessibility for laboratories seeking to bridge in vitro findings with in vivo relevance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Tests the in vivo developmental potential of in vitro cultured cell populations, informing target relevance and phenotypic fidelity.
- Operational Value: Enables spatial and temporal control of genetic perturbations to interrogate gene function in specific embryonic lineages.
- Predictive Value: Supports assessment of whether cultured cells accurately model in vivo behavior, reducing false positives in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts on cell incorporation, proliferation, and localization following grafting or electroporation.
- Operational Value: Uses standardized glass capillaries of defined diameter to ensure reproducible DNA delivery and transfection efficiency.
- Assay Readiness: Produces ex vivo cultured embryos suitable for imaging and analysis of differentiation outcomes after perturbation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro cell manipulations to in vivo developmental outcomes, supporting biomarker-aligned phenotypic assessment.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of genetic modifications on cell fate decisions within the native embryonic microenvironment.
- Predictive Confidence: Allows correlation of electroporation efficiency with downstream phenotypic contributions, such as neural lineage derivation from primitive streak cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by enabling hypothesis testing in embryogenesis following target identification and preceding lead optimization, particularly for pathways governing cell fate and differentiation.
- Discovery Biology: Facilitates interrogation of gene function in specific embryonic stages and regions, supporting pathway validation and target de-risking.
- Screening: Delivers quantitative transfection metrics via capillary electroporation, allowing comparison of construct efficacy and toxicity.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts (e.g., GFP expression) to quantify transfection success and cell survival post-manipulation.
- Translational Research: Connects cultured cell behavior to embryonic integration, informing the translational relevance of in vitro models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of genetic constructs or cell phenotypes across multiple embryonic timepoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets through direct assessment of genetic and cellular perturbations in situ.
- Operational Value: High reproducibility due to standardized capillary dimensions and minimal equipment requirements.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by validating target function in a developing mammalian system.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on in vivo phenotypic validation from early embryonic models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo dissection, microsurgery, and fluorescence microscopy.
- Depends on glass capillary preparation and electrode fabrication for electroporation.
- Necessitates standardized culture conditions (M2 medium) and timed embryo isolation (E7.5–E8.5).
- Involves optimization of DNA concentration and pulse parameters to balance transfection efficiency with viability.
- Limited by embryo accessibility post-grafting and the need for ex vivo culture to assess outcomes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Dissecting E7.5 or E8.5 Postimplantation Embryos for ex vivo Culture
2:03
Grafting Cultured Cells into E7.5 or E8.5 Mouse Embryos
3:42
Handmade Electroporation Materials and Apparatus Setup
5:19
Electroporation of E7.5 or E8.5 Embryos
6:44
Results: Localized Cell and DNA Transfer into Mouse Embryos
8:15
Conclusion
