Name: ホールマウントによるゼブラフィッシュ胚標本ステンドの観察および分析のためのフラットマウントの準備その場でハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚のフラットマウント技術。WISH染色後、卵黄を除去して背側からの観察を可能にし、腎臓前駆細胞などの器官形成過程を詳細に解析する方法を解説します。

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この研究の一部は、以下のそれぞれからRAWに資金によってサポートされていました：NIHの助成金K01 DK083512、DP2 OD008470、およびR01 DK100237;ダイムバジルオコナースターターScholarの助成賞＃5-FY12-75年の3月。科学と生物科学専攻のノートルダム大学の大学から資金を起動してください。我々は特に、幹細胞研究促進するノートルダム大学に寛大な贈り物を与えられた全ギャラガー家族と一緒に、エリザベスとマイケル·ギャラガーに感謝したいと思います。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割がありませんでした。私たちは、ゼブラフィッシュのコロニー·福祉での顕著な献身のために彼らのサポートのために生物科学の部門のスタッフに感謝し、ノートルダム寺院でのゼブラフィッシュ研究センター。最後に、私たちは、彼らのコメント、議論や、この作品についての洞察のために私たちの研究室のメンバーに感謝だけでなく、マリーゴールド（Maripooka）およびジニアWingert研究のための最も優れたラッシュのツールを作るためにネコウィスカーを流し、自然に提供するため。

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ゼブラフィッシュは、ここ数年の間に、研究コミュニティ全体に非常に貴重なモデル生物であることが証明された。ゼブラフィッシュは、高等脊椎動物のそれと遺伝的保全の実質的な程度を示し、彼らの解剖学、繁殖、およびライフサイクルに関連する利点は、実験解析へのこの種は非常に従順にする。さらに、ゼブラフィッシュに適用できる分子技術の進歩は、さらに科学的研究で、このモデル生物の使用を推進してきました。例えば、トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の多種多様な疾患の進行を研究すると、器官形成などの開発の重要なメカニズムの基礎となる多くの基本的な質問に答えるために生成されています。 したがって、病気や発達研究の両面でのゼブラフィッシュの動的な使用に基づいて、細胞標識の方法論と信号定量化は、データ分析の重要な側面である。しばらく蛍光ANを利用する方法tibodiesトランスジェニックゼブラフィッシュにおけるタンパク質発現を検出するために使用することができ、研究者は、典型的には固定され、非トランスジェニックゼブラフィッシュ試料中の遺伝子転写の時空間的局在を調べるためにWISH 12-16のような標準的な手順に依存している。実際には、WISH 16は、生物学において最も広く使用される技術の一つであり、遺伝子変異、遺伝的および化学的摂動の表現型を特徴付けるために使用される重要なツールである。それにもかかわらず、願いが潜在的な落とし穴や課題の数に関連している。アンチセンスribroprobeの特異性を確認するために、センスリボプローブは、アンチセンスリボプローブ染色パターンの特異性を評価するための対照として使用することができる。セクション4及び5は、標識およびフルオレセイン標識プローブ、続いてジゴキシゲニン標識プローブの検出の順序で提示されているが、この順序を逆にすることもできる。典型的には、弱い信号（低い発現レベルを有する遺伝子）が最高のジゴキシゲニン標識プローブと、この染色で検出される検出と赤の基板を用いた強い信号（より豊富に発現された遺伝子）の染色に続いて紫色の基板で最初に開発しました。二色反応が行われようとしている場合は、その標識および基質の様々な組合せは、データ収集および分析のために最も適している手順を見つけるためにテストされることをお勧めします。また、セクション4-5に提供される抗体のインキュベーションおよび洗浄をブロックするために提供時間は、24時間後に受精より若い胚に合わせて調整されます。古い胚と同じ手順に長い間隔は、試料上の塩類集積につながることができます。標準ゼブラフィッシュ胚の願いをトラブルシューティングするための大規模なヒントは既に文献12から16に記載されています。おそらく最も一般的なジレンマが高い背景である。私たちは、必要に応じて、4.7、15〜20回の洗浄工程でMABT洗浄の数を増やすことをお勧めします、しかし、我々の経験を一晩MABT「スーパーウォッシュ」の他に、4.8の手順に進む前に、10以上の短MABT洗浄と併用すると優れた結果が得られます。別の例のジレンマは、長いリボで発生する可能性が貧弱なプローブ浸潤である。アルカリ加水分解によってリボプローブ次のステップ3.6をせん断して、これを相殺することができます。若いサンプルとの我々の経験では、プローブの毛刈りは通常、必要ありません。しかし、1本が望む実験の結果に寄与因子が可能のようなパラメータということを覚えておいてください、そしてあなた自身の中でWISHの実験パラメータを調整するために、必要に応じて、我々はコミュニティに既に公的に利用可能なこれらの有用なトラブルシューティングの指示の検討を示唆研究12。 伝統WISH技術12月16日に加えて、ウィッシュの方法論と策定されている別のプロトコルの進歩の継続的な出現があった。これらは、fluoresの使用などの信号検出のための新しい方法を含み、cence 17〜19、マイクロRNA 20の局在を可能にする方法に関するものである。染色（s）は、容易に所望の時点で関心対象の試料内で視覚化することができない場合にそうであっても、現在のセルの標識方法に加えられた多くの改良にもかかわらず、これらの手順の有効性は否定される。この制限は、それが潜在的にこれらの時間に発生する様々な発生過程の理解のギャップにつながる可能性がゼブラフィッシュ個体発生の初期胚の段階に関係する場合は特に、研究者のための問題である。正常なゼブラフィッシュの開発中に、卵黄嚢は、徐々に胚の年齢11としてサイズが減少します。胚がその隣接する卵黄嚢に比べて大きいため、したがって、これらの後の発達段階（&gt; 24時間後に受精）で、ウィッシュ染色は分析する非常に簡単です。しかし、これは（初期の体節形成に尾芽段階からそうではないときに、胚質量は、不透明な卵黄嚢が時々汚れの視覚化を不明瞭にすることができる卵黄）の周りに配置されている。従って、フラットマウントの方法は（ 図1および図2に図式化）初期のゼブラフィッシュ胚サンプルの特徴付けに関連付けられた画像化およびデータ分析の問題を軽減するために考案された、単離され、広く遺伝的変異の系統的な表現型から使用されている最初の大規模な遺伝子スクリーニング21から。 フラットマウント技術の登場以来、初期の発達段階の分析が大幅に強化されました。卵黄は、胚から除去されると、撮像のための所望の向きにスライドガラス上に平らに胚を置くことができる。この二次元位置は、試料を回転させる必要がなくなり、これ全体を一度胚の観察を可能にする。多くの組織は、次のような胚の幅広いドメインに位置しています血液や腎臓を形成する前駆体。さらに、1は1度に複数の異なる開発組織を比較する必要があります。フラットマウントは、同時にこのような細胞群のドメイン全体を表示するには、研究者を可能にし、大幅な組織や細胞数のエリア測定などの定量化を支援することができます。この手法は、最終的には造血、神経発生、および器官形成の基礎となる重要な発達のさまざまなメカニズムについて多くの発見につながる支援してきました。このように、一度マスターして、研究者のためのこの簡単な技術のためのアプリケーションは、非常に充実しています。 例えば、造血時の系統の選択を検討する研究において、14及び18体節段階（■）でのゼブラフィッシュ胚のマウント平坦な製剤は、間にPU.1ジンクフィンガー転写因子の発現パターンで発生した変更を説明するために使用された野生型およびGATA1モルホリノ胚22を注射した。この方法は、GATA1はおそらくこの時点周り中間細胞塊（ICM）にPU.1の発現を調節していることを示す、18カテゴリーに展開PU.1ドメインの検出を可能にした。 - / - gtpbp1とエプシンを含むさまざまな赤血球系の遺伝子のために染色し、追加のフラットマウント胚はGATA1たVLT変異体におけるこれらの遺伝子の発現の低下を示した。さらなる分析は、 潟活性とは無関係であることが知られていたbiklfとtesthymin等erythoid遺伝子の発現の変化を示さなかった。したがって、それらの他の実験結果と併せて、それはGATA1は骨髄赤血球系統内の細胞の分化の調節に必須であることが判明した。神経堤開発の研究では、フラットマウントは、研究中の（ 暴徒M610）変異モンブランにcrestinの発現を試験するために使用されたモンブランとtfap2a遺伝子機能23の役割を調べる。 10と20のSSで、crestin式は完全に頭の中で抑制された、最終的にはモンブランとtfap2a規制の重要性について結論を下すには、このグループを支援する、正常な野生型の式と比較して暴徒M610変異体のトランク領域で減少した神経堤形成中。さらに、器官形成の観点から、フラットマウントは前腎として知られている、ゼブラフィッシュ胚腎臓の開発中に、早期の腎前駆分野で異なるドメインの存在の発見を可能にした。ゼブラフィッシュ胚は、腎臓前駆細胞が前腎を構成するネフロン機能ユニットを生じさせるか研究する保存されており、まだ、解剖学的に単純なシステム、腎形成6,7として知られているプロセス（ 図4）を提供します。フラットマウント分析では、Reのドキュメントドメインに有用であったNAL前駆細胞および未知だった（ 図5）、6,7 をパターニングする前腎の間に、RAのシグナル伝達の変化の結果を分析する。まとめると、これらの実施例では、この平坦な正常な発生および疾患状態の間に発生する多様なプロセスの研究にプロトコルを実装するための多くの広範なアプリケーションが実際に存在することを示唆している。 概念的には、このフラットマウント手順は、全体的に非常に簡単です。しかし、この方法を習得するために必要な操作とフィネスの程度は、視覚的なデモが存在しない場合に、マスターに非常に困難な場合があります。したがって、このプロトコルは、より良い、この手法を実行し、組織の処理を最適化できる試薬に関するアドバイスを共有する方法を理解する機会を、研究者は、ゼブラフィッシュモデルに新しい特にを有効にするためにコンパイルされています。我々は、このプロトコルは、最終的には、コミュニティ内の他の人がUであることが最も理想的なサンプルの条件を絞り込むことができますことを願っていますSEDプレミアムイメージング、データ解析、および刊行物に、それらの結果を通信するため。最終的に、これは、実験結果のプレゼンテーションを不明瞭にし、この単純だが重要な技術を利用して、これらを解決することができ、初期胚発生時のゼブラフィッシュの解剖学的支障を克服するために研究者を有効にする必要があります。

ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは 、発生生物学の研究に広く用いられている有機体になっています。ゼブラフィッシュは、家族コイ科に属する熱帯淡水脊椎動物種である。彼らは簡単に、得られる安価で、かつ1を維持することが容易であったとしてゼブラフィッシュは元々 、潜在的な水質汚濁物質の危険性についての情報を得るために環境調査のために使用された。最後の30年間で、ゼブラフィッシュは、理由のホストの遺伝学的に扱いやすい脊椎動物のモデルシステムとして認識されるようになった。ゼブラフィッシュは、哺乳類2,3を含む高等脊椎動物で解剖学や生理学的な保全の高いレベルを示している。近年のゲノム配列のアノテーションは、ヒト遺伝子の約70％が少なくとも一つのゼブラフィッシュ相手4を有することを明らかにした。例えば、腎臓発生の間に重要な役割を果たす多くのオーソログ遺伝子はこれらの種5-7との間に同定されている。このDRA細胞および分子生物学に関しての保全のマチック程度はゼブラフィッシュ8でのヒトの疾患の広い範囲のためのモデルを作成するために研究者を可能にしましたし、ゼブラフィッシュは、化学遺伝子スクリーニング9を使用して、潜在的な薬物療法を識別するための貴重なツールとなっている。 さらに、ゼブラフィッシュのモデルだけでなく、人間に見られる複雑な発生過程および種々の疾患状態を再現することができるが、いくつかの追加の属性も発生学的研究のためのモデル生物としての魅力を高める。ゼブラフィッシュは卵生であり、受精10の開始から胚への容易なアクセスを研究者に提供し、放送産卵を通じて再現。他の利点は、胚の大きさ、透明性、迅速な、外部開発10を含む。さらに、ゼブラフィッシュ大人高い繁殖力を有し、一般的に200〜500の範囲であり得る比較的大きなクラッチサイズを生成週、最終的に9とを容易に、そのような表現型基づく化学画面等のハイスループット実験を行う研究者を可能にする。 そうであっても、ゼブラフィッシュモデルによって展示されている利点の茄多にもかかわらず、初期の発達段階から得られた実験結果の分析やコミュニケーションに関連する課題がある。いくつかの場合において、ゼブラフィッシュ胚の固有の解剖学的構造は、一のデータの視覚化を不明瞭ことができる。開発が進むにつれて11は受精後、最初の細胞は、複数の切断事象を受ける。原腸形成後、胚軸が、それが卵黄11の周りに巻かれるように、尾芽段（10ゼブラ）に現れる。その後の開発は、セグメンテーション期間を経て進行すると、トランクが大量に成長し、また、卵黄の部分と一緒にテールが中央卵黄塊から自分自身を拡張する嚢ように、軸方向の伸びにより長くなります11。尾芽胚と20体節期（19 HPF）の間には、望むように種々の染色プロトコルの利用後に特定の発達の特徴を観察しようと、両方が原因の胚と不透明の形状に可視化し、写真に挑戦することができます卵黄嚢。これらの課題を解消する一つの方法は、卵黄を除去し、次いで、より直接的な方法で解析することができる二次元の検体中に胚を平坦化することである。 次のプロトコルおよびビデオリソースが正常deyolkとフラット1または2色のWISH染色の例を使用して、固定および染色後、胚をマウントする方法のためのガイドを提供する。 WISHは保存試料における特定の核酸の検出を可能にし、従って、組織内で検出される遺伝子発現の部位（単数または複数）を可能に広く使用される技術である。 WISH技術が広範に記載されており、並びにインフルエンザのような様々な色基質を用いて行うことができるorescent検知システム12月20日 。ここでは、開発の尾芽とセグメンテーションステージ間のゼブラフィッシュ胚に使用私たちの修正されたWISHプロトコルを提供。下のプロトコルの冒頭で述べたように、代替WISHプロトコルは、しかし、ここで説明するフラットマウント手順に対応しています。また、平坦な取り付けは、例えば、このプロトコルに記載されていない全載免疫組織化学、または細胞系統追跡ラベルのような既存の可視化技術の任意の数と組み合わせて利用することができる。全体的にフラットな実装技術は、より良いゼブラフィッシュ胚発生の初期段階での実験から得られたデータの優れた分析とプレゼンテーションを可能にすることができます。

<table><tbody><tr>蒸留水中の <td>50 X E3</td><td></td><td></td><td>250 mM NaCl、8.5 mM KCl、16.5 mM CaCl2、16.5 mM MgSO4。メチレンブルー(1 x 10-5 M)(Sigma M9140)を添加して汚染を抑制します。</td></tr><tr><td>1 X E3</td><td></td><td></td><td>50 X E3を蒸留水で希釈します。</td></tr><tr><td>メッシュティーストレーナー</td><td>イングリッシュティーストア</td><td>SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td><td></td></tr><tr><td>胚インキュベーションディ</td>ッシュ <td>ファルコン</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>平底マイクロ遠心チューブ</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル</td><td>ウィートン</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>1x PBS中の0.1% Tween-20洗剤は、蒸留水で10x PBSを希釈して作られます。</td></tr><tr><td>Tween-20 ストック</td><td>アメリカン バイオアナリシス</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>アメリカン バイオアナリシス</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td> 4<td>% PFA (w/v) を 1x PBS に溶解し、ヒュームフード内のホットプレートで沸騰させます。アリコートを冷やして-20°Cで保存し、使用直前に解凍し、ストックを再凍結しないでください。</td></tr><tr><td>フィルター滅菌ユニット</td><td>Corning</td><td>430516</td><td>1 L filter system, 0.45 &mu;m CA</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03-115-879-001</td><td>蒸留水に溶解してプロテイナーゼKストック(10 mg/mL)を作り、アリコートを-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>50% ホルムアミド、5x SSC、0.1% Tween-20、5 mg/ml 酵母トルラ RNA、50 &mu;g/&mu;l ヘパリン</td></tr><tr><td>DIG/FLU 標識リボプローブ in vitro 転写反応試薬</td><td>Roche</td><td>11175025910; 11685619910</td><td>製造元の指示を参照してください。</td></tr><tr><td>SP6 RNAポリメラーゼ</td><td>ロシュ</td><td>11487671001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAポリメラーゼ</td><td>ロシュ</td><td>10881775001</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNAポリメラーゼ</td><td>ロシュ</td><td>11031171001</td><td></td></tr><tr><td>RNase 1阻害剤</td><td>ロシュ</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1阻害剤、10x DNase 1バッファー</td><td>ロシュ</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td> ロ<td>シュ</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>エタノール(EtOH)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>100% EtOHおよび70% EtOHの50 mlアリコート(分子グレードの水で希釈)をアリコートし、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>分子グレードの蒸留水</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>サーモ</td><td>51221073</td><td>モデル 2831</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>-20 °C で保存します。</td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td></td></tr><tr><td>MAB</td><td></td><td></td><td>2 L フォーミュラ: 1.5 L の蒸留水に 23.2 g のマレイン酸、17.5 g NaCl、55.0 g の Trisma ベースを混合し、8 ml の 1M Tris-HCl pH 9.5 を加え、2 L に充填します。</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>MAB + 0.1% (v/v) Tween-20</td></tr><tr><td>ブロック溶液</td><td></td><td></td><td>50 ml の新鮮なアリコートで製造します: 10 ml の BSA (10% ラボストックから)、5 ml の FCS (ストックから)、35 ml の MABT。未使用のブロックを4°Cで保存します。抗体溶液に使用するC。注:BSAとFCSの在庫を37°で解凍します。C&ndash;より高い温度で解凍すると、厚いゲルになります(使用しないでください)。</td></tr><tr><td>FCS(子牛胎児血清)は</td>、<td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>Aliquotを5または10 mLの小分けでストックし、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>BSA(ウシ血清アルブミン)ストック</td><td>アメリカンバイオアナリシス</td><td>AB00448</td><td>BSAフレークを室温で急速攪拌してMABで希釈した10%ストックを作成し、10mlのアリコートを-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン抗体</td><td>ロシュ</td><td>11-093-274-910</td><td>4°Cで保存してください。</td></tr><tr><td>抗フルオレセイン抗体</td><td>ロシュ</td><td>11-426-338-910</td><td>4°Cで保存してください。</td></tr><tr><td>12ウェル染色ディッシュ</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr><td>染色前バッファー</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20.常に新鮮にしてください:それは数日の間に沈殿します。</td></tr><tr><td>染色液-紫</td><td></td><td></td>色 <td>必要な10mlごとに:45 &#956を追加します。NBTのlと35 &#956;l BCIPを新鮮な染色前バッファーに添加します(胚サンプルには使用しません)。</td></tr><tr><td>染色液-赤</td><td></td><td></td><td>必要な10mlごとに:31.5 &#956を追加します。INTのlと35&#956;l BCIPを新鮮な染色前バッファーに添加します(胚サンプルには使用しません)。</td></tr><tr><td>NBTストック</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>-20°Cで保管。C;粉末を70%DMF、30%水で50mg / mlに希釈しました。</td></tr><tr><td>INTストック</td><td>シグマ</td><td>I8377-20</td><td>°Cで保管。C;粉末を70%DMF、35%水で55mg / ml希釈しました。.</td></tr><tr><td>BCIPストック</td><td>Sigma</td><td>B8503</td><td>-20°Cで保管。C;粉末を100%DMFで50mg / ml希釈しました。</td></tr><tr><td>DMF(ジメチルホルムアルデヒド)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00450</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>0.1 Mグリシン、pH 2.2</td></tr><tr><td>小型プラスチックペトリ皿</td><td>コーニング</td><td>430589、430588</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>細い鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>デュモンピンセット パターン#55</td></tr><tr><td>ラッシュツール</td><td></td><td></td><td>ピペットチップ(P10〜P1000のサイズが使用可能)に瞬間接着剤を使用して適切なまつ毛を貼り付けることによって構成されます。自然に抜け落ちる人間のまつげ、自然に抜ける動物のひげやしなやかな毛皮の毛、または製薬店や小売店の美容部門から購入した天然または合成のまつげを使用します(非常に長いまつげは、ピペットの先端に安定して取り付けるのに最も適しています)。ピペットの先端は、ニードルホルダー(例:、フィッシャー08-965-A)などのストレートロッド(長さ8〜10cm)に取り付けられており、取り扱いが容易です。これらの自家製ツールの画像については、Figure 3を参照してください。</td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4445</td><td>ホワイトフロスト</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>モデリングクレイ</td><td>ハズブロ</td><td>プレイドー</td><td>その他のクラフトモデリングクレイ製品で代用できます。</td></tr><tr><td>スライドホルダー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12-587-10</td><td>スライドを平らに収納するための段ボールトレイ。</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ645、SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>複合顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>80i、90i</td><td></td></tr></tbody></table>

ホールマウントによるゼブラフィッシュ胚標本ステンドの観察および分析のためのフラットマウントの準備<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

ゼブラフィッシュ胚は、現在一般的に発生過程の遺伝子制御を調査すると、先天性異常をモデル化するための基本的および生物医学研究のために使用されます。人生の最初の日の間に、ゼブラフィッシュ胚は受精、胸の谷間、原腸形成、セグメンテーション、および腎臓などの構造物の器官、心臓、中枢神経系を含む多くの発達段階を経て進行する。胚は丸い卵黄塊に関連して開発しているため、若いゼブラフィッシュ胚の解剖学は、これらのイベントの多くに関与した組織の可視化と分析のためのいくつかの課題を提示。したがって、このような全体のin situハイブリダイゼーション （WISH） でマウントを使用して染色ものと尾芽（それぞれ10および19時間後に受精（HPF）、）20体節期の間に一定の胚標本、実験の表現型の正確な分析とイメージングのためには、多くの場合、卵黄bから胚を除去することが望ましいすべてのスライドガラス上に平らに配置するために。しかし、フラットマウント手順を実行すると、面倒な場合があります。そのため、フラットな準備をマウントに成功し、効率的な大幅解剖技術の視覚的なデモンストレーションを通じて促進し、また、最適な組織の取り扱いを支援する試薬を使用することによって助けられる。ここで、我々は、ゼブラフィッシュ胚における遺伝子発現の1つまたは2つの色検出のための私達のWISHプロトコルを提供し、平坦な取付手順は固定染色された標本の本実施例を行うことができる方法を実証する。この平坦な取付プロトコルは、初期のゼブラフィッシュの開発中に出現する多数の胚の構造の研究に広く適用可能であり、固定された胚のサンプルに対して実行される他の染色法と組み合わせて実施することができる。

平坦な取付プロトコル手順は、体軸が二次元の調製（ 図1A）内に、中央に位置する卵黄球に巻き付けされたその正常な解剖学的構造から、ゼブラフィッシュ胚の形質転換を含む。若いゼブラフィッシュ胚のホールマウントイメージングは​​、胚軸が卵黄の周りに巻かれている方法の性質によって制限されます。その結果、全体の横方向または背側のビューはステンド胚標本をマウントのみの軸の部分をキャプチャしたり、特定の組織（ 図1B）を不明瞭にすることができます。比較すると、胚のdeyolkingと平坦化は1時間（ 図1B）で視覚化されるために全体の胚軸を可能にします。これらの制限は、13を通って体節7に隣接して位置し、腎前駆細胞のサブセットをマークirx3b（紫）を検出するために、アンチセンスリボプローブで標識したWISH染色胚を、調べることによって証明され、ラベルMYOD1（赤）している体節（ 図1B）。 irx3b転写物は、中枢神経系に豊富に存在するので、irx3b +腎前駆細胞のフィールドは横方向のカメラアングルで可視化する腎フィールドが事実上不可能に、側面図をマウント全体に隠されている。フィールドは卵黄（ 図1B）の周りに巻き付けられるので、胚の背側のカメラビューに回転させると、さらに、irx3b +腎前駆細胞の分野は部分的にしか表示されます。しかし、フラットマウント以下同じ胚の背側のビューはirx3b +トランクや他の胚の構造（ 図1B）に沿って体節に関連して簡単な方法で分析しようとする腎前駆細胞のフィールド全体を可能にします。このように、精巧な空間領域は、理想的には、この方法で文書化することができます。 いくつかの主要なステップがフラットマウント手順の実行が成功に関与している。このtechniquを実行するにはE、卵黄球は、最初の胚を実体顕微鏡を用いて可視化している間このような微細なピンセットなど細かい楽器で行うことができ、適切な胚（ 図2A）から切り離されなければならない。卵黄球の粗除去した後、微細なラッシュツールは胚（ 図2B）に取り付けられたままである卵黄顆粒を削り取るために利用される。残りの卵黄顆粒の除去は、胚組織の視覚化を容易にするために役立つ。最後に、deyolked胚イメージングソフトウェア、顕微鏡に取り付けられたカメラを用いて試料の観察を助けるドキュメントを可能にガラススライド（ 図2C）上に安定的に位置決めするように操作される。ラッシュツールは、所望であれば、ハンドル（ 図3A、材料テーブル）の上に取り付けることができる瞬間接着剤を使用して、ピペットチップに好適なラッシュを取り付けることによって構成することができる自家製の装置である。異なるラッシュサンプルが生成するように調達することができます長さと、各ユーザーは、彼らがフラットなマウント手順を試して始めるとは異なるpredilectionsを持っていることがテーパー（ 図3B）、という点でわずかに異なる特性を持つツールをラッシュ。ラッシュサンプルの例は、当然、人間のまつげを当てる自然動物針金髪の毛やウィスカーを流し、最終的には市販のまつ毛の合成品種は小売化粧品部門で見つかったが含まれています。 周囲のガラススライド（ 図4A）上に位置するサンプルを含有する局所領域を高分解能分析のために画像化することができる。プローブの組み合わせは、サンプル（ 図4B、4Cを表示するために行われた2色の願いを込めて早期の発達段階での野生型胚における腎臓を引き起こす発展途上腎臓前駆細胞を標識した後、平らな準備をマウントするために使用された）。初期の体節段階では、腎前駆細胞は、目でU字型のパターンで区画されている付随してデルタC（DLC）（赤）（左の列、 図4B）6,7 を表現近中胚葉を囲む（紫）pax2a転写物の EIR式。 DLC転写物が紫色の基質を用いて検出し、後脳マーカーkrox20（赤）との組み合わせで標識した場合に比較して、腎前駆細胞の吻側サブドメインは、先に述べたように、DLC（右欄、 図4B）を発現することを可視化した6,7。フラットマウント調製物は、後に体節形成段階を研究するために同様に使用することができる。 14体節の段階では、体節（ 図4C）をマークし、腎マーカーpax2a、slc4a4、およびsmyhc1（赤）と一緒に（紫）slc12a3の発現を解析した。吻側サブドメインexprの中の細胞のサブセットを明らかにしながら、これらの組み合わせは、pax2a全体腎前駆細胞ドメインのマッピングを可能にslc4a4aを essedとslc12a3を表明し、腎前駆細胞の非オーバーラップ尾のサブドメインによって区別された。 二色WISHとフラットマウント調製物はまた、小分子への環境暴露6,7（ 図5）からの遺伝変異または他の摂動とゼブラフィッシュにおける器官形成中の細胞外ドメインの研究に貴重なものです。ゼブラフィッシュNLSとlibの変異体は、レチノイン酸（RA）の生合成に必要な酵素をコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A2（旧RALDH2として知らaldh1a2、）に突然変異を保有する。 RAは、糸球体6,7として知られている胚腎臓の血液フィルターを作ることに寄与有足細胞の形成を含む多くの腎細胞型の適切な発達に必須である。願いがTの境界と同時にwt1aで足細胞前駆細胞を標識するために実施した彼は野生型胚におけるkrox20とsmyhc1と後脳と体節を開発し、変異胚、LIB変異胚、およびALDH酵素化学的阻害剤、DEAB（ 図5）で処理された胚をNLS。 DEABで処理した胚はwt1a転写物の抑止（ 図5、右欄 ） を示しながら、欠損aldh1a2発現を有する胚は、野生型の胚と比較して減少wt1a発現を示した。まとめると、これらの代表的な結果は、平らなマウント技術が初期胚での精度の解剖学的な違いを分析し、文書化するために使用することができ、貴重な発達の研究のために実施される方法を示しています。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> 図1。フラットマウントPREPAの概要ゼブラフィッシュ胚のための配給。中央卵黄塊を除去し、胚が安定的に平らな表面上に配置されているため、A）フラット取り付ける手順は、胚軸に沿った組織の同時表示を可能にします。B）全体の画像が、横方向と背側のビューでWISH染色胚をマウントし、した後、フラットマウントの準備を行った後に。胚はirx3b（紫色）およびMYOD1（赤色）をコードする遺伝子の転写産物を検出するためのアンチセンスプローブで染色した。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> 図2。ゼブラフィッシュ胚フラットマウント手順の概略。 A）胚が第著しく（B）は、卵黄の質量の大部分を除去するdeyolkedれる腹側表面を微細残りの卵黄顆粒を除去するためにdeyolkedされ、そして胚を洗浄した後、（C）は、視覚分析および/ ​​または写真画像形成用のガラススライド上に背側を上に取り付けられている。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> 図3。例ラッシュツールの写真は細かい鉗子と比較。 A）自家製ラッシュツールは、ビューの上部に沿って設けられたミリ参照し、参照。B）細かい鉗子の隣にラッシュのツールの拡大図を提供するためのメトリック定規に隣接して配置され、細かい鉗子の標準組と一緒に画像化した。二つの異なるラッシュツールは、アスタリスク（*）で示されている自然ネコウィスカーを当てるから得られ、にトリミングしたラッシュをマークするために使用される、自然に流され、人間のまつげ、および二重アスタリスク（**）から入手したラッシュをマークするために使用やや平滑末端を作る。各カリフォルニア州SE、ラッシュはピペットチップに通すと、徐々にハンドリング装置に付着したピペットにラッシュを固定/安定化するための強力なシールを作成するために瞬間接着剤のいくつかのコートで貼り付けた。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> 図4。野生型ゼブラフィッシュ胚における腎前駆細胞分野における発達的変化の解析。 A）（B、C）に分析のために像形成されるエリアを示す概略をスライドさせて図1におけるB）野生型の胚、3、および5体節期を与える腎前駆フィールドの組成を評価するために二色WISHによって染色し胎児腎臓、または前腎に上昇。 （紫に染色された）転写因子pax2aをコードする（左の列）転写物は腎臓のPを含む胚のいくつかの集団をマーク中間中胚葉から出rogenitorフィールド。ノッチリガンドDLCをコードする転写は（赤く染色された）近軸中胚葉から形成体節をマーク。 （紫色に染色された）DLC転写物の発現および後脳rhombomereマーカーkrox20（赤色染色）が同じ胚で検査された場合（右カラム）、DLC発現は、体節に隣接して配置腎前駆細胞の吻側サブドメインで観察することができる）14体節段階で野生型胚は、体節マーカーsmyhc1（赤）腎マーカー（紫）の組み合わせで、二重または三重染色したpax2aとDLCの共染色中に隠された、C 1-5、 、および後脳rhombomereマーカーkrox20（赤色）。 （トップパネル）、この段階では、pax2a転写物は腎臓前駆細胞の境界を定めるために続けています。 （ミドル、下のパネル）の腎臓前駆細胞の領土内では、吻側サブドメインがマークされているslc4a4とslc12a3をエンコード転写産物で尾サブドメインをマーク。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> （紫）wt1aの15体節段階で図5。遺伝的変異またはレチノイン酸の生合成を調節し、化学遺伝的摂動によって引き起こされる表現型を特徴付けるためのフラットマウント調製物の使用。WISH発現パターンとsmyhc1/krox20（赤）を比較したレチノイン酸（RA）生産における欠損を有する野生タイプと胚の間に起因するアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A2（NLSおよびLIBの変異）またはジエチルアミノ（DEAB）とレチナール脱水素酵素活性の化学阻害の欠陥に。 lib内のRA産生の減少は、このような、NLSよりも若干厳しいですLIB胚は野生型のDEAB処理をwt1a発現の完全な廃止に関連している同様に、NLSの変異胚を上演したよりもwt1a転写物のわずかに減少し染色を発現していること。

ゼブラフィッシュ胚は、発生生物学の研究のための優れたモデルである。胚発生の間に、ゼブラフィッシュは、試料観察および分析のための3次元の課題が卵黄塊で開発しています。このプロトコルは、その場でホールマウントの準備を取り付ける2次元の平面を作成する方法について説明します（WISH）は、ゼブラフィッシュ胚の標本を染色した。

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

この手順の目的は、発生初期段階における染色済みの固定ゼブラフィッシュ胚をより詳細に可視化することです。まず、C2 hybridizationのホームマウントを用いてゼブラフィッシュ胚を染色します。次に、フラットマウント用の胚を選択し、微細ピンセットを用いて卵黄に中央切開を加えます。その後、ラッシュツールを使用して、残りの卵黄顆粒を穏やかに掻き取り、除去します。最後に、標本を適切にイメージングできるように、胚をグリセロールを用いてスライドにマウントします。最終的に、平坦マウント（フラットマウント）により、卵黄を除去して胚を二次元的な状態で配置することで、背側からの染色胚の視覚化が向上します。この手法の、より初期の発達段階にある無傷の胚をイメージングするなどの既存の方法に対する主な利点は、平坦マウントによって卵黄嚢が除去され、胚全体を観察できる点にあります。この手法は、胚における腎前性別領域の特性評価など、発生学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな方は、胚の繊細な取り扱いが必要であることや、卵黄嚢を除去するために必要な適切な圧力を習得するのに時間がかかることから、困難を感じることがあります。本手順のデモンストレーションは、Winger研究室の大学院生である私とZoe、そしてAmandaが行います。テキストプロトコルに従って胚の回収、固定、および染色を行った後、1つのX-P-B-S-Tを用いてフラットマウント用の胚を選択します。胚をプラスチック製またはガラス製のペトリ皿に移します。次に、ペトリ皿を実体顕微鏡下に置き、微細ピンセットを使用して胚を転がし、頭端と尾端が見える側面観になるように調整します。次に、精密ピンセットで胚を固定し、別のピンセットを用いて、胚の頭部と尾部の中心位置にある卵黄に切開を加えます。その後、精密ピンセットで卵腔から卵黄をすくい出します。1、2滴のXPBSを用いて、胚に付着した卵黄を洗い流してください。胚を平らなガラススライドに移動させます。胚をバッファーの端まで引き寄せ、ガラススライドに対して平らな状態で保持します。胚を固定しながら、ラッシュツールを用いて腹側表面を優しく掻き出し、卵黄顆粒を除去します。PBST溶液に過剰な卵黄が混じって濁った場合や、溶液が蒸発し始めた場合は、新しい溶液を1〜2滴加え、胚をその新しいバッファー内へ移動させます。卵黄が十分に除去されたら、胚を慎重にPBSTを入れたペトリ皿に戻し、最終的に洗浄します。その後、胚を100% glycerolを含むペトリ皿に移し、5分間インキュベートします。胚をガラススライドに固定するには、胚を清潔なガラススライドへ移します。100% glycerolを1〜2滴滴下し、卵黄のある腹側がガラススライドに向くように配置します。ラッシュツールを用いて胚をglycerolの滴の端まで移動させ、スライドに対して平らな状態で固定します。胚軸が湾曲している場合は、微細ピンセットを用いて残存している卵黄にそっと小さな切開を加え、張力を緩和させてスライドガラス上に平らに配置できるようにします。18×18のカバーガラスの四隅に、モデリングクレイを少量ずつ配置します。カバーガラスをゆっくりと胚の上に置き、グリセロール内の気泡を最小限に抑えるように角度をつけて被せます。最後に、100% glycerolをカバーガラスの脇にさらに1滴加え、ガラスとの隙間を埋めてドリフトを防ぎます。ここに示す画像は、実体顕微鏡または複合顕微鏡を用いて撮影しました。腎臓に分化する腎前駆細胞を標識するため、プローブの組み合わせと2色を用いたin situ hybridization（wish）を行い、胚を早期にフラットマウントしました。14 Somite期の腎前駆細胞は、赤色で示されるdelta Cを共発現する中間中胚葉を取り囲むように、PAX2a転写物の発現によってU字型のパターンで画定されます。delta CをCcrox20で共染色したところ、delta Cを発現する腎前駆細胞の吻側サブドメインが明らかになりました。14 Somite期におけるPAX2a、SLC4a4、SLC12a3、およびSMYHC1の発現解析により、PAX2aを用いて腎前駆細胞ドメイン全体のマッピングが可能となり、吻側サブドメインの一部の細胞がSLC4a4を発現していることが明らかになりました。これは、SLC12A3を発現する腎前駆細胞のcoddleサブドメインとは重複しませんでした。この図では、レチノイン酸の生合成に必要なレチナルデヒドロゲナーゼ2遺伝子に突然変異を持つ胚、またはDEABおよびALDH阻害剤で処理した胚において、それぞれWt1aの発現が減少または消失していることが示されており、フラットマウント標本を用いた2色WISHが、器官形成中の細胞ドメインの研究に有用であることが証明されています。遺伝的突然変異を持つゼブラフィッシュや、低分子化合物に化学的に曝露させた個体においても同様です。この手法に習熟すれば、適切に実施した場合、10〜15分で完了させることができます。この手順に続き、腎臓セグメントの境界がどこにあるかといった追加の疑問を解決するために、イメージングなどの他の手法を実施することができます。ビデオを視聴することで、卵黄を除去して目的の構造をより詳細に視覚化するための、染色済みゼブラフィッシュ胚のフラットマウント方法について十分に理解できるはずです。

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Biology

生物学

in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためと、二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するためのin...

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

この記事では、生きたゼブラフィッシュの胚を長期間のイメージングのためにマウントする方法について説明しています。この方法は費用対効果が高く、倒立顕微鏡でのイメージングに通常のガラス底顕微鏡ディッシュを使用して簡単に実行できます。埋込みは、異なる濃度のアガロースの層で行われます。...

層状寒天マウント:倒立顕微鏡による長期イメージングのための生きたゼブラフィッシュ胚の調製

このビデオでは、低融点アガロースを使用して生きたゼブラフィッシュの胚を6ウェルプレートにマウントする手順を順を追って説明しています。また、生きた胚の画像を取得し、ソフトウェアを使用して分析するプロセスも提供します。...

寒天マウント:長期イメージングのための生きたゼブラフィッシュ胚のマウントの基本的な方法

ゼブラフィッシュは、小さな熱帯魚は、脊椎動物の発生と疾患の間に遺伝子機能を研究するための人気のあるモデルとなっている。標的遺伝子の時間的および空間的な表現は次式で求めることができる...

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

このような増殖、パターニング、分化、および軸索ガイダンスとして発生プロセスを容易にゼブラフィッシュ脊髄でモデル化することができる。この記事では、これらのイベントの可視化を最適化した、ゼブラフィッシュ胚の取付け手順を説明します。...

解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

ゼブラフィッシュの胚の発達は、低濃度のアガロースで光学的に透明なポリマーチューブに埋め込まれている光シート顕微鏡で日間にわたって追跡することができる。...

多層はゼブラフィッシュの長期シート光顕微鏡用に取り付け

ここでは、正常な発達を乱すことなく、生きたゼブラフィッシュの胚の後部体の発達を長期間のタイムラプスイメージングを可能にする汎用性の高いマウント方法を紹介します。...

ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法

繊毛の開発は適切な器官形成に不可欠です。このプロトコルでは、ラベルを付けると、ゼブラフィッシュの繊毛細胞を可視化する最適化されたメソッドについて説明します。...

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

この記事では、長時間経過共焦点顕微鏡用に脆弱なゼブラフィッシュ胚を取り付ける方法について説明する。この低コストの方法は、任意の反転顕微鏡でイメージングするための通常のガラス底顕微鏡用皿を使用して簡単に行うことができます。取り付けは、異なる濃度でアガロースの層で行われる。...

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

ここでは、ゼブラフィッシュ胚および幼虫の全製剤におけるタンパク質の蛍光抗体媒介検出に関するプロトコルを提示する。...

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

ライトシート顕微鏡を使用して、無傷の絨毛膜内の初期のゼブラフィッシュ胚をイメージングするためのサンプル調製戦略について説明します。これは、70%エピボリーおよび芽の段階で胚が絨毛膜内で獲得するさまざまな向きを分析し、ライトシートシステムを使用して胚全体で細胞スケールの分解能を得るためのイメージング戦略を詳しく説明します。...

初期ゼブラフィッシュ胚のライトシート顕微鏡イメージングとマウント戦略

学ぶゼブラフィッシュ胚のフラットマウント技術。WISH染色後、卵黄を除去して背側からの観察を可能にし、腎臓前駆細胞などの器官形成過程を詳細に解析する方法を解説します。

ホールマウントによるゼブラフィッシュ胚標本ステンドの観察および分析のためのフラットマウントの準備

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