マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成

次の実験の目的は、マイクロコンタクト印刷により整列した機能的な心筋組織を生成することです。これは、フィブロネクチンをポリジメチルシロキサン基材に最初にマイクロコンタクト印刷することによって達成されます。第2のステップとして、ダブルトランスジェニック。

胚性幹細胞株はin vitroで分化し、蛍光活性化細胞ソーティングによって単離されるため、心原性の強い前駆細胞の高度に精製された集団を得ることができます。次に、単離された心臓前駆細胞をマイクロパテントPDMS基質に播種して悪性にし、心筋細胞のような棒状にします。事実と免疫蛍光分析に基づいて、心前駆細胞の単離と等方性成長の成功を示す結果が得られます。

等方性心筋組織を作製することは、医薬品の開発と発見のための疾患特異的な細胞再開発の可能性を高めることにより、幹細胞生物学および組織生物工学の分野における進歩に役立つ可能性があります。そして、心臓再生医療の基盤を築くことによって。まずILガードは、180 4ポリジメチルアランエラストマーを10対1ベースのアキュア剤比でよく混合します。

乾燥剤を使用してアセンブリを脱気し、気泡を排除します。幅20ミクロン、20ミクロン間隔で分離された2ミクロンのツールリッジを持つ以前に製造されたマスターにPDMSを注ぎ、室温で乾燥させて2日間硬化させ、マイクロテクスチャPDMSスタンプを取得します。PDMSスタンプの表面をプラズマクリーナーで親水性にレンダリングした後。

スタンプを70%エタノールで1分間滅菌します。生物学的安全キャビネット内で、圧縮空気で素早く乾燥させます。滅菌スタンプの表面をフィブロネクチン溶液で覆い、吸収後少なくとも10分間吸収します。

スタンプからフィブロネクチン溶液を振り落とし、圧縮空気で素早く乾かします。テキストプロトコルで説明されているように、スタンプと事前に準備したPDMSコーティングされたガラスカバースリップとの間にコンフォーマルコンタクトを2分間確立し、しっかりと押します。マイクロパターン基材を蒸留水ですすいでください。

すぐに使用しない限り、蒸留水で最大2週間摂氏4度で保管してください。蒸留水で滅菌0.1%ゼラチンで6つのウェルプレートをコーティングし、15分間摂氏37度で吸収させますこの間に、円錐管内のPBSの50ミリリットルにそれらを添加することにより、ahorアリコートからマウス胚性線維芽細胞を準備します。覚せい剤を1000RPMで5分間遠心分離し、覚せい剤培地に再懸濁します。

インキュベーション時間が経過したら、余分なゼラチンを吸引し、メスをウェルに加えます。MESが添付されるまで1日待ちます。思考アリコートから胚性幹細胞またはES細胞を調製するには、円錐管遠心分離機で50ミリリットルのPBSにそれらを追加します。

ES細胞を1000RPMで5分間駆動し、ResusはそれらをESC培地に懸濁します。神話を含むウェルにE ES細胞を追加し、合流点に達するまでESC培地で保持してcofluent ES細胞をマッサージします。まず、ESC培地を吸引し、滅菌PBSで細胞を一度洗浄します。

次に、PBSを吸引し、500マイクロリットルのトリップを追加します。プレートを摂氏37度で3分半インキュベートします。TRIPSIN溶液を数回上下にピペットで動かします。

最初にE es細胞コロニーを分解します。次に、500マイクロリットルのESC培地をウェルに追加して、トリプシン溶液を中和します。必要な比率に従ってES細胞をマッサージします ここでE ES細胞は1対30の比率で継代され、3日以内にコンフルエントに到達します。

ES細胞がコンフルエントに達したときにin vitro分化を開始します。まず、10cm培養皿に滅菌0.1%ゼラチンを蒸留水でコーティングし、摂氏37度で15分間吸収させます。この間、以前と同様にES細胞を採取します。

15分が経過したら、余分なゼラチンを吸引し、適応培地を含む培養皿にE ES細胞懸濁液の約3分の1から半分を加えます。適応培地で細胞を2日間培養した後、適応ES細胞を1.5ミリリットルのトリプシンを使用してPBSを含む50ミリリットルの円錐管に回収します。1000 RPMで5分間遠心分離し、分化培地に再懸濁します。

15cm培養皿中の分化培地10μL滴につき約1000細胞の胚体またはEBSを作製します。マルチチャンネルピペットを使用して、プレートと培養物を反転させます。EBSは摂氏37度で2日半にわたって液滴を吊るしています。

2日半後、分化培地を使用してEBSを6個から8個の15cm皿から1つに引き抜き、さらに3日半培養します。さらに3日半後、EBSを50ミリリットルの円錐管に収集し、滅菌PBSでプレートを一度洗浄して、すべてのebsを収集します。その後、約5分間底に沈めます。

次に、仰臥位を取り外し、滅菌PBSでEBSを洗浄します。EBSを再び約5分間底に沈めます。2.5ミリリットルのトリプシンを加えてEBSを解離し、チューブを摂氏37度の水浴中で2分間柔らかく振とうします。

次に、2.5ミリリットルの滅菌PBSをトリプシン溶液に加え、10ミリリットルの血清ピペットで約8〜10回ピペットを上下させて細胞クラスターを分解します。7.5%E ES細胞または分化グレードのFBSおよびPBS遠心分離機の0.01%DPIを含む10ミリリットルのファックスバッファーでトリプシンを中和し、EBSを1000RPMで5分間解離します。次に、仰臥位を取り外し、約1ミリリットルのファックスバッファピペットを1ミリリットルのピペットで約8〜10回上下に追加して、細胞クラスターを分解します。

細胞を35ミクロンの細胞ストレーナーを備えた滅菌丸底チューブに移し、単一細胞懸濁液を得ます。Ariaフローサイトメーターを使用して分化したES細胞を選別し、コミットされた心室前駆細胞の精製された集団を取得します。詳細なゲーティング戦略については、プロトコルのテキスト部分を参照してください。

1%onic F1 27を含むマイクロパターン基質を蒸留水で10分間食べました。次に、滅菌PBSで3回洗います。パターン領域の周囲にPDMSガスケットを取り付け、しっかりと押します。

次に、心前駆細胞をフィブロネクチンマイクロパターン基質に播種します。以下の画像は、in vitro分化ES細胞の6日目の代表的なフローサイトメトリーチャートからのものです。この画像は、前方散乱振幅FSCAと側方散乱振幅SSCAのゲーティングを示しています。

これにより、細胞の破片から細胞全体を分離することができます。ここでは、FSCAのゲーティングと前方散乱幅FSCWが見られます。これにより、ダブレットや他の細胞凝集体からの細胞シングレットの単離が可能になります。

この画像は、SSCAでのゲーティングとSSCWでの散乱を示しています。これにより、細胞一重項の純度が向上します。この画像は、生存率の低い細胞から生存可能なDPI陰性細胞を分離することを可能にするFSCAおよびDPI染色のゲーティングを示しています。

ここでは、DI 7 PE SI 7 の fico、rine、PE、および PE シアンのゲーティングが見られます。これにより、真赤色陽性細胞および真赤色陰性細胞を取得し、自己蛍光赤色陰性細胞を除外することができます。これらの画像は、フルオレセイン、イソチオシアネート、振幅、フィット、CAおよびPEAのゲーティングを示しており、これにより、赤、陽性、赤、陰性の集団内の真緑、陽性、真、緑の陰性細胞を選別することができます。

in vitro分化ES細胞のファックス精製により、このフローサイトメトリープロットから見られるように、前駆細胞の4つの異なる集団が明らかになります。祖先の4つの異なる集団は、赤、正の緑、正の赤、正の緑、負の赤、負の緑、陽性、および赤の負の緑陰性です。この代表的な免疫蛍光顕微鏡画像は、マイクロパターン化されたフィブロネクチン基質を示しています。

スケールバーは80ミクロンを表します。この画像は、胚由来の事実、上部パネルの単離された前駆細胞、およびESL由来の事実、青色に染色されたフィブロネクチンマイクロパターン核でさらに5日間の培養後の下部パネルの単離された前駆細胞の代表的な免疫蛍光顕微鏡法を示しています。S-M-M-H-C-Aで染色された赤いサルコメアαアクチニンは緑色に見えます。

スケールバーは40ミクロンです。このビデオを見れば、再生可能な心臓プロタスの細胞源から異方性機能性心筋組織を生成する方法についてよく理解できるはずです。