インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

この手順の全体的な目標は、感染したマウスの気道にあるインフルエンザウイルス力価を効率的に定量化することです。マウスは、最初に選択された時間にインフルエンザウイルスを鼻腔内に接種されます。感染後のポイント。

Mを犠牲にし、気管支肺胞洗浄液またはBAL液を採取します。次に、BAL液を使用してMDCK細胞に感染します。その後、感染した細胞を特異的な一次抗体を用いてウイルスタンパク質の存在を染色し、続いて赤外線標識二次抗体を用いて染色することができます。

赤外線信号はLycor Odysseyスキャナーを使用して読み取り、Odysseyソフトウェアを使用してウイルス力価を決定できます。標準曲線を使用して、ウイルス力価の定量的測定を得ることができます。既存の方法と比較した場合のこの手法の主な利点は、ウイルス力価の正確な定量、再現性、およびこのアッセイの実行に必要な少量です。

この手法の意味は、この手順に続いて臨床サンプルのウイルス力価を定量化するために使用できるため、さまざまな呼吸器ウイルス性疾患の診断と治療に向けて拡張できます。QPCRのような他の方法は、ウイルスのコピー数などの追加の質問に答えるために実行できます。この手法を試みる際には、この開発後に力価標準制御ウイルスを確認することを忘れないでください。

この手法は、ウイルスロジックの分野の研究者が、臨床サンプル中のウイルス力価を探索したり、ウイルスタンパク質をねじったりするための道筋となります。このテクニックをマスターすると、17時間で実行できます。それは正確に行いました 5, 000プラットホームユニットまたはPR 8インフルエンザウイルスのPFUを30マイクロリットルの滅菌PBSまたはPBS単独で、安楽死させた動物からのBAL流体収集のネガティブコントロールとして最初に、胸腔が開いて気管と平行に1センチの切開を行い、細かい滅菌ハサミでそれを露出させることで、マウスを鼻腔内に感染させます。

気管に小さな切開を行い、PBSを含む0.5ミリリットルの1%BSAを気管に注入し、洗浄液を静かに吸引します。BAL液をマイナス20°Cで保存し、洗浄液中のウイルス力価を定量化します。まず、翌日、T 75フラスコで37°Cで一晩、完全なRPMIの20ミリリットルで500万MDCK細胞を培養し、細胞を収穫し、1ウェルあたり10, 000細胞で光学平底黒96ウェルプレートにそれらをプレートします。

次に、インキュベーション後、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。上清を穏やかに吸引し、FBSの代わりに0.2%BSAを含む完全で無血清のDMEMで細胞を2回洗浄します。細胞を洗浄したら、ウェルごとに50マイクロリットルのBAL液または既知の濃度のウイルスを含む懸濁液50マイクロリットルを追加します。

次に、ウイルスの付着、侵入、複製を強化するために、TPCK処理されたトリプシンをミリリットルあたり0.2マイクログラムで処理した培地であるDMEMのウェルあたり50マイクロリットルを追加します。細胞を摂氏37度で1時間インキュベートして、ウイルスが吸収できるようにします。次に、完全なRPMIを含む100マイクロリットルのFBSを各ウェルに加え、細胞を一晩培養して、一晩のインキュベーション後に感染が伝播するのを待ちます。

細胞を100マイクロリットルの1%B-S-A-P-B-Sで洗浄します。細胞を洗浄したら、1ウェルあたり100マイクロリットルの1%パラホルムアルデヒドを加え、プレートを室温で5分間インキュベートして細胞を固定します次に、1%B-S-A-P-B-Sのウェルあたり100マイクロリットルで洗浄し、さらに30分間細胞をインキュベートしてブロッキングします。細胞をブロックした後、1〜1000で希釈した一次抗ウイルスM 2抗体をウェルあたり50マイクロリットル加え、プレートを室温で1時間インキュベートしてインキュベーション後に存在するウイルスタンパク質を染色し、細胞を1%B-S-A-P-B-Sで3回洗浄し、1ウェルあたり100マイクロリットルの赤外線色素標識二次抗体で室温で1〜200希釈でインキュベートします暗所で細胞を染色したら、前回と同様に3回洗ってください。

次に、プレートをLicor Odyssey赤外線スキャナーの読書用ガラスプラットフォームに配置します。Licor Odysseyソフトウェアを使用して、リーダーで96ウェルプレートの設定を選択します。ブランクネガティブコントロールウェルを同定し、プレート全体からの蛍光を定量します。

自動整形ツールを使用して、テストの途中で関心領域またはROIを描画します。ネガティブコントロールからのROIをうまく利用します。さて、アッセイのベースライン蛍光値を設定するには、Odysseyソフトウェアによって提供される2つの対向する十字線をROI内に導入して、ウェル全体の蛍光強度を測定します。

次に、検出用の780ナノメートルチャネルと参照波長として680ナノメートルを使用してプレートをスキャンします。読み取りコマンドがアクティブになると、ROIの等間隔での蛍光強度が測定されます。そして、収集されたデータポイントが統合されました。

標準偏差乗数は、ROIに含まれるベースライン上の信号のレベルを決定します。これは、サイズとは無関係に定義された領域の正味ピクセルボリュームを表すため、計算には統合強度オプションを選択してください。バックグラウンド蛍光は、模擬感染コントロールから定量化され、テストウェルの統合強度を推定するために使用されます。滴定ウイルスの段階希釈液を含む重複ウェルからの赤外蛍光を使用して、標準曲線を作成します。

次に、標準曲線を使用して、感染したマウスのBAL液の力価を決定できます。この実験では、2日目と4日目にウイルス量の有意な増加が観察されました。ここに示すように、感染後のウイルスは10日目までに除去されました。

このアッセイを用いて測定されたウイルス力価は、感染後のマウスの体重減少とよく相関しています。この手法は、人間のサンプルにも適用できます。ここに示されているのは、ヒト鼻腔スワブからのH one N oneウイルスの定量化です。

ここでの検出限界は、10から3番目のTCIDまたは組織培養感染用量です。このビデオを見た後、赤外線ダイベースのアッセイを使用してインフルエンザウイルスの力価を推定する方法についても十分に理解できます。corpイメージャーの使用は困難であり、96ウェルプレートまたは384ウェルプレートのウイルス力価を定量する方法を簡素化し、実証するのに役立つため、この手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。

そして最後に、ウイルスを扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、個人用保護具などの前駆体を常に服用する必要があることを忘れないでください。