光駆動酵素的脱炭酸

この実験の全体的な目的は、可視光を用いて酵素反応を促進させることです。この手法では、穏やかな反応条件下で、光を利用して脂肪酸を末端アルキンに変換します。脱炭酸反応にはC-C結合の切断が必要です。

この結合は非常に安定しているため、この反応を進行させることは非常に困難です。光を利用することは、このような困難な反応を実現するための持続可能なアプローチとなります。私たちがこの手法を考案したのは、過酸化水素を反応系に直接添加したところ、酵素の不活性化を招いたことがきっかけでした。

この手法の主な利点は、過酸化水素を一定量供給できることです。まず、酵素の特性評価を行うため、精製したOleTを用いて光駆動バイオカタリシスを実施しました。その後、産業応用の開発において重要となる粗抽出液についても検証を行いました。

テキストプロトコルに記載されている通り、合成OleT遺伝子を発現ベクターにクローニングし、プラスミドをE.Coliに形質転換した後、100 micrograms per milliliterのアンピシリンを含む3 millilitersのLB培地を入れた2本の試験管に細胞を接種します。前培養液をシェーカーで15時間インキュベートします。培養液2 millilitersを、アンピシリン入りLB培地200 millilitersを入れた2本の1 literフラスコに希釈します。

フラスコをシェーカーに入れ、37 °C、180 RPMで、培養液の600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）が0.6から0.8になるまでインキュベートします。次に、培養液に0.5 mMのδ-アミノレブリン酸を添加します。その後、フラスコに0.2 µg/mLのテトラサイクリンを添加し、細胞を誘導します。

培養物を20 °C、180 RPMで15時間インキュベートします。誘導後、培養物を遠心管に移し、12000 ×g、4 °Cで20分間遠心分離します。上清を廃棄します。

氷冷したTris緩衝液50 millilitersを用いてピペッティングし、ペレットを再懸濁させ、懸濁液をコニカル遠心チューブに移します。続いて、4000 times G、4 degree celsiusで15分間遠心分離します。上清を捨て、繰り返しピペッティングを行うことで、各ペレットを3 millilitersの緩衝液で再懸濁させます。

30秒間のサイクルを3回、各サイクルの間に1分間の休止時間を設けてソニケーションを行い、細胞を溶解します。次に、溶解物を15000 ×g、4 °Cで20分間遠心分離し、細胞除去抽出液を慎重にコニカル遠心チューブにピペットで移します。光駆動バイオカタリシス用の粗抽出液を調製するため、細胞除去抽出液3 mLを10 kDa遠心フィルターに移し、4000 ×g、4 °Cで遠心分離して低分子物質を除去します。

タンパク質を3 mLのTrisに再懸濁します。光駆動バイオカタリシスにおけるOleTの活性を評価するために、タンパク質の精製が必要です。タンパク質精製を開始するために、平衡化したニッケルNTAスピンカラムに3 mLの細胞抽出液をロードします。

カラムをボトムプラグとスクリューキャップで密閉します。その後、樹脂が均一に分散するまで軽く振ってください。続けて、オーバヘッドシェーカーでカラムをインキュベートします。

その後、カラムを遠心分離します。次に、1 mLの洗浄バッファーを加え、700 ×gで2分間遠心分離してカラムを洗浄します。この洗浄操作をさらに2回繰り返します。

洗浄後、カラムをコニカル遠心チューブに入れ、各カラムに1 mLの溶出バッファーを加えます。チューブを700 ×gで2分間遠心分離し、溶出をさらに2回繰り返します。回収したカラム抽出液を10 kDaの遠心フィルターに加え、4000 ×g、4 °Cで遠心分離し、溶出に使用したイミダゾールを酵素から分離します。

最後に、テキストプロトコルに従ってタンパク質の純度と濃度を決定します。バイオトランスフォーメーションの手順を開始するには、まず蒸留水にTergitolなどの界面活性剤を10%およびステアリン酸を28.4 milligrams加え、10 millimolarのストック溶液を10 milliliters調製します。ステアリン酸が完全に溶解するまで、加熱チャンバー内で溶液を60 degrees celsiusに加熱します。

この溶液を使用して、次のプロトコルに従って反応混合物を調製します。2本の透明なガラスチューブにFMN、EDTA、バッファー、およびステアリン酸を加え、25 °Cの水槽で撹拌します。続いて、精製酵素または粗抽出液を200 µg/mLの濃度でチューブに加えます。

そして、2 cmの距離から白色LED電球で照射します。次に、反応を停止させるため、20 µLの37% hydrochloric acidをあらかじめ充填したチューブに、特定の時点で200 µLのサンプルを採取します。その後、内部標準として、5 µLの10 mM myristic acid溶液を各サンプルに加えます。

反応生成物を分析するため、チューブにエチル酢酸を500 µLずつ2回加えます。チューブを転倒させて混合し、13,000 ×gで1分間遠心分離します。次に、上清を400 µL分マイクロ遠心チューブに移し、圧縮空気をチューブに軽く吹き付けて完全に蒸発させます。チューブにMSTFAを200 µL加えます。

次に、分析前にサンプルを誘導体化するため、混合物を60 °Cで30分間インキュベートします。テキストプロトコルに記載された温度プロファイルを用い、4 µLのサンプルを水素炎イオン化検出器付きのガスクロマトグラフに注入して、反応生成物を分析します。続いて、質量分析計を接続したガスクロマトグラフを用いて、各反応サンプルで生成された1-ヘプタデカンとβ-ヒドロキシ酸の比率を決定します。

オーブン温度および質量分析計の設定は、テキストプロトコルに記載されている通りに行います。各サンプル1 µLをガスクロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録します。最後に、各サンプルのGCMSクロマトグラムをモニタリングし、製造元のプロトコルに従って分析します。

酵素反応による生成物の分子量は、ガスクロマトグラフ質量分析計を用いて決定した。より長いアシル鎖を持つ脂肪酸に対し、酵素OleTは、それらを異なる長さのオレフィンへと脱炭酸させる反応を優先的に触媒する。バイオトランスフォーメーション反応のサンプルは、水素炎イオン化検出器を備えたガスクロマトグラフによって分析した。

ステアリン酸の脱炭酸反応は、水酸化反応よりも3倍速く進行することが示され、ステアリン酸の99%がヘプタデカンと2-ヒドロキシステアリン酸の3.3:1の混合物へと変換されました。適切に実施できれば、この光駆動バイオカタリシスを習得した後、数時間で完了させることができます。光触媒における課題は、有用な反応を光の回収へと結びつけることです。

本研究では、光増感剤として分子内にあるFMNを用い、過酸化水素という輸送分子を介してこれらを酵素に結合させています。