遺伝的にコードされた蛍光電圧センサーの2種類のイメージング膜電位

この手順の全体的な目的は、遺伝子組み換え型電圧インジケーターを用いて、膜電位の変化を光学的に報告することです。本手法では、異なる遺伝子組み換え型蛍光電圧プローブを用いたイメージングの利点と欠点について記述します。例えば、FRETベースのプローブはレシオメトリックイメージングが可能という利点がありますが、信号強度は低くなります。

この手法の最大の利点は、神経活動をリアルタイムで可視化できることです。一般的に、この方法に慣れていない方は、S/N比があまり高くなく、ノイズ源が複数存在し、また不備が生じうる工程が多いため、苦労することがあります。初心者は混乱しやすく、干渉を実際の信号と見なしてしまうことがよくあります。

使用しているプローブの妥当性と、それが実際に何を示しているかを確認するためには、本手法を視覚的に実証することが極めて重要です。セットアップとして、FRETベースのGEVIをイメージングするために、低速および高速のCCDカメラの間にイメージスプリッターを設置します。実験前に、ダイクロイックミラーと2つのエミッションフィルターを備えたフィルターキューブをイメージスプリッターに挿入してください。

単一の蛍光タンパク質を用いたGEVIのイメージングを行う際は、この2つ目のフィルターキューブを取り除いてください。実験を開始するには、細胞内部の蛍光と比較して、膜に強く局在化した蛍光を示している健全なHEK293細胞を探します。円形の細胞は分裂中または死滅過程にあるため、パッチクランプの対象から除外してください。その後、テストパルスを印加し、電流応答を確認します。

その後、パッチクランプピペットを細胞表面の直上まで下げます。次に、ピペットが細胞膜に軽く触れるまでゆっくりと下げます。このとき、膜抵抗が1〜2 MΩまで上昇することを確認します。

その後、ピペットを通じて緩やかに陰圧をかけることで、ギガオームシールを形成します。ギガオームシールが形成されたら、ピペット電位を目的の保持電位に設定します。次に、高速CCDカメラの焦点を細胞体に合わせます。

FRETベースのGEVI記録を行うため、イメージスプリッターのノブを使用して、各放出波長の画像が均等に配置されるように分割画像のサイズを調整します。次に、陰圧をかけて細胞膜を破裂させ、whole-cell構成を形成します。その後、イメージングソフトウェアを開きます。

次に、SciMeasureカメラメニューの「acquire」をクリックして、CCD撮影ページを開きます。続いて、記録を保存するための新しいデータファイルを作成します。「analog output」をクリックし、「read an ASCII」を選択してパルスプロトコルファイルを開き、イメージングを行います。

次に、「average the internal repetitions」をクリックして、試行回数の平均化を行います。その後、アナログ出力ページを閉じます。CCD取得ページで、具体的な取得パラメータを設定してください。

その後、取得するフレーム数と試行回数の具体的な値を入力します。次に、[take data optics plus BNC]ボタンをクリックして記録を開始します。電圧イメージングの実行中は、記録全般にわたってホールセル構成が安定していることを確認するため、オシロスコープをモニターしてください。

分画蛍光変化を算出するには、[file]をクリックし、[read data file]を選択して、前のステップで記録したデータファイルを開きます。右側に、静止状態の光強度における細胞画像が表示されます。次に、[show BNC's]をクリックして、現在の終端電圧値 Displays を表示します。

応答性のある光学信号を持つ画素を特定するために、ページモードをRLIフレームからフレーム差分（frame subtraction）に変更します。次に、差分処理を行うための2つの時点を選択し、膜電位の変化に応じて信号を示す細胞領域を特定します。続いて、各画素をドラッグまたはクリックして、解析が必要な画素を指定します。

選択したピクセルの平均蛍光強度のグラフ表示が、ソフトウェアウィンドウの左側に表示されます。「divide by RLI」ボタンをクリックして、差し引いたピクセルを静止光強度（RLI）で除算し、分数的蛍光変化値を算出します。データをエクスポートするには、「show BNC」メニューのチェックを外して、現在の終端電圧グラフを削除してください。

「output」へ移動し、「save traces as displayed ASCII」を選択して、曲線フィッティング解析用に蛍光トレースをASCIIファイル形式でエクスポートします。この手順では、データ解析プログラムを用いて、電圧に対する分率的な蛍光変化をプロットし、蛍光変化対電圧のグラフを作成します。その後、「analysis」、「fitting」、「sigmoidal fit」の順にクリックしてダイアログを開き、曲線をボルツマン関数にフィッティングさせることで、光学信号の電圧範囲を決定します。

データ解析プログラムを使用して、電圧に応答した正規化分率蛍光変化を再プロットします。光応答速度を算出するには、ASCIIファイルを開き、分率蛍光変化のトレースを時間に対してプロットします。次に、データ解析ソフトウェアのデータセレクターをクリックし、ステップ状の電圧パルスの開始点に対応する時間点と、光信号が定常状態に達した時間点の2点を選択します。

「analysis」、「fitting」、「exponential fit」の順にクリックし、「open dialog」を選択して、この範囲を単一指数関数および二重指数関数の両方でフィッティングし、より適合度の高い方を報告してください。この図は、単一のFPベースGEVIであるBongwooriを発現させたHEK細胞の蛍光変化を示しています。これは、ステップ状の電圧パルスに応答した典型的な蛍光変化です。

ここでは、高速CCDカメラを用いてHEK293細胞を撮像しました。この画像は、Bongwooriを発現している細胞の静止時の光強度を示しています。そして、こちらはフレーム差分画像であり、蛍光変化が観察されたピクセルを示しています。

ここでは、Bongwooriを発現するマウス海馬一次ニューロンから誘導された活動電位の光学記録を示しています。活動電位は、ホールセル電流クランプモード下で誘発されました。分画蛍光変化のトレースは、細胞体に相関する画素から選択されました。

この図では、FRETベースのGEVIを発現しているHEK細胞の蛍光変化において、2つの波長における段階的な電圧パルスへの応答を示しています。高速CCDカメラを用いて1 kHzで記録されました。この手順を試みる際は、蛍光タンパク質の過剰発現が細胞の健康状態に影響を与える可能性があるため、変動する蛍光レベルをテストすることを忘れないでください。

この手順に続き、さまざまな回路のニューロン活動に関するさらなる疑問を解決するために、スライサーコーディングなどの他の手法を実施することが可能です。このビデオを視聴することで、異なる種類のプローブを用いて膜電位をイメージングする方法について、十分に理解できるはずです。