インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

この手順の目的は、感染したマウスの気道内におけるインフルエンザウイルスの力価を効率的に定量化することです。マウスには、感染後の特定の時点で、インフルエンザウイルスを鼻腔内に接種します。

マウスを安楽死させ、気管支肺胞洗浄液（BAL液）を回収します。次に、このBAL液を用いてMDCK細胞に感染させます。感染した細胞を、特異的な一次抗体およびそれに続く赤外線標識二次抗体を用いて染色し、ウイルス蛋白質の存在を確認できます。

赤外線信号はLycor Odysseyスキャナーを用いて読み取り、Odysseyソフトウェアを使用してウイルス力価を決定できます。標準曲線を用いることで、ウイルス力価の定量的な決定が可能です。既存の手法と比較した本手法の主な利点は、ウイルス力価の精密な定量、再現性、および本アッセイの実施に必要な液量が少量であることです。

この手法を適用することで、臨床検体中のウイルス価を定量できるため、さまざまな呼吸器系ウイルス疾患の診断や治療への応用が期待されます。この手順の後、ウイルスのコピー数などの追加的な疑問を解消するために、qPCRなどの他の手法を実施することが可能です。本手法を試みる際は、この工程の後にタイター標準コントロールウイルスを確認することを忘れないでください。

この手法は、ウイルス論分野の研究者が臨床検体におけるウイルス力価を探索したり、ウイルス蛋白質をtwist染色したりするための道を切り開くものです。一度習得すれば、この手法は17時間で完了させることができます。具体的には、まず、PR8インフルエンザウイルス5,000 plaque-forming units（PFU）を30 µLの滅菌PBSに懸濁させてマウスの鼻腔内に接種するか、あるいは陰性対照としてPBSのみを接種します。安楽死させた動物からBAL液を回収するには、まず、滅菌された微細鋏を用いて胸腔を開き、気管を露出させるために気管と平行に1 cmの切開を加えます。

気管に小さな切開を加え、PBSを含む1%BSAを0.5 milliliters注入し、洗浄液を穏やかに吸引します。洗浄液中のウイルス力価を定量するため、BAL液を-20 °Cで保存します。まず、T 75フラスコを用いて5 millionのMDCK細胞を20 millilitersの完全RPMIで37 °Cにて一晩培養します。翌日、細胞を回収し、光学用平底黒色96ウェルプレートに1ウェルあたり10,000 cellsの密度で播種します。

その後、プレートを37°Cで一晩インキュベートします。インキュベーション後、上清を穏やかに吸引し、FBSの代わりに0.2% BSAを含む完全ですが血清不含のDMEMで細胞を2回洗浄します。細胞の洗浄後、各ウェルに50 µLのBAL液、または既知濃度のウイルスを含む懸濁液50 µLを添加します。

次に、ウイルスの付着、進入、および複製を促進するため、0.2 µg/mLのTPCK処理トリプシンを含むDMEM培地を1ウェルあたり50 µLずつ加えます。ウイルスを吸着させるため、細胞を37 °Cで1時間インキュベートします。その後、各ウェルに完全RPMIを含むFBSを100 µL加え、一晩培養して感染を増殖させます。一晩のインキュベーション後、次の工程へ進みます。

1% B-S-A-P-B-S 100 µLで細胞を洗浄します。洗浄後、1% パラホルムアルデヒドを1ウェルあたり100 µL加え、室温で5分間インキュベートして細胞を固定します。次に、1% B-S-A-P-B-S 100 µL/ウェルで洗浄し、ブロッキングのためさらに30分間インキュベートします。ブロッキング完了後、1:1000に希釈した一次抗ウイルスM2抗体を1ウェルあたり50 µL加え、室温で1時間インキュベートして、存在するウイルスタンパク質を染色します。インキュベート後、1% B-S-A-P-B-Sで細胞を3回洗浄し、1:200に希釈した赤外線色素標識二次抗体 100 µL/ウェルを用いて、暗所で室温で1時間インキュベートします。染色完了後、前述と同様に3回洗浄します。

次に、プレートをLicor Odyssey赤外線スキャナーの読み取りガラスプラットフォーム上に配置します。Licor Odysseyソフトウェアを使用して、リーダーの96ウェルプレート設定を選択してください。ブランク陰性対照ウェルを特定し、プレート全体の蛍光を定量します。

オートシェイプツールを使用して、テストウェルの中央に関心領域（ROI）を描画します。アッセイのベースライン蛍光値を設定するために、ネガティブコントロールのウェルからROIを設定し、次にOdysseyソフトウェアで提供される2つの対向する十字線をROI内に導入して、ウェル全体の蛍光強度を測定します。

次に、検出用に780 nmチャンネルを、参照波長として680 nmを使用してプレートをスキャンします。リードコマンドを起動すると、ROI内の等間隔で蛍光強度が測定されます。その後、収集されたデータポイントが統合されます。

標準偏差倍率によって、ROIに含まれるベースライン上の信号レベルが決定されます。計算には、サイズに関わらず定義された領域の正味のピクセル体積を示す「integrated intensity（積分強度）」オプションを必ず選択してください。背景蛍光は擬似感染コントロールから定量し、テストウェルの積分強度の推定に使用します。力価測定済みウイルスの連続希釈液を含むデュプリケートウェルの赤外蛍光を用いて、標準曲線を作成します。

この標準曲線を用いて、感染マウスから採取したBAL液の力価を決定できます。本実験では、2日目と4日目にウイルス量の有意な増加が観察されました。ここに示されているように、感染後のウイルスは10日目までに消失しました。

本アッセイを用いて測定したウイルス力価は、感染後のマウスの体重減少と良好な相関を示します。この手法はヒトの検体にも適用可能です。ここでは、ヒトの鼻腔スワブから採取したH1N1ウイルスの定量結果を示しています。

ここでの検出限界は10³ TCID（組織培養感染量）です。このビデオを視聴することで、赤外線色素を用いたアッセイによるインフルエンザウイルスの力価推定方法について、十分な理解を得ることができます。Core imagerの使用は困難な場合があるため、この手法を視覚的に実演することは非常に重要であり、96ウェルまたは384ウェルプレートにおけるウイルス力価の定量方法を簡略化し、提示するのに役立ちます。

最後に、ウイルスを扱う作業は極めて危険である可能性があるため、本手順を実施する際は、個人用保護具（PPE）などの予防措置を必ず講じてください。