インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの結合力および特異性を評価するための小型糖鎖マイクロアレイアッセイ

この小型化された糖鎖アレイの全体的な目的は、インフルエンザAウイルスヘマグルチニンの特異性と親和性（アビディティ）を解析することです。このアッセイは、インフルエンザAウイルスの受容体結合および親和性に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、単一のアッセイ内で特異性と相対的な結合親和性の両方を検討できることであり、これは一般的な糖鎖アレイやプレートベースのアッセイでは通常達成できないことです。

このプロトコルは、グリカンサンプルの調製から始まります。グリカンのベース溶液にはストックプリントバッファーを使用します。このバッファーを調製する際は、ゆっくりと滴定してpH 8.5に調整し、その後、界面活性剤を添加してください。調製したプリントバッファーを用いて、PAA結合グリカンを100 µg/mLに希釈します。

次に、一価のグリカンをプリンティングバッファーで100 µMに希釈します。最後に、アミン官能基化染料のワーキングストックを1 µMで調製します。これで、各グリカンサンプル10 µLを384ウェルマイクロタイタープレートのウェルに分注します。

これでスライド5枚分をプリントするのに十分な溶液量となります。また、ダイマーカー10 µLをプリンティングプレートの1ウェルに移します。まず、レイアウトに従ってアレイヤーピンとプリントヘッドを配置し、アレイのプリント準備を行います。

このケースでは、1本のピンですべてのサンプルをプリントできます。グリカンアレイは、周囲を空いたスポットで囲まれた6つずつのブロック単位でプリントされます。スライドを扱う際は、手袋を着用してください。

それらを取り出し、超高純度窒素ガスを用いて表面のゴミを吹き飛ばします。次に、スライドのコーティング面を上にしてアレイヤーのステージに配置します。その後、アレイヤーにプログラムを設定します。

このケースでは、ソースプレートへの1回のアクセスあたり27スポットをプログラムします。ポリL-リジンコートスライドの非アレイ領域に配置された3つのプリスポットは、ピンの先端に付着した過剰な液体を除去するために使用されます。1回のピンアクセスあたりの残りの24スポットは、4つの複製アレイに6スポットずつ配置するために使用されます。

詳細はテキストプロトコルに記載されています。次に、マルチウェルプレートをプリンターにロードし、アレイの印刷を開始します。印刷中は、湿度が55〜65%の間に保たれていることを確認してください。ポリL-リシンコートスライド上のプレスポットの外観に注意してください。

プリント後、各スライドを目視で検査します。テフロンの境界線内においてスポットが正しく配置されているかを確認してください。これは非常に重要です。また、スポットされたフィーチャーの数が正しいかを確認します。ドットの付着を均質化させるため、プリント直後にプリント面を上にして、湿度100%のチャンバーにスライドを入れてください。

濡らしたペーパータオルで容器と簡易ラックを敷き詰めます。湿気を保持するため、チャンバーをプラスチックで覆います。30分後、スライドを取り出します。

次に、耐溶剤性マーカーでスライドに番号を付け、デシケーターに入れて一晩保存します。翌日、激しく撹拌してブロッキングバッファーの新しいストック液を調製します。濃水酸化ナトリウムを用いて、pHを9.2に調整します。

次に、スライドをバッファー中で1時間インキュベートします。ブロッキング剤を除去するため、スライドを二回蒸留水で洗浄します。その後、スライドをガラス製染色ホルダーに移し、ホルダーをスイングプレートホルダーにセットして、10 Gで5分間遠心分離してスライドを乾燥させます。

乾燥後、必要に応じてスライドを密封したプラスチック袋に入れ、-20°Cで保存します。準備として、前述と同様に加湿チャンバーをもう一つ作成します。固定化したグリカンを検出するため、プローブバッファーを用いてSNAおよびECAビオチン化レクチンを10 µg/mLに調製し、各希釈液に2 µg/mLのstreptavidin 555を添加します。

ヘマグルチニンで染色するには、本文のプロトコルに従い、ブロッキングバッファーを用いて、4:2:1のモル比でプレコンプレックス抗体の20 µg/mL溶液を作成します。調製した溶液20 µLを384ウェルプレートのウェルに分注します。次に、レクチンとヘマグルチニンを、それぞれの適切なバッファーで1:1の比率で連続希釈します。

試料10 µLとバッファー10 µLを各ウェルに満たし、8段階の希釈系列を作成します。次に、プレートを氷上で30分間インキュベートします。その後、各希釈液8 µLをプリントスライド上の48個のマイクロウェルのいずれかに加えます。

次に、準備したスライドを加湿チャンバー内で90分間インキュベートします。90分後、スライドの端を持って洗浄します。PBS-Tに4回浸し、続いてPBSに4回浸し、最後に脱イオン水に4回浸します。その後、前と同様にスライドをスピン乾燥させます。

スピン乾燥後、直ちにスライドをスキャンします。スライドを正しい向きで慎重にスキャナーにセットしてください。5 mWの低レーザー出力を用い、ゲインを25%から75%まで段階的に上げながら、繰り返しスキャンを行います。スキャン設定を最適化する際は、繰り返しのスキャンによって蛍光色素が退色することに注意してください。

付属のソフトウェアを使用して、保存された画像を解析し、結合シグナルを確認します。スポッティングパターンを含むアレイリストを読み込むことができます。これをスキャン画像に重ね合わせることで、グリッドマーカーの配置を確認しながら操作しやすくなります。

次に、ソフトウェアを使用してスポット強度を解析し、結果をタブ区切りテキストファイルとして保存して、スプレッドシートやその他の統計パッケージにエクスポートします。平均信号強度からバックグラウンドを差し引いてデータを解析します。各サンプルの6つの繰り返しスポットのうち、最大信号と最小信号を除いた4つのスポットの平均値を算出します。

次に、8つのタンパク質濃度に対して、平均信号からバックグラウンドを差し引いた値の折れ線グラフを作成します。得られた線は、非線形回帰を用いて平滑化します。PAAアレイは、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンの受容体結合特異性を評価するために使用されました。

このアレイには、同一のマイクロウェル内に非シアリル化コントロールが含まれていました。プリントされた化合物の既知の特異性を持つ植物レクチンをポジティブコントロールとして使用しました。ECAレクチンは、N-アセチルグルコサミンにβ1-4結合した末端ガラクトースに結合し、末端ガラクトースがシアル酸でキャップされている場合は同じ化合物に結合しませんでした。

α2-6結合シアル酸をテストするために、SNAレクチンを使用した。予想通り、SNAはα2-6結合シアル酸にのみ結合したが、PAA結合型と非PAA結合型のdye lacNAcリピートに対しては、親和性に顕著な差が見られた。次に、α2-3結合シアル酸のみを認識するVietnam/1203/04ウイルス由来のH5ヘマグルチニンをテストした。

H5ヘマグルチニンの結合プロファイルは、PAA結合構造に対してより高い親和性を示すという、想定通りの特異性を示しました。最後に、ヒト季節性H1N1株由来のH1ヘマグルチニンについて試験を行いました。予想通り、このヘマグルチニンはα 2-6結合シアル酸含有構造にのみ結合しました。

この手法を習得すれば、単一のアッセイでインフルエンザウイルスの結合特異性と相対的なアビディティを明らかにすることができます。本手法は、インフルエンザ結合アッセイの効率を大幅に向上させると同時に、貴重な生物学的試料の消費量を削減することを可能にします。