スキャフォールド フリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

このプロトコルは、スフェロイドを足場のない心臓組織作成のためのツールとして使用する、3次元心臓組織作成のための新しくて簡単な金型ベースの方法について説明しています。私たちの実験では、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞、ヒト心線維芽細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞の3種類の細胞を単離し、細胞懸濁液を作製しました。70%の心筋細胞、15%の線維芽細胞、および15%の内皮細胞を50MLの円錐形チューブに入れています。

次に、細胞懸濁液を超低アタッチメントハンギングドロップシステムの各ウェルに分注し、3日後に数百のビートスフェロイドが自発的に形成されます。その後、スフェロイドを回収し、新しい型キャビティに装着します。その後、組織は培地を入れた滅菌容器に、インキュベーター内のシェーカーで数日間維持されます。

その後、金型を取り外し、機械的完全性を備えた足場のない組織パッチが得られます。吊り下げ式ドロップ装置は、直径350ミクロンの850個のマイクロポアを備えた再利用可能な超低アタッチメントウェルです。吊り下げ式ドロップは、標準の6ウェルプレートに対応しています。

細胞懸濁液を作成した後、1,000万個の細胞を含む4ミリリットルの細胞懸濁液を、吊り下げ式ドロップシステムの各ウェルに分注します。デバイスは、摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度95%で培養されます。72時間後、平均直径350ミクロンの鼓動スフェロイドの自発的な形成が観察される。

スフェロイドを採取するには、吊り下げ装置を培地のある別の皿に入れ、穏やかに渦巻いてスフェロイドを解放し、吊り下げ式ドロップシステムの下部にある細孔を漂流させます。これは、3次元で足場のない心臓組織を作成するための新しい型の概略図です。ハンドリングマット、充填ベース、新規金型が含まれています。

斬新な金型は、ベース、底面の正方形のプレート、底面のネット、細かいステンレス鋼のプロングで作られた10層のサイドネットで構成されています。トップネット、トップスクエアプレート、保持チューブ、ストッパーピン。Novel Moldシステムは、2 x 2 mm、4 x 4 mm、6 x 6 mmなど、さまざまなサイズの組織を作成できます。

底面の角型プレートと底部のネットは、コーナーポストを使用して積み重ねられ、位置合わせされます。次に、10層のサイドネットを交互に積み重ねて、滅菌鉗子のペアの助けを借りて、細かいステンレス鋼のプロングのネットを作成します。次に、充填ベースを1Xリン酸緩衝液(PBS)で洗い流し、表面張力を下げてから、スフェロイドを新規の型に着座させます。

新規の金型キャビティを同じメタンで濡らした後、スフェロイドは所望のサイズの想定されたキャビティに着座します。着座すると、余分な培地がネットモールドから排出され、スフェロイドが充填され、事前定義されたキャビティの形状をとることができます。次に、上部ネットと上部角板をコーナーポストに組み立て、ストッパーピンと保持チューブを固定して、回転楕円体のウォッシュアウトを防ぎます。

充填された新規モールドシステムは、6mmのB-27添加培地を含む6ウェルプレートに移され、その後、スイングシェーカーのインキュベーターで30〜40RPMで7〜10日間維持されます。インキュベーションの期間は、心臓パッチのサイズに応じて変更できます。インキュベーション後、システムを取り出し、保持チューブ、ストッパー、上部正方形プレート、上部ネットを取り外します。

その後、層状になったサイドネットを、組織を乱さないように注意しながら、1枚ずつ慎重にスライドさせていきます。すべてのサイドネットを取り外した後、下部ネットの上部に無傷の心臓パッチが得られます。機能的な同期鼓動は24時間以内に観察されます。

この新しい金型ベースの方法は、最小限の手作業で3次元の足場のない心臓組織を作成する効率的で簡単な方法です。得られた多層組織は、満足のいく構造的完全性と同期的な拍動挙動を持つ融合スフェロイドで構成されています。この新しい金型ベースの方法は、現在の人工組織のバイオファブリケーション方法に代わる、費用対効果が高くスケーラブルな代替手段を提供します。