遺伝的にコードされた蛍光電圧センサーの2種類のイメージング膜電位

この手順の全体的な目標は、遺伝的にコード化された電圧インジケータを使用して、膜電位の変化を光学的に報告することです。この方法では、遺伝的にコードされたさまざまな電圧の蛍光プローブを使用したイメージングの長所と短所について説明します。例えば、FRETベースのプローブは、レシオメトリックイメージングの利点を提供しますが、信号は低くなります。

この手法の主な利点は、神経活動をリアルタイムで視覚化できることです。一般に、この方法に不慣れな人は、信号対雑音比がそれほど大きくなく、ノイズの発生源がいくつかあり、うまくいかない可能性のある複数のステップがあるため、苦労するでしょう。新しいユーザーはしばしば混乱し、干渉が実際の信号と見なされます。

この手法の視覚的なデモンストレーションは、使用されているプローブの有効性とそれが実際に何を示しているかを確認するために重要です。セットアップでは、FRETベースのGEVIのイメージングのために、低速CCDカメラと高速CCDカメラの間にイメージスプリッターが設置されています。実験の前に、ダイクロイックミラーと2つの発光フィルターを備えたフィルターキューブをイメージスプリッターに挿入します。

この2つ目のフィルターキューブは、GEVIを単一の蛍光タンパク質でイメージングする際には取り外してください。実験を開始するには、内部蛍光と比較して強力で局所的な膜蛍光を示す健康なHEK293細胞を見つけ、円形細胞が分裂または死滅する過程でパッチを当てないようにします。次に、テストパルスを印加して、電流応答を確認します。

その後、パッチクランプピペットを細胞の表面の真上に下げます。次に、ピペットが細胞膜に優しく触れるまでゆっくりと下げます。膜抵抗は1〜2メガオームに増加するはずです。

その後、ピペットを通して静かに陰圧を加えることにより、ギガオームシールを確立します。ギガオームシールが達成されたら、ピペット電位を希望の保持電位に設定します。次に、高速CCDカメラをセル本体にピントを合わせます。

FRETベースのGEVI録音の場合は、イメージスプリッターのノブを使用して、分割された画像のサイズを調整して、各発光波長の間隔が均等に見えるようにします。次に、負圧を加えて細胞膜を破裂させ、細胞全体の構成を形成します。次に、イメージングソフトウェアを開きます。

次に、SciMeasureカメラ取得メニューをクリックして、CCD取得ページを開きます。次に、録音を保存するための新しいデータファイルを作成します。アナログ出力をクリックし、ASCIIを読み取ってパルスプロトコルを開きます file イメージングを行うために。

次に、内部繰り返しの平均をクリックして、試行回数を平均化します。次に、アナログ出力ページを閉じます。CCD取得ページで特定の取得パラメータを設定します。

その後、取得するフレーム数と試行回数の特定の値を入力します。次に、データ光学系とBNCの撮影ボタンをクリックして録音を開始します。電圧イメージングが行われている間、オシロスコープを監視して、記録全体を通して安定した全セル構成を確保します。

分数蛍光を変更するには、ファイルをクリックしてからデータファイルを読み取って、前の手順で記録したデータファイルを開きます。静止光強度のセル画像は右側に表示されます。次に、[BNCの表示]をクリックして、現在の終了電圧値を表示します。

ページモードをRLIフレームからフレーム減算に変更して、フレーム減算機能を利用して応答光信号のあるピクセルを識別します。次に、減算する2つの時点を選択し、膜電位の変化に応答してシグナルを示す細胞領域を特定します。次に、各ピクセルをドラッグまたはクリックして、分析する必要のあるピクセルを指定します。

選択したピクセルからの平均蛍光強度のグラフ表現が、ソフトウェアウィンドウの左側に表示されます。減算されたピクセルを静止光強度で除算するには、divide by RLIのボタンをクリックして、分数蛍光変化値を取得します。データをエクスポートするには、[BNCのメニューを表示]のクリックをオフにして、電流終了電圧グラフを削除します。

出力に移動し、トレースを表示されているASCIIとして保存して、カーブフィッティング分析のために蛍光トレースをASCIIファイル形式でエクスポートします。この手順では、データ解析プログラムで電圧に対する分数蛍光変化をプロットすることにより、蛍光変化対電圧グラフを描画します。その後、カーブをボルツマン関数にフィットさせ、解析、フィッティング、シグモイドフィットをクリックして光信号の電圧範囲を決定し、ダイアログを開きます。

データ解析プログラムを使用して、電圧に応答した正規化された分数蛍光の変化を再プロットします。光学応答の速度を計算するには、ASCII ファイルを開き、時間に対する蛍光の分数変化トレースをプロットします。次に、データ解析ソフトウェアのデータセレクターをクリックし、ステップ電圧パルスの開始に対応する1つの時点と、光信号が定常状態に達した2番目の時点を選択します。

この範囲を単一指数関数と二重指数関数の両方に適合させるには、解析、フィット、指数関数フィットをクリックし、ダイアログを開いてより良いフィットを報告します。この図は、単一のFPベースのGEVI Bongwooriを発現するHEK細胞の蛍光変化を示しています。これは、ステップ電圧パルスに対する典型的な蛍光変化です。

ここでは、HEK293セルを高速CCDカメラで撮像しました。この画像は、ボンウーリを発現する細胞の静止光強度を示しています。そして、これは蛍光変化が観察されたピクセルを示すフレーム減算画像です。

ここに示されているのは、Bongwooriを発現するマウス海馬初代ニューロンからの誘導活動電位の光学記録です。活動電位は、全細胞電流クランプモードで誘発されました。フラクショナル蛍光変化トレースは、体細胞に相関するピクセルから選択しました。

この図では、FRETベースのGEVIを発現するHEK細胞の蛍光変化は、2つの波長のステップ電圧パルスに対する応答を示しています。高速CCDカメラで1キロヘルツで記録。この手順を試みる際には、蛍光の過剰発現が細胞の健康に影響を与える可能性があるため、さまざまな蛍光レベルをテストすることを忘れないでください。

この手順に従って、さまざまな回路のニューロン活動に関連する追加の質問に答えるために、スライサーコーディングなどの他の方法を実行できます。このビデオを見れば、さまざまなタイプのプローブを使用して膜電位を画像化する方法について十分に理解できるはずです。