ホールマウントによるゼブラフィッシュ胚標本ステンドの観察および分析のためのフラットマウントの準備その場でハイブリダイゼーション

この手順の全体的な目標は、初期発生時点で染色された固定ゼブラフィッシュの胚をよりよく視覚化することです。これは、最初にC2ハイブリダイゼーションのホームマウントを使用してゼブラフィッシュの胚を染色することによって達成されます。次に、胚をフラットマウントするために選択し、中央を切開して卵黄に一対の細い鉗子で入れ、次にまつげツールを使用して残りの卵黄顆粒を優しくこすり落とし、除去します。

最後に、胚をスライド上にグリセロールにマウントして、標本の適切なイメージングを可能にします。最終的に、フラットマウントは、卵黄を取り出し、胚を2次元製剤に配置することにより、背側から染色された胚をよりよく視覚化することができます。この技術の主な利点は、若い発生段階で無傷の胚をイメージングするなどの既存の方法よりも優れている点は、フラットマウントにより卵黄袋が除去され、胚全体を見ることができることです。

この方法は、胚における腎臓のプレジェンダーフィールドのドメインを特徴付けるなど、発生フィールドの主要な質問に答えるのに役立ちます。一般に、この方法に不慣れな人は、この技術が胚の繊細な取り扱いを必要とするため、また、卵黄袋を取り除くために必要な適切な量の圧力を学ぶのに時間がかかる可能性があるため、苦労します。この手順を実演するのは、私、ゾーイ、そしてウィンガー研究室の大学院生であるアマンダです。

胚を採取、固定、染色した後、テキストプロトコルに従って、1つのX-P-B-S-Tでフラットマウントする胚を選択します。胚をプラスチックまたはガラスのペトリ皿に移します。次に、皿を実体顕微鏡で観察し、細い鉗子を使用して胚を転がし、頭と尾の端が見える横方向のビューが得られるようにします。

次に、細い鉗子を使用して胚を安定させ、2番目のセットを使用して、胚の頭と尾の中央に位置する位置で卵黄を切開します。次に、細い鉗子で、オークの細胞腔から卵黄をすくい取ります。1つのX-P-B-S-Tを使用して、1つのXPBSの1〜2滴を使用して、胚から浮遊卵黄を洗い流します。

胚を平らなスライドガラスに移します。胚をバッファーの端までドラッグして、スライドガラスに対して平らな位置に留まります。胚を固定しながら、まつげツールを使用して腹側表面を優しくこすり、卵黄の顆粒を取り除きます。

PBST溶液が過剰な卵黄で散らかったり、蒸発し始めたら、1〜2滴の新鮮な滴を加えて、胚をこの新鮮な緩衝液に引きずり込みます。卵黄が十分に除去されたら、胚をPBSTのペトリ皿にそっと戻し、最後のすすぎを行います。次に、胚を100%グリセロールを含むシャーレに移し、5分間インキュベートします。

胚をスライドガラスに取り付けるには、胚をきれいなガラスに移します。100%グリセロールを1〜2滴スライドさせ、腹側卵黄側をスライドガラスに向けます。まつげツールを使用して、胚をグリセロールドロップの端までドラッグして、スライドに対して平らな位置に留まります。

胚軸が湾曲している場合は、細い鉗子を使用して残りの卵黄に小さな切開を行い、張力を緩和して平らに配置できるようにします。スライド上。18 x 18ガラスカバースリップの四隅にモデリング粘土の小さなくぼみを置きます。

カバースリップを胚にゆっくりと置き、カバースリップを傾けて、グリセロール内の気泡を最小限に抑えます。最後に、カバースリップの側面に100%グリセロールを一滴加えてガラス間のスペースを埋め、ドリフトをなくすために、ステレオ顕微鏡または複合顕微鏡を使用してここに示す画像を作成します。プローブの組み合わせは、腎臓を生じさせる発達中の腎臓前駆細胞をラベル付けするための2色の願いとともに使用され、胚は早期に平らに取り付けられました。

したがって、ダニの段階では、腎前駆細胞は、赤で示されたデルタCを同時発現するパリアル中胚葉を囲むPAX 2つのA転写産物の発現によってU字型のパターンで区切られます。デルタCをC crox 20と共標識したところ、PAX two a、SLC four A four、SLC 12 A three、およびS-M-Y-H-C one at 14の発現を分析するデルタCを発現する腎前駆細胞の吻側サブドメインが明らかになった。したがって、ダニ病期は、PAX 2 Aによる腎前駆細胞ドメイン全体のマッピングを可能にし、吻側サブドメインの細胞のサブセットがSLC four A fourを発現していることを明らかにしました。

これは、SLC 12 A threeを発現する腎前駆細胞のcoddleサブドメインと重複しませんでした。この図では、レチノイン酸の生合成に必要なレチンレチナールデヒドデヒドロゲナーゼ2遺伝子、またはDEABおよびALD H阻害剤で処理された胚に変異を持つ胚は、それぞれWT1つのAの発現を減少または無効化して開発され、フラットマウント調製物による2色のウィッシュが器官形成中の細胞ドメインの研究に価値があることを示しています。遺伝子変異のあるゼブラフィッシュや、小分子に化学的に曝露された場合 この手法は、一度習得すると、適切に実行すれば10分から15分かかることがあります。

この手順に続いて、イメージングなどの他の方法を実行して、腎臓セグメントの境界がどこにあるかなどの追加の質問に答えることができます。ビデオを見た後、卵黄の除去によって目的の構造をよりよく視覚化するために、染色されたゼブラフィッシュの胚を平らに取り付ける方法をよく理解しているはずです。