インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの結合力および特異性を評価するための小型糖鎖マイクロアレイアッセイ

この小型糖鎖アレイの全体的な目標は、インフルエンザA型ウイルスの赤血球凝集素の特異性と結合性を解析することです。このアッセイは、インフルエンザA型ウイルス受容体の結合と結合性に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、1つのアッセイで、一般的な糖鎖アレイやプレートベースのアッセイでは通常達成できない特異性や相対的結合結合活性に対処できることです。

このプロトコールは、糖鎖サンプルの調製から始まります。グリカンのベース溶液はストックプリンティングバッファーで、これを作製したら、pH 8.5 までゆっくりと滴定し、界面活性剤を添加する必要があります。調製したプリンティングバッファーを使用して、PAA標識グリカンを100 μg/mLに希釈します。

次に、プリンティングバッファー内でも一価糖鎖を100マイクロモルに希釈します。最後に、アミン官能基化染料のワーキングストックを1マイクロモルで作製します。次に、各糖鎖サンプルの10マイクロリットルを384ウェルマイクロタイタープレートのウェルにロードします。

これは、5枚のスライドを印刷するのに十分なソリューションです。また、10マイクロリットルの染料マーカーを印刷版の1つのウェルに移します。配列を印刷する準備をします。まず、配列のピンと印刷ヘッドをレイアウトに従って配置します。

この場合、1つのピンですべてのサンプルを印刷できます。糖鎖の配列は、四方に空きスポットで囲まれた 6 つのブロックで印刷されます。スライドを扱うために手袋を着用してください。

それらを開梱し、超高純度窒素ガスで表面から破片を吹き飛ばします。次に、スライドをコーティング面を上にしてアレイアーステージに配置します。次に、アレイヤーをプログラムします。

この場合、ソースプレートへの訪問ごとに 27 個のスポットをプログラムします。ポリ-L-リジンコーティングスライドの非アレイ領域に配置された3つのプレスポットを使用して、ピンの先端にある余分な液体を除去します。ピン訪問あたりの他の 24 個のスポットは、4 つのレプリケート アレイに 6 つのスポットを配置するために使用されます。

詳細はテキストプロトコルで提供されます。次に、マルチウェルプレートをプリンターにロードし、アレイの印刷を開始します。印刷中は、湿度が55〜65%の間にあることを確認してくださいポリ-L-リジンコーティングされたスライドのプレスポットの外観に注意してください。

印刷後、各スライドを目視検査します。テフロン境界内のスポットの正しい位置合わせを確認し、これは非常に重要です、そしてスポットされた特徴の正しい数を確認してください。ドットの付着を均質化するために、印刷されたスライドは、作成された直後に印刷された面を上にして100%湿度のチャンバーに入れます。

濡れたペーパータオルを使用して、コンテナと間に合わせのラックを裏打ちします。チャンバーをプラスチックで包み、湿気を閉じ込めます。30分後、スライドを取り外します。

次に、耐溶剤性マーカーでスライドに番号を付け、乾燥ボックスに一晩保管します。翌日、激しく攪拌しながらブロッキングバッファーの新鮮なストックを準備します。濃水酸化ナトリウムを使用してpHを9.2に調整します。

次に、スライドをバッファー内で1時間インキュベートします。ブロックを取り外すには、スライドを二重蒸留水ですすいでください。次に、スライドをガラス染色ホルダーに移し、ホルダーをスイングプレートホルダーにロードして、スライドを10Gで5分間乾燥させます。

乾いたら、必要に応じてスライドをマイナス20°Cで密封したビニール袋に保管します。準備として、以前と同様に別の加湿チャンバーを作成します。固定化された糖鎖を検出するには、プロービングバッファーに 10 μg/mL の SNA および ECA ビオチン化レクチンを調製し、各希釈液に 1mL あたり 2 マイクログラムのストレプトアビジン 555 を添加します。

ヘマグルチニンで染色するには、テキストプロトコルに記載されているように、ブロッキングバッファー中のプレコンプレックス抗体の溶液を4対2対1のモル比で1ミリリットルあたり20マイクログラムの溶液にします。調製した溶液20マイクロリットルを384ウェルプレートのウェルに移します。次に、レクチンとヘマグルチニンを適切なバッファーで1対1で連続希釈します。

8回の希釈を行い、各ウェルに10マイクロリットルのサンプルと10マイクロリットルのバッファーを充填します。次に、プレートを氷上で30分間インキュベートします。次に、各希釈液の8マイクロリットルを、印刷されたスライド上の48個のマイクロウェルの1つに加えます。

次に、調製したスライドを加湿チャンバーで90分間インキュベートします。90分後、スライドを端から持ったままスライドを洗います。PBS-Tに4回浸し、次にPBSに4回浸し、最後に脱イオン水に4回浸します。次に、前と同じようにスライドをスピンドライします。

スピンドライ後、すぐにスライドをスキャンします。スライドを正しい向きでスキャナーに慎重にロードしてください。5ミリワットの低レーザー出力を使用してスライドを繰り返しスキャンし、ゲインを25%から75%に徐々に増やしながら、スキャン設定を最適化しながら、スキャンを繰り返すと蛍光色素が漂白することに注意してください。

関連ソフトウェアを使用して、結合信号のために保存された画像を解析します。スポッティングパターンを持つ配列リストをロードできます。スキャンに重ねて、グリッドマーカーの配置をナビゲートするのに役立ちます。

次に、ソフトウェアを使用してスポット強度を分析し、結果をタブ区切りのテキストファイルとして保存して、スプレッドシートやその他の統計パッケージにエクスポートします。平均信号強度からバックグラウンドを差し引いた値を計算して、データを解析します。各サンプルの 6 つのレプリケートスポットのうち 4 つを平均し、最も高い信号と最も低い信号を除外します。

次に、8つのタンパク質濃度に対する平均平均シグナルからバックグラウンドを差し引いた折れ線グラフを作成します。結果の線を非線形回帰を使用して平滑化します。PAAアレイは、インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの受容体結合特異性を評価するために使用されました。

アレイには、同じマイクロウェルに非シアル化コントロールが含まれていました。プリントされた化合物に対する特異性がわかっている植物レクチンをポジティブコントロールとして使用しました。末端ガラクトースβ1-4に結合したECAレクチンはアナセチルグルコサミンに結合し、末端ガラクトースがシアル酸でキャップされている場合、同じ化合物に結合しなかった。

α 2-6結合シアル酸の試験には、SNAレクチンを用いた。予想通り、SNAはα 2-6結合型シアル酸にのみ結合していましたが、PAA結合色素と非PAA結合色素lacNAcリピートに対する親和性には顕著な違いがありました。次に、α 2-3結合シアル酸のみを認識するVietnam/1203/04ウイルス由来のH5ヘマグルチニンを試験しました。

H5ヘマグルチニンの結合プロファイルは、PAA結合構造に対してより高い結合性で予想される特異性を示しました。最後に、ヒト季節性H1N1株由来のH1ヘマグルチニンを試験しました。予想通り、このヘマグルチニンはα 2-6結合シアル酸含有構造にのみ結合していました。

この手法を習得すれば、1回のアッセイでインフルエンザウイルスの結合特異性と相対的な結合性を明らかにすることができます。この技術は、インフルエンザ結合アッセイの効率を大幅に向上させるだけでなく、貴重な生物製剤の消費を削減します。