スキンマイクログラフト世代の新しい脱凝集法後の組織性状
March 4th, 2016
プロトコルは、ヒト組織を脱凝集し、コラーゲンスポンジと合わせ、自家マイクログラフトを作成するには、皮膚病変の治療に使用する準備ができて、人間の生体複合体を生じさせる新しい方法を説明します。さらに、このシステムは、機械的解離後の異なる時点で、マイクロ移植片の細胞生存率を維持します。
この外科的発明の全体的な目標は、創傷治癒の目的で同じ手術ですぐに使用できる自家皮膚マイクログラフトを製造することです。この方法は、慢性創傷治癒、火傷、心的外傷後潰瘍など、再生医療および皮膚組織工学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、期待できない技術なしで医師が非常に使いやすく、同じように速くて手頃な価格であることです。
まず、生検パンチを使用して患者から皮膚サンプルを採取します。次に、上皮層を取り外して廃棄します。各組織サンプルを1ミリリットルの生理食塩水と組み合わせ、自家マイクログラフトを生成します。
臨床応用のためのバイオコンプレックスを調製するには、1ミリリットルのマイクログラフト溶液をコラーゲンスポンジに移します。すぐにバイオコンプレックスを患者の負傷した部分に塗布します。in vitroで、バイオコンプレックスの生存率をテストします。
3日間の培養後、0.3%ホルマリンをバイオコンプレックスに直接注ぎ、室温で10分間固定します。ミクロトームを使用して厚さ5マイクロメートルの切片をスライスし、スライドガラスに直接取り付けます。次に、切片を15〜20ミリリットルのキシレンに3分間入れます。
次に、スライスを減少グレードのエタノールにそれぞれ1時間浸してから、脱イオン水に入れて切片を脱パラフィンし、再水和します。次に、ヘマトキシリン1リットルあたり1グラムの1〜2ミリリットルを1〜2分間使用して、切片を染色します。そして、水に移して汚れを洗い流します。
1〜2ミリリットルの1%エオシンYと70%エタノールを水で希釈し、切片を4〜5分間染色します。次に、水道水を使用してスライドをすすぎます。切片をエタノールの濃度を上げる中でそれぞれ1時間ずつ浸漬してから、キシレンで1時間インキュベートします。
最後に、カバースリップを追加する前に、ベースの封入剤をサンプルに塗布します。その後、光学顕微鏡で100倍の倍率で観察します。ダーマイトを使用して、採取に関する国内規則に従って、40〜55歳の多組織ドナー4人の体幹領域から、それぞれ0.6ミリメートル、1ミリメートル、または0.2ミリメートルの厚さの乳頭状、死、または真皮のサンプルを採取します。
サンプルを0.9%NaClに入れ、オービタルシェーカーに5分間置いて、組織を穏やかにすすぎます。5mmの生検パンチで、皮膚組織、死体、真皮から直径が均一なサンプルを作成し、すべての組織標本の重量を量ります。次に、皮膚組織、死んだ組織または真皮の皮膚組織の8つ、3つまたは4つの均一なサンプルを組織破壊器に挿入し、脱凝集のために1.5ミリリットルの生理食塩水を追加します。
この表に示されているように、すべての組織サンプルの分解を実行します。無傷の組織サンプルから得られた対応する数のパンチ生検をコントロールとして使用します。機械的解凝集後、マイクログラフトを含む生理食塩水を吸引し、各サンプルを12ウェルプレートの1つのウェルに別々に配置します。
10%FBSと抗生物質を添加したRPMI-1640培地を各サンプルに1ミリリットル加えます。細胞生存率を評価するには、各ウェルにMTT溶液1ミリリットルあたり0.5ミリグラムを含む培地を1ミリリットル加え、摂氏37度および二酸化炭素5%で3時間インキュベートします。インキュベーション後、MTT培地を取り出し、1ミリリットルのDMSOと交換します。
10分間インキュベートした後、DMSO中の各サンプルをキュベットに移し、分光光度計を使用して570ナノメートルの光学密度を読み取ります。細胞生存率は、570ナノメートルでの吸光度と、脱凝集前に使用された組織の重量とグラムの比として計算します。次に、生理食塩水が皮膚組織、死んだサンプル、および単一のドナーからの真皮サンプルから吸引されたら、各サンプルを細胞生存率試験用の12ウェルプレートのウェルまたは形態学的分析用の培養フラスコに別々に入れます。
12ウェルプレートに10%FBSおよび抗生物質を含むRPMI-1640を1ミリリットル、または培養フラスコに5ミリリットルを、摂氏37度および二酸化炭素5%でそれぞれ24時間または7日間培養します。24時間後、光学顕微鏡を使用して、細胞懸濁液の存在を評価することにより形態学的分析を実施します。7日目に繰り返します。
FACS分析では、CD146、CD34、CD45などの間葉系および造血細胞マーカーからの真皮サンプルを分析します。分離した細胞に培地を加え、摂氏37度で3日間インキュベートします。また、前述のように微生物学的分析を行うことにより、組織の無菌性を評価します。
ここに示すように、コラーゲン支持体に直ちに負荷をかけたヒト自家マイクログラフトを脚病変に移植した。そして、組織修復に関連する完全な再上皮化が30日後に観察されました。さらに、臨床追跡調査では、5か月後の損傷領域の良好な質感と柔らかさが示されました。
この表に記載されているように、1つのステップで処理できる8つ、4つ、3つの生検の閾値が設定され、組織は4つの異なる時間に脱凝集して、良好な細胞生存率を維持するための最適な脱凝集条件を特定しました。このビデオで示されている機械的脱凝集は、無傷の組織に対して異なる時間で評価した場合、死んだ皮膚サンプルと真皮のすべての皮膚サンプルで平均30%の細胞生存率を維持します。この移植片は、24時間後、または培養7日後、開始時間と比較して、培養中の均質化時までに皮膚組織サンプルの細胞生存率の実質的な変動が観察されなかったことを示しています。
しかし、培養中の24時間後の死体サンプルの生存率は、開始時間と比較して低下することが観察されました。しかし、細胞の生存率は培養で7日後に回復しました。同様の結果が真皮についても観察されました。
このテクニックをマスターすると、適切に実行すれば5分で完了します。この手順を試みるときは、皮膚から上皮層を取り除くことを忘れないでください。この手順に続いて、骨治癒メカニズムなどの他の質問に答えるために、骨組織の解縮などの他の方法を実行できます。
その開発後、この技術は、再生医療と組織工学の分野の研究者が患者の組織治癒を探求する道を開きました。このビデオを見れば、このマイクログラフトの手順を十分に理解できるはずです。ティッシュペーパーの取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。
また、この手順を実行するときは、常に安全メガネなどの予防措置を講じる必要があります。
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概要
この記事は、創傷治癒に即座に使用できる自家皮膚マイクロ移植片を作成する新しい外科的方法を紹介します。この技術は使いやすさと手頃な価格を重視し、実践者にアクセスしやすくしています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 再生医療
- 皮膚組織工学
背景
- 慢性創傷治癒
- 火傷治療
- 外傷後潰瘍
- 移植片における細胞生存の重要性
研究目的
- 皮膚マイクロ移植片の即時使用方法を開発する
- 皮膚再生に関する理解を深める
- 創傷治癒のための実用的な解決策を提供する
使用された方法
- 生検パンチを用いて皮膚サンプルを採取する
- 上皮層の除去
- 組織サンプルと生理食塩水溶液の組み合わせ
- 自家マイクロ移植片の作成
主要な結果
- ヒト組織の成功的な解離
- マイクロ移植片における細胞生存の保存
- 即時使用のための移植片の迅速な準備
- 様々な創傷治癒シナリオにおける潜在的な応用
結論
- この方法は臨床医にとって効率的で使いやすい
- 皮膚病変治療への有望なアプローチを提供する
- さらなる研究により再生医療における応用が拡大する可能性がある
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, autologous micro-graft production for immediate clinical use in wound healing, addressing unmet needs in chronic lesion management. By preserving cell viability and sterility, it supports predictive confidence in regenerative applications. The approach offers a scalable, cost-effective solution for skin tissue engineering workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular composition in disaggregated skin tissue, including mesenchymal stem cell identification for therapeutic hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a standardized, rapid disaggregation protocol that reduces variability in primary cell isolation for target validation studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates viable, heterogeneous cell suspensions suitable for phenotypic screening and functional assays in dermal regeneration models.
- Operational Value: Produces standardized micro-grafts compatible with collagen scaffolds, enabling reproducible assay preparation for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains cell viability and sterility over seven days in culture, supporting longitudinal preclinical evaluation of graft integration and tissue repair mechanisms.
- Operational Value: Delivers ready-to-use autologous bio-complexes that bridge discovery and preclinical validation in wound healing models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid generation of characterized skin-derived cellular systems for mechanistic and translational studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell viability and multipotency in disaggregated skin tissue through flow cytometry and viability assays.
- Screening: Enables standardized preparation of micro-grafts for consistent compound evaluation in dermal regeneration assays.
- Analytics: Provides quantitative outputs including cell viability metrics (OD570 normalization) and sterility confirmation for data-driven decision-making.
- Translational Research: Maintains biological fidelity of human skin-derived cells over culture time, supporting preclinical continuity in wound healing models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable disaggregation workflow applicable to multiple tissue types (skin, dermis, de-epidermized dermis) for platform-based R&D.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through maintained cell viability and sterility, reducing mechanistic ambiguity in regenerative outcomes.
- Operational Value: Standardized, rapid (5-minute) disaggregation process with minimal technical expertise required, enhancing lab throughput.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in wound healing programs by delivering immediate-use grafts with characterized biological properties.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of regenerative candidates via reliable, scalable micro-graft production.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic tissue handling and epithelial layer removal to ensure sample integrity.
- Depends on access to tissue disruptor, centrifuge, spectrophotometer, and flow cytometry for viability and sterility assessment.
- Necessitates standardization of disaggregation time and biopsy volume across user sites to maintain consistent cell yields.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different tissue densities or donor sources.
- Limited by the need for immediate post-disaggregation processing to preserve viability, as delays may affect downstream assay consistency.
