スキンマイクログラフト世代の新しい脱凝集法後の組織性状

この外科的発明の全体的な目的は、創傷治癒のために同一の手術内で直ちに利用可能な自家皮膚マイクログラフトを作製することです。この手法は、慢性創傷の治癒、火傷、外傷後潰瘍など、再生医療および皮膚組織工学分野における重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、特別な技術を持たない医師でも非常に容易に使用でき、迅速かつ低コストであることです。

まず、バイオプシーパンチを使用して患者から皮膚サンプルを採取します。次に、上皮層を取り除いて廃棄します。各組織サンプルを1 milliliterの生理食塩水と混合し、自家マイクログラフトを作成します。

臨床応用に向けたバイオコンプレックスを調製するには、マイクログラフト溶液1 milliliterをコラーゲンスポンジに移行させます。直ちに、そのバイオコンプレックスを患者の患部に適用してください。in vitroで、バイオコンプレックスの生存能を試験します。

3日間の培養後、0.3%ホルマリンをバイオコンプレックスに直接注ぎ、室温で10分間固定します。ミクロトームを用いて厚さ5 µmの切片を作成し、ガラススライドに直接貼り付けます。その後、切片を15～20 mLのキシレンに3分間浸漬させます。

次に、スライスを濃度の低い順のエタノール溶液にそれぞれ1時間ずつ浸し、その後、脱イオン水に入れることで、切片の脱パラフィン化および再水和を行います。続いて、1 g/Lのヘマトキシリンを1〜2 mL使用し、1〜2分間切片を染色します。その後、水に移して染料を洗い流します。

1% エオシンYと70%エタノールの混合液を1〜2 mL用い、水で希釈して、切片を4〜5分間染色します。その後、流水でスライドを洗浄します。切片を段階的に濃度を上げたエタノールにそれぞれ1時間ずつ浸し、最後にキシレン中で1時間インキュベートします。

最後に、カバーガラスをかける前に、塩基性封入剤をサンプルに塗布します。その後、光学顕微鏡を用いて100倍の倍率で観察します。採取に関する国家規定に従い、40歳から55歳の多組織ドナー4名の体幹部から、皮膚切断機を用いて、それぞれ厚さ0.6 mm、1 mm、または0.2 mmの乳頭層、角質層、または真皮のサンプルを採取します。

サンプルを0.9%NaClに入れ、オービタルシェーカーで5分間揺らし、組織を緩やかに洗浄します。5mmの生検パンチを用いて、皮膚組織（表皮および真皮）から直径が均一なサンプルを作成し、すべての組織検体の重量を量ります。次に、組織破砕機に皮膚組織（表皮または真皮）の均一なサンプルを、それぞれ8個、3個、または4個投入し、分散させるために1.5mLの生理食塩水を加えます。

この表に従って、すべての組織サンプルの分散処理を行います。対照として、無傷の組織サンプルから得られた同数のパンチ生検試料を使用してください。機械的な分散処理後、マイクログラフトを含む生理食塩水を吸引し、各サンプルを12ウェルプレートの個別のウェルに分けて配置します。

10% FBSおよび抗生物質を添加したRPMI-1640培地を1 mLずつ各サンプルに加える。細胞生存率を評価するため、各ウェルに0.5 mg/mLのMTT溶液を含む培地を1 mL加え、37 °C、5% CO2条件下で3時間インキュベートする。インキュベーション後、MTT培地を除去し、1 mLのDMSOに置換する。

10分間インキュベートした後、DMSOに溶解した各サンプルをキュベットに移し、分光光度計を用いて570 nmにおける吸光度を測定します。細胞生存率を、570 nmにおける吸光度と、細胞分散前の組織重量（g）の比として算出します。次に、単一ドナーの皮膚組織から生理食塩水を吸引した後、表皮および真皮の各サンプルを、細胞生存率試験用の12ウェルプレートの各ウェル、または形態学的解析用の培養フラスコにそれぞれ個別に分注します。

12ウェルプレートに10% FBSおよび抗生物質を含むRPMI-1640を1 mL、または培養フラスコに5 mL加え、それぞれ37 °C、5% CO2条件下で24時間または7日間培養します。24時間後、光学顕微鏡を用いて細胞懸濁液の有無を評価し、形態学的解析を行います。7日目にも同様の操作を繰り返します。

FACS解析を用いて、CD146、CD34、CD45などの間葉系および造血系細胞マーカーに基づき、真皮サンプルの解析を行う。分散させた細胞に培地を加え、37°Cで3日間インキュベートする。その後、既述の方法に従って微生物学的解析を行い、組織の無菌性を評価する。

ここに示すように、コラーゲン支持体に即座に載せたヒト自家微小移植片を、脚部の病変部位に移植しました。その結果、30日後に組織修復に伴う完全な再上皮化が観察されました。さらに、5ヶ月後の臨床フォローアップでは、損傷部位の質感と柔軟性が良好であることが示されました。

本表に示した通り、1回のステップで処理可能な生検検体の閾値を8個、4個、および3個に設定し、良好な細胞生存率を維持するための最適な分散条件を特定するため、4つの異なる時間で組織の分散を行いました。このビデオで実演している機械的分散では、無傷の組織と比較して異なる時間で評価した際、表皮および真皮を含むすべての皮膚サンプルにおいて平均30%の細胞生存率が維持されています。このグラフは、培養開始から24時間後または7日後において、培養中のホモジナイズ時における皮膚組織サンプルの細胞生存率に、開始時と比較して実質的な変動が見られなかったことを示しています。

しかしながら、培養開始時と比較して、死細胞サンプルの生存率は培養24時間後に低下していることが観察されました。一方で、培養7日後には細胞生存率が回復しました。真皮においても同様の結果が観察されました。

この手法を習得し、適切に実施すれば、5分で完了させることができます。この手順を行う際は、皮膚から上皮層を取り除くことが重要です。この処置に続き、骨組織の分散などの他の手法を行うことで、骨の治癒メカニズムといった別の課題を検証することが可能です。

本技術の開発により、再生医療および組織工学分野の研究者が、患者における組織治癒を探索することが可能となりました。このビデオを視聴することで、このマイクログラフト処置の実施方法を十分に理解できるはずです。組織を扱う際は、極めて危険な場合があることに留意してください。

また、本手順を実施する際は、保護メガネの着用などの安全対策を常に講じてください。