Name: 遺伝的にコードされた蛍光電圧センサーの2種類のイメージング膜電位 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぼう、遺伝的にコードされた蛍光電圧センサーを用いた膜電位イメージング法。FRETベースプローブの比較やノイズ対策、リアルタイム神経活動可視化の実践的ノウハウを習得できます。

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この作業は、韓国教育科学技術部の助成金WCI 2009-003および韓国科学技術研究院制度プログラムプロジェクト2E24210の資金提供を受けた韓国国立研究財団のワールドクラス研究所(WCI)プログラムの支援を受けました。Sungmoo Leeは、教育省(MOE、韓国)傘下の国立研究財団(NRF)のグローバル博士フェローシッププログラム(NRF-2013H1A2A1033344)の支援を受けました。

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

神経系は、いくつかの異なる方法で電圧を使用して、阻害は、シナプス入力がわずかな脱分極および比較的大きな電圧変化における活動電位の結果を引き起こし、若干の過分極を引き起こします。 GEVIsによって膜電位の変化を測定する能力は、同時に神経回路のいくつかの成分を分析の有望な可能性を提供しています。この報告書では、GEVIsを使用して、膜電位のイメージングの変更のための基本的な方法を示しています。 電圧のイメージングの変化のための主要なキーは、原形質膜中のGEVIの効率的な発現です。細胞内発現は、プローブのSNRを低減し、応答しない蛍光を作成します。トランスフェクション条件を最適化することは非常に光学測定の一貫性を向上させます。小説GEVIをテストするとき確かに、また、光学活性の差は全くNEに起因していることを確認するために知られているプローブをテストすることをお勧めしますワットプローブと細胞のない条件。 図6は 、電圧イメージングの感度を低下させるのに内部蛍光の影響を示しているΔF/ F値。 <...

この論文の主要な焦点は、遺伝的にコード化された蛍光タンパク質を用いたin vitroでの膜電位の変化の光学イメージングを実証することです。膜電位のイメージングの変化は、神経回路の活動を研究のエキサイティングな可能性を提供しています。蛍光強度の変化、膜電位の結果の変化は、カメラの各画素は、神経活動の非侵入測定を可能にする代理電極になったとき。 40年以上にわたり、有機電位感受性色素は、1-4膜電位の変化を観察するために有用でした。しかし、これらの染料は、細胞特異性を欠きます。また、いくつかの細胞型は染色が困難です。遺伝的にコードされた電圧インジケータ（GEVIs）蛍光電位感受性プローブ​​を発現特に検討される細胞を有することにより、これらの制限を克服します。 GEVIsの3つのクラスがあります。 GEVIの最初のクラスは、VOを使用しています単一の蛍光タンパク質（FP）5-9または蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）ペア10-12のいずれかの電圧センシングホスファターゼからltage感知ドメイン。センサの第二のクラスは、蛍光指示薬直接13-15として、またはエレクトロクロミックFRET 16,17を介して微生物のロドプシンを使用しています。第三のクラスは、2つのコンポーネント、膜アンカーFPおよび膜結合消光染料18-20である第2の成分である遺伝的要素を利用しています。第二および第三のクラスは 、in vitroおよびスライス実験19,20 内のために有用であるが、センサーの唯一の最初のクラスは現在、in vivoでの 6を分析するのに有用です。 この報告では 、in vitroでGEVIsの最初のクラス（ 図1）を使用して、膜電位のイメージングを実証します。電圧センサのこの最初のクラスは、in vivoイメージングに移行するのが最も簡単です。 GEVIs U以来FPに融合された電圧センシングドメインは約センサのロドプシンクラスより明るい50倍されるtilizing、それらはむしろ非常に強力なレーザを必要とするよりも、アーク灯照明を用いて撮像することができます。明るさの格差の別の結果は、GEVIsの最初のクラスを簡単に脳の自家蛍光を超えることができるということです。ロドプシンベースのプローブはできません。センサの第三のクラスは、ファーストクラスと同じくらい明るいですが、in vivoで投与することが困難である化学消光剤の添加を必要とします。 我々は、したがって、単一のFP（Bongwoori）8とFRETペア（ナビ2）12からなるプローブとプローブの取得のデモンストレーションを行います。ナビ2.242とナビ2.244という名前の緑色蛍光ドナー、クローバーから成る11、および赤色蛍光アクセプター、mRuby2、 - VSFP-CR（クローバー-mRuby2電位感受性蛍光タンパク質）の蝶のバージョンでは、FRETがこのレポートで構築されています<s&gt; 12アップ。録音のこれらのタイプの導入は、研究者に提供できる情報GEVIsの種類のより良い理解を与える必要があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53566/53566fig1.jpg" /> 図1.この報告書 （A） で撮像された遺伝的にコードされた電圧インジケータ（GEVIs）膜貫通電圧センシングドメインおよび蛍光タンパク質を持つGEVIベースのモノFPの二種類 。 （B）の膜貫通電圧センシングドメインで構成されるFRETベースGEVI、FRETドナーとアクセプター。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53566/53566fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>60倍対物レンズ (開口数 = 1.35)</td><td>オリンパス</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>励起フィルター</td><td>Semrock</td><td>&nbsp;FF02-472/30</td><td>ボンウリの超黄道pHluorinの電圧イメージングに</td></tr><tr>ダイ<td>クロイックミラー</td><td>セムロック</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>蛍光フィルター</td><td>セムロック</td><td>FF01-497/LP</td><td></td></tr><tr><td>75W キセノンアークランプ</td><td>CAIRN</td><td>OptoSource イルミネーター</td><td>LEDやレーザーも有効光源</td></tr> 低速<tr><td>CCDカメラ</td><td>日立</td><td>KP-D20BU</td><td></td></tr><tr><td>デュアルポートカメラアダプター</td><td>オリンパス</td><td>U-DPCAD</td><td></td></tr><tr><td>高速CCDカメラ</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>イメージスプリッター</td><td>CAIRN</td><td>Optosplit 2</td><td></td></tr><tr><td>励起フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/23-25</td><td>FRETペアの電圧イメージング用 CloverとmRuby2)</td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>発光フィルター</td><td></td><td>Chroma ET520/40</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25X36</td><td></td></tr><tr><td>発光フィルター</td><td>Chroma</td><td>ET645/75</td><td></td></tr><tr><td>除振システム</td><td>キネティックシステム</td><td>250BM-IC, 5702E-3036-31</td><td></td></tr><tr><td>パッチチャンバー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>RC-26G, 64-0235</td><td></td></tr><tr><td>#0 マイクロカバーガラス (22 x 40 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-20</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>Warner instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip</td><td>Ted Pella</td><td>260366</td><td></td></tr><tr><td>Lipofection agent</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Calcium phosphate reagent</td><td>Clontech - Takara</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>パッチクランプアンプ</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USBアンプ</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルデータ収集ソフトウェア</td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td></td></tr><tr><td>画像取得・解析ソフト</td><td>RedShirtImaging</td><td>Neuroplex</td><td></td></tr><tr><td>スプレッドシートアプリケーションソフト</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel 2010</td><td></td></tr><tr><td>データ解析ソフト</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 8.6.0</td><td></td></tr><tr><td>拡大鏡</td><td>Qioptiq LINOS</td><td>Optem 標準カメラカプラー 0.38x SC38 Jクランプ</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>ニコン A1R 共焦点顕微鏡</td><td></td></tr><tr><td>アンチフェード試薬</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝的にコードされた蛍光電圧センサーの2種類のイメージング膜電位

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

遺伝的にエンコードされた電圧インジケータ(GEVI)は、in vivo記録に有用になり始めるところまで改善されました。最終的な目標はin vivoでニューロンの活動を画像化することですが、in vivoでの調製を成功させるには、単一細胞の活動を画像化できなければなりません。この手順では、単一細胞の膜電位をイメージングして、最終的にin vivoでイメージングするための基盤を提供する方法について説明します。ここでは、1つの蛍光タンパク質(FP)またはin vitroでフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)が可能な2つの蛍光タンパク質に融合した電位検出ドメインからなるGEVIのイメージング方法について説明します。イメージスプリッターを使用すると、2つの異なる波長で作成された画像を同じ電荷結合素子(CCD)カメラに同時に投影できます。イメージ スプリッターは、ライト パスに 2 番目のフィルター キューブを配置します。この 2 番目のフィルターキューブは、ダイクロイックフィルターと 2 つの蛍光フィルターで構成されており、GEVI の FP に応じてドナー蛍光波長とアクセプター蛍光波長を分離します。このセットアップにより、アクセプターとドナーの両方の蛍光パートナーを同時に記録しながら、膜電位を全細胞パッチクランプ構成で操作できます。1つのFPで構成されるGEVIを使用する場合、2番目のフィルターキューブを取り外すことで、イメージスプリッターのミラーが1つの画像をCCDカメラに投影できます。

一過性にトランスフェクトされた細胞は、有意な蛍光強度の変化と原形質膜発現の程度を示すことができます。でも同じカバースリップ上でいくつかのセルは、内部蛍光のレベルを変化させる必要があります。これは、細胞によって吸収されるトランスフェクション剤の使用量が最も可能性が高いです。時折、あまりにも多くの式は（明るい、高い内部蛍光で、細胞を四捨五入）細胞がアポトーシス27で得られた小胞体ストレス応答を体験させます。実験者は、したがって、内部表現は、信号対雑音比（SNR）を低下させる非反応性蛍光を生成するので、できるだけ内部蛍光明るい細胞および薄暗い細胞の両方をテストするために警告されます。 もう1つの考慮事項は、発色団の成熟速度である。 図3は、アクセプターchromophの蛍光の格差を示していますドナー発色団（クローバー）より長い熟成時間を持つ鉱石（mRuby2）。 <p class="jove_c...

遺伝的にコード化された電圧指標を使用して膜電位の変化をイメージングする方法が説明されています。

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

この手順の全体的な目的は、遺伝子組み換え型電圧インジケーターを用いて、膜電位の変化を光学的に報告することです。本手法では、異なる遺伝子組み換え型蛍光電圧プローブを用いたイメージングの利点と欠点について記述します。例えば、FRETベースのプローブはレシオメトリックイメージングが可能という利点がありますが、信号強度は低くなります。この手法の最大の利点は、神経活動をリアルタイムで可視化できることです。一般的に、この方法に慣れていない方は、S/N比があまり高くなく、ノイズ源が複数存在し、また不備が生じうる工程が多いため、苦労することがあります。初心者は混乱しやすく、干渉を実際の信号と見なしてしまうことがよくあります。使用しているプローブの妥当性と、それが実際に何を示しているかを確認するためには、本手法を視覚的に実証することが極めて重要です。セットアップとして、FRETベースのGEVIをイメージングするために、低速および高速のCCDカメラの間にイメージスプリッターを設置します。実験前に、ダイクロイックミラーと2つのエミッションフィルターを備えたフィルターキューブをイメージスプリッターに挿入してください。単一の蛍光タンパク質を用いたGEVIのイメージングを行う際は、この2つ目のフィルターキューブを取り除いてください。実験を開始するには、細胞内部の蛍光と比較して、膜に強く局在化した蛍光を示している健全なHEK293細胞を探します。円形の細胞は分裂中または死滅過程にあるため、パッチクランプの対象から除外してください。その後、テストパルスを印加し、電流応答を確認します。その後、パッチクランプピペットを細胞表面の直上まで下げます。次に、ピペットが細胞膜に軽く触れるまでゆっくりと下げます。このとき、膜抵抗が1〜2 MΩまで上昇することを確認します。その後、ピペットを通じて緩やかに陰圧をかけることで、ギガオームシールを形成します。ギガオームシールが形成されたら、ピペット電位を目的の保持電位に設定します。次に、高速CCDカメラの焦点を細胞体に合わせます。FRETベースのGEVI記録を行うため、イメージスプリッターのノブを使用して、各放出波長の画像が均等に配置されるように分割画像のサイズを調整します。次に、陰圧をかけて細胞膜を破裂させ、whole-cell構成を形成します。その後、イメージングソフトウェアを開きます。次に、SciMeasureカメラメニューの「acquire」をクリックして、CCD撮影ページを開きます。続いて、記録を保存するための新しいデータファイルを作成します。「analog output」をクリックし、「read an ASCII」を選択してパルスプロトコルファイルを開き、イメージングを行います。次に、「average the internal repetition

imaging-membrane-potential-with-two-types-genetically-encoded

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外部電界が細胞の膜上に電圧を誘導する、誘起膜電位は（ΔΦ）と呼ばれる。電位差染料ジ- 8 - ANEPPSを使用して、それは非侵襲的にΔΦを測定することが可能です。このビデオは、di - 8 -...

ジ- 8 - ANEPPSで誘起膜電位の測定

サブミクロンの空間とサブミリ秒の時間分解能で膜電位の変化を監視するためのイメージング技術が記載されている。電位感受性色素のレーザー励起に基づく手法では、軸索と軸索側枝、樹枝状の端子、および個々の樹状突起棘における信号の測定が可能です。...

軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

&gt;jove_content&lt;ここで説明するプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚をin...

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

ここで具体的には心室のような誘導多能性幹細胞由来心筋細胞イメージ活動電位光学的方法を提案する.メソッドは、電位感受性蛍光タンパク質のプロモーターに駆動される式に基づいています。...

人間のサブタイプに固有の光の活動電位記録誘導多能性幹細胞由来の心室心筋細胞

マウスの神経筋接合部で個々 のセル型の集団のイメージ...

Ex Vivoセル固有カルシウム マウス ダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

マウス筋細胞の単離の方法論と、同時デジタル細胞幾何学的測定と蛍光光光測定を用いたサルコメア短縮トレースと同時に電圧またはカルシウムの痕跡を得る方法を提示する。...

単離マウス心室筋細胞の光学イメージング

ここでは、高速モジュラーフォトメトリーシステムを用いた誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの作用電位の光学的獲得および特性評価について述べている。...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

このプロトコルは、膜電位の変化を測定することによって電気発生膜タンパク質を研究するための方法を記載しています。このアッセイは、上皮細胞株で内因的に発現する複数のイオンチャネルの機能的読み出しのためのプラットフォームを提供します。...

2つの上皮細胞株における2つの内因性イオンチャネルのハイスループット機能研究のための膜電位の蛍光ベースのアッセイ(英語)

遺伝子改変Tet-OnスパイキングHEK細胞におけるエレクトロポレーション誘発性活動電位生成の変化のモニタリング

学ぼう、遺伝的にコードされた蛍光電圧センサーを用いた膜電位イメージング法。FRETベースプローブの比較やノイズ対策、リアルタイム神経活動可視化の実践的ノウハウを習得できます。

遺伝的にコードされた蛍光電圧センサーの2種類のイメージング膜電位

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