Name: マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学ぶ実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルの誘導法と、フローサイトメトリーおよび定量PCRを用いた免疫細胞分布とサイトカインmRNAレベルの評価法。マウスを用いた多発性硬化症の病態機序と免疫細胞動態の研究に適用できます。

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この作業は、Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS) Research Training Group Translational Research Innovation - Pharma (TRIP) とヘッセン州の "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung" の支援を受けました。

倫理の声明：私たちの実験手順はRegierungspräsidiumダルムシュタット（ドイツ）の倫理委員会によって承認され、国内および欧州の規制に確認されています。すべての努力は、動物の苦痛を最小限にし、使用する動物の数を減少させました。 1. EAEモデル<ol><li> EAEモデルの誘導<ol><li> EAEの誘導のために10〜13週齢の雌129S4 / SvJae×C57BL / 6マウスを使用してください。 </li><li> 200μl中400μgの結核菌を含む完全Freund`sアジュバント（CFA）を乳化55（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）ペプチド（200μgの）、 -脳炎誘発性MOG 35の、背面上部および下部に、マウスに皮下注射を与えます。 注：陰性、非疾患誘発偽対照として、同じ量および同じ経路で、 結核菌を含む不完全フロイントアジュバントを使用することができます。 </li><li> THEReafter、そして再び24時間後、マウスを（200μlのリン酸緩衝生理食塩水、PBSで希釈し、合計0.2μgの中で、）百日咳毒素の腹腔内注射を与えます。健康な動物との患部を比較することができるように、対照群として未処理マウスを使用してください。 注：、55ペプチド300 - - - 300μgのMOG 35 200でEAEを誘導することも可能である注射当たり0.2ミリリットル- 0.1の容量で0.3μgの百日咳毒素- CFAと0.2での結核菌 500μgの。 </li><li> （ステップ1.2.1を参照）、注射後1週間以降、臨床症状について毎日マウスを調べます 注：疾患発症の日が異なる実験で変動するが、我々の研究室での条件の下で、これは11日目のまわりであり、従って、ここでは14日目には、疾患の発症後3日間として定義されています。本研究における全てのマウスは臨床症状を発症しました。 </li></ol></li><li>マウスのスコアリング<ol><li>次のように臨床スコアによって臨床症状を分類：0）兆候ない、尾の0.5）遠位麻痺、1）尾の完全麻痺、1.5）尾の引きずりと後肢の軽度の弱さ、2）尾の引きずりと後足の重度の衰弱、2.5）尾の引きずりとの麻痺1後肢、3）尾の引きずり、両方の後肢の麻痺、後肢と1前肢の弱さの両方の3.5）麻痺が（このスコアを達成したマウスは）地元の倫理ガイドラインを踏まえて、安楽死させました。 </li></ol></li></ol>フローサイトメトリー分析のための単一細胞の調製注：抗体混合物は、1μlのCD45-VioBlueに、2μlのCD8-eFluor650、0.5μlののCD11b-eFluor605、0.5μlのF4 / 80-PE-Cy7を、1μlのCD3-PE-CF594、CD4-V500、0.5μlのCD11cので構成されてい-AlexaFluor700、1μlのCD19-APC-H7と1μlのLy6G-APC-Cy7を。 注：血液、リンパ節、脾臓および脊髄を取る場合は、次のように手順は次のとおりです。マウスを深くisoflの組み合わせで麻酔urane（毎分カルボゲン2％）およびケタミン（100 mg / kg体重）。次に、胸郭を開き心臓内棒で血液を除去し、冷PBSで心臓内にマウスを灌流。その後、脾臓、最終的には脊髄が続いリンパ節を削除します。あなたが心臓内にマウスを灌流する必要がない場合は、首の脱臼により深い麻酔下でマウスを安楽死させます。 <ol><li>脾細胞の単離<ol><li>イソフルランの組み合わせ（毎分カルボゲン2％）およびケタミン（100 mg / kg体重）をマウスにAnaesthetize。 </li><li> 80％のイソプロパノールでウェット切開領域は、はさみを使って、毛を持つ任意の汚染を回避し、より深部の組織を穿刺することなく、縦方向に胸郭を開きます。 </li><li>冷PBSのpHは7.0 23で心臓内にマウスを灌流。 注：脾臓は胸郭の下で左上腹部の象限に位置しています。脾臓が検討される場合にのみ、この器官はretaiするために、灌流前に除去することができます関心のあるすべての細胞型をn個。 </li><li>脾臓を取り出して、約1/8をカットし、それを量ります。氷上のPBSでサンプルを保管してください。 </li><li> 2mLの注射器のプランジャーを用いて、（50mlのチューブ上に配置）70ミクロンメッシュの篩を通して脾臓組織を絞ります。 </li><li> 5ミリリットルのPBSでメッシュを洗ってください。 3分間1800×gで遠心分離します。ソリューションを溶解500μlのペレットを再懸濁。 注：この段階では、後で、代替のFACS解析方法は、ビーズを使用しないという使用される場合、差分細胞カウントを行うことが必要であってもよい（セクション3を参照）。 </li><li>室温（RT）で10分間インキュベートし、500μlのPBSを追加します。室温（RT）で650×gで6分間遠心。 </li><li> 500μlのPBSで洗浄工程を繰り返します。 100μlの0.2％ウシ血清アルブミン（BSA）で細胞ペレットを再懸濁し、上清を捨て/ PBSは、2μLのFc受容体1（のFcRI）ブロッキング緩衝液を追加し、暗所で室温で15分間インキュベートします。 </li><li> 13μlの追加tibody混合物を、暗所で室温で15分間インキュベート室温で650×gで6分間、500μlのPBSおよび遠心分離機を追加します。上清を捨てます。 注：メーカーの染色手順は、単一の洗浄を推奨するが、バックグラウンド染色のさらなる減少は、必要に応じて洗浄工程を一又は二回以上繰り返すことによって達成することができます。 </li><li> 500μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁（またはおそらくタンパク質の分離のためのバッファを実行すると、潜在的に細胞凝集を減少させる）、フローサイトメトリーチューブに移します。細胞を氷上に保管してください。 </li></ol></li><li>リンパ節細胞の単離<ol><li>イソフルランの組み合わせ（毎分カルボゲン2％）およびケタミン（100 mg / kg体重）をマウスにAnaesthetize。 </li><li> 80％のイソプロパノールでウェット切開領域とハサミを使用して縦方向に胸郭を開きます。冷PBSのpHは7.0 23で心臓内にマウスを灌流。 </li><li>鼠径リンパ節を単離するために、慎重にハイの領域で皮膚を除去鉗子で脂肪組織の外に慎重にリンパ節をpと選択します。鼠径リンパ節を秤量し、氷上でPBSでサンプルを保存します。 注：我々は、我々の研究のためO`Connor らに鼠径リンパ節を使用していました。活性化単球、マクロファージ、好中球およびT細胞の高い数は、すべてのEAE誘導後24鼠径リンパ節中に存在することを見出しました。 </li><li> 2ミリリットルの注射器のプランジャーを用いて、（50ミリリットルチューブの上に配置）70ミクロンメッシュの篩を通してリンパ節を絞ります。 </li><li> 5ミリリットルのPBSでメッシュを洗ってください。 8分間、2400×gで遠心分離します。 100μlの0.2％BSA / PBSで細胞ペレットを再懸濁し、2μlののFcRIブロッキング緩衝液を添加し、暗所で室温で15分間インキュベートします。 </li><li> 、13μlの抗体混合物を追加し、暗所で室温で15分間インキュベート、室温で650×gで500μlのPBSおよび6分間の遠心分離を追加します。 </li><li>上清を捨て、300μlのPBSで細胞ペレット（または適切なランニングバッファー）を再懸濁し、それを移しますフローサイトメトリーチューブに。 </li></ol></li><li>血液細胞の単離<ol><li> （EDTAで安定化された）50μlの血液に50μlの20 mMのHEPESを追加し、ソリューションを溶解500μlを添加します。 RTで10分間インキュベートし、500μlのPBSを追加します。室温で650×gで6分間遠心分離します。上清を捨て、洗浄ステップを繰り返します。 </li><li> 100μlの0.2％BSA / PBSで細胞ペレットを再懸濁し、2μlののFcRIブロッキング緩衝液を添加し、暗所で室温で15分間インキュベートします。 </li><li> 、13μlの抗体混合物を追加し、暗所で室温で15分間インキュベート、室温で650×gで500μlのPBSおよび6分間の遠心分離を追加します。 、上清を捨て、300μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーチューブに移します。 </li></ol></li><li>脊髄細胞の単離<ol><li>イソフルランの組み合わせ（毎分カルボゲン2％）およびケタミン（100 mg / kg体重）をマウスにAnaesthetize。 </li><li> 80％のイソプロパノールで湿潤切開領域と縦方向に胸部を開きはさみを使って。冷PBSのpHは7.0 23で心臓内にマウスを灌流。 </li><li>背面の切開領域を湿らせ、メスで再び縦カットをすると皮膚を取り除きます。 </li><li> （後肢を神経支配）脊椎の腰部を切り出し、脊髄を抽出​​するためにPBSで満たされた注射器でそれをフラッシュします。 、腰椎コードの約1/3を切り取り、これを計量し、氷上でPBSでサンプルを保存します。 </li><li> 4°Cで2分間250×gで遠心分離します。上清を捨て、500μlの細胞剥離液とHBSS追加（1：1）。 、3 mg / mlでコラゲナーゼA及び1単位/ mlのDNアーゼIを追加アップ繰り返し、ダウンピペッティングにより細胞を首をはねると400rpmで37℃で振とうしながら30分間インキュベートします。 注：好ましい場合、細胞懸濁液は、バックグラウンド自己蛍光のANを低減することにより、測定フローサイトメトリーの感度を向上させることができる密度勾配遠心分離によりミエリン及び細胞残屑を汚染するクリアすることができ取得する必要のあるイベントの数をD（セクション3.5を参照）。 </li><li>室温で2分間、250×gで遠心します。上清を捨て、1ミリリットル10％ウシ胎児血清（FCS）/ダルベッコ最小必須培地（DMEM）中にペレットを再懸濁し、最大繰り返し、ダウンピペッティングにより細胞を再度首をはねます。 </li><li>室温で2分間、250×gで遠心します。洗浄工程を繰り返します。 </li><li> 1mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、2ミリリットルの注射器のプランジャーを用いて、（50ミリリットルチューブの上に配置）70ミクロンメッシュのふるいを通して脊髄を圧迫。 </li><li> 4ミリリットルのPBSでメッシュを洗ってください。室温で3分間、1,800×gで遠心します。上清を捨て、のFcRIはブロッキング試薬2μlを添加し、暗所で室温で15分間インキュベートし、100μlの0.2％BSA / PBSで細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> 、13μlの抗体混合物を追加し、暗所で室温で15分間インキュベート、室温で650×gで500μlのPBSおよび6分間の遠心分離を追加します。 </li><li>上清を捨て、細胞PELLEを再懸濁500μlのPBS（または適切なランニングバッファー）でtとフローサイトメトリーチューブに移します。 </li></ol></li></ol> 3.フローサイトメトリー分析<ol><li>オレシュら 25によって記載されるように最適な濃度を決定するために、事前にすべての抗体を滴定します。 </li><li> manufacturer`s指示に従って、マルチカラー補正行列を作成するために単一色補正のための抗体捕捉補償ビーズを使用します。 </li><li> manufacturer`s指示に従って特定のビーズを使用して、毎日機器較正を制御します。 </li><li>直接測定のフローサイトメトリーの前に、絶対細胞数を決定するために（分離のためのセクション2.1、2.2、2.3、2.4を参照）を細胞に30μlのフローサイトメトリー絶対数の標準を追加します。代わりに計数ビーズを用いて細胞を計数することができます。 </li><li>フローサイトメーターに試料（50万イベント：10万イベント、脊髄、脾臓、リンパ節及び血液からの細胞）を取り上げますND特定のフローサイトメトリーソフトウェアを使用して分析します。 <ol><li>フローサイトメトリーソフトウェアを開き、ボタン「サンプルを追加」を押すことで、FCS 3.0のファイルを追加します。 </li><li>ダブルクリックして追加したファイルを開きます。 x軸とy軸のチャンネルを調整します。目的の細胞集団を選択するには（ 図4を参照）は、ゲートを作成します。 </li></ol></li></ol> 4.定量的PCR分析<ol><li> cDNAへのmRNAの単離および転写<ol><li>フェノール-クロロホルムにより腰部脊髄（1/3）、脾臓（1/8）および鼠径リンパ節からmRNAを抽出し、エタノール26で沈殿します。 <ol><li>このために、10分間インキュベート1mlのグアニジンチオシアネート - フェノール混合物中で組織をホモジナイズします。 200μlのクロロホルムを加え、再び10分間インキュベートします。 </li><li>遠心分離工程（4℃で15分間、18,000×gで）した後、4時（上部の水相は、500μlのイソプロパノールおよび遠心分離機である8分間18,000×gで洗います°C）。 </li><li> 500μlのエタノールでペレットを洗浄し、遠心分離工程（4℃、5分間18,000×gで）した後、真空濃縮器（30℃、5分）でペレットを乾燥させます。その後、30μlの水にペレットを再懸濁。 </li></ol></li><li>血液からmRNAを抽出するには、遠心分離機500μlのEDTA安定化血液（300×gで10分間、4℃）。 <ol><li> 、バフィーコートを取る白血球を含有する、溶液（150mMのNH 4 Cl を 、100mMの炭酸水素ナトリウム、0.1mMのナトリウム、EDTA pH7.4）に溶解1mlに希釈します。 </li><li>室温で10分間インキュベートした後、6分間、650×gで細胞を遠心分離し、その後PBSで2回洗浄します。 </li><li>製造者の指示に従ってRNA抽出用キットを使用して、白血球（WBC）からmRNAを抽出します。 </li></ol></li><li>製造業者の指示に従ってランダムヘキサマーを含むcDNA合成用キットを用いてcDNA合成を行います。 CDN 200 ngのmRNAをを使用して合成。 </li></ol></li><li>定量PCR <ol><li>特定のmRNAの量を定量化するために、1μlのcDNAを、1μMリバース/フォワードプライマーと、製造元の指示27に従って、蛍光DNA結合色素を使用します。プライマーセットのための配列については表1を参照してください。定量PCRシステムを用いて、IL-1β、IL-6、IL-23、IFNγ、TNFαおよびPPIA（ペプチジルプロリルイソメラーゼ）のCT値を測定します。 </li><li>相対的mRNA発現を決定するために、比較CT（サイクル閾値）法27を使用します 。 <ol><li>このため、以前の研究（Barthelmes らに記載されているように、標的遺伝子からPPIAの平均CT値を減算することによりPPIAの発現レベルに標的遺伝子のCT値を正規化する。28、Schiffmann ら 。29、Schiffmann ら 30）。続いて、ΔCT値を正規化する、使用して、いわゆるΔΔCT値を計算しますEAEマウスにおけるΔCT値から未処置マウスにおける平均ΔCT値を減算することにより再度、未処理マウスの標的遺伝子の発現レベルにEAEマウスからの標的遺伝子の。 </li><li> - ΔΔCT2：標的遺伝子の相対的mRNA発現を得るために、以下の式を用いて比を計算します。 </li></ol></li></ol></li><li>各プライマーの特異性をテストします。 2％アガロースゲル31を使用して増幅断片のサイズを決定します。フラグメントサイズを表 1に示します。 </li></ol>

MJPは、XelliaとLeo Pharmaceuticalsのコンサルタントです。

ここで説明EAEモデルは、MSのモデルとして最も注目されており、日常的にMS 32のための治療戦略を試験する際に使用されます。マウスの疾患は、MSの多くの臨床的および組織学的特徴を示し、神経細胞の抗原に対する自己免疫の誘導によって引き起こされます。ミエリン抗原に対する感作は、血液脳関門機能不全に関連し、それによって、CNSへの免疫細胞浸潤されます。我々の知見は、免疫細胞が急性期でリンパ節内に一時的に増加することを示しています。脾臓T細胞とB細胞は、疾患の前臨床段階で減少します。好中球は、疾患依存的に増加させるのに対し、血液循環において、T細胞、B細胞、樹状細胞および単球は、前臨床段階で一過性に増加します。最後に、脊髄内に、免疫細胞の増加が検出（ 図 2）です。これらのデータは、T細胞およびB細胞が作用脾臓から移行することを示しますこれらの細胞は、それらが活性化し、増殖しているリンパ節のリザーバ。その後、彼らは、脊髄への血液循環を経て移行します。好中球、単球および樹状細胞が、一方、CNSへの循環を介して骨髄から移動します。 <p class=...

多発性硬化症（MS）およびその対応する動物モデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、中枢神経系（CNS）における自己免疫神経炎症の変化を示します。早期活性MSおよびEAEの病変は、浸潤免疫細胞の存在によって特徴付けられます。 MSの病因は不明であるが、広く自己反応性T細胞によって媒介ミエリンの破壊を伴うと考えられています。これらの自己反応性T細胞は、循環からのB細胞、単球および好中球などの他の免疫細胞を誘引前炎症性サイトカインおよびケモカインを分泌します。単球はマクロファージに分化します。自己反応性T細胞によって分泌されるインターフェロンγ（IFNγ）は、前炎症性マクロファージにマクロファージを偏光します。前炎症性マクロファージ放出サイトカインおよびオリゴデンドロサイトのアポトーシスを促進する活性酸素種。オリゴデンドロサイトの死は脱髄につながります。さらに、B細胞は、pに分化します細胞をlasma、最終的にミエリンの劣化が生じ、ミエリン鞘に対する自己抗体をリリース。ミエリンの喪失は、軸索及びニューロンの劣化にし、それによってMS 1の主な特徴を表すCNSにおける病変部位の形成をもたらします。周囲に、T細胞とB細胞はリンパ節において活性化され、それらは、脾臓中で増殖し、中枢神経系への循環を通って移動します。単球および好中球は骨髄で増殖し、また、中枢神経系への循環を通って移動します。 血液中へのまたはCNSへの血流からの骨髄、脾臓およびリンパ節からの白血球の血管外漏出は、ケモカインおよびケモカイン受容体によって媒介される白血球と内皮細胞との間の分子間相互作用を含むいくつかの要因に依存する多段階プロセスです。種々の細胞型によるケモカインの産生、免疫reactio中に誘導することができますその後炎症2,3の部位への免疫細胞を補充腫瘍壊死因子α（TNFα）などのサイトカイン、IFNγおよびインターロイキン6（IL-6）、によってN。免疫細胞は、炎症部位への細胞型及び移動経路に応じて、それらの表面上のケモカイン受容体のサブセットを提示します。したがって、CXCR2、CCR1とCXCR1は、骨髄や血液4で成熟した好中球上に発現し、そのリガンド、CXCL2、CCL5またはCXCL6の結合され、それぞれ、好中球を活性化し、その後、細胞の遊走を内皮細胞への接着を促進し、組織5-9に。 CCL2とCCL20はそれぞれ、CCR2 11およびCCR6 12を発現し 、単球およびTh1 / Th17細胞10を 、引き付けます。 T細胞、単球およびマクロファージを含む、13の異なる細胞型によって発現CCR1及びCCR5、CCL3、CCL5及びCCL7に結合し、MS 14の間にアップレギュレートされます。 CXCR3は、T細胞上に発現され、CCL9、CCL10に結合され、かつCCL11 15。 MSの治療における一つの主要な戦略は、免疫細胞の枯渇またはCNSへの免疫細胞の浸潤の予防です。したがって、特定のケモカイン受容体の遮断は、EAEに検討されています。拮抗作用またはCCR1 16の遺伝子欠失、CCR2 17は 、CCR7 18またはCXCR2 19は、拮抗作用またはCCR1 20の遺伝子欠失のに対し、CCR5 20またはCXCR3 21は病変を減少させなかった、EAEの病理を低減します。したがって、白血球上の特定のケモカイン受容体の発現は、CNSへの後者の浸透のために重要であり、EAEのコースを指示します。 浸潤免疫細胞は、順に、炎症過程またはニューロン22の劣化を促進し、TNFα、IL-6およびIL-1βなどのサイトカインを放出するため、免疫細胞の枯渇が、MS患者に対する有効な治療戦略です。また、自動反応性Th1細胞は、順番に、TNFα、IL-1βおよびIL-23を解放するためにマクロファージを刺激しIFNγを放出します。 この原稿は、EAEの誘導、EAEマウスの種々の組織における免疫細胞の分布とサイトカインレベル（mRNA）の決意を示しています。細胞は、最終的にCNSにおける病変形成をもたらす炎症過程の時間依存性の概要を提供するために、疾患の経過中の異なる時点で単離しました。

<table><tbody><tr><td>ABI Prism 7500 配列検出システム&nbsp;</td><td>Applied Biosystems, Austin, USA</td><td></td><td>定量PCRシステム</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich Munich, Germany</td><td>A6964</td><td>cell detachment solution</td></tr><tr><td>CD3-PE-CF594</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>562286</td><td></td></tr><tr><td>CD4-V500</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>560782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-eFluor650</td><td>eBioscience, Frankfurt, Germany</td><td>95-0081-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-eFluor605</td><td>eBioscience, Frankfurt, Germany</td><td>93-0112-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-AlexaFluor700</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>560583</td><td></td></tr><tr><td>CD19-APC-H7&nbsp;</td><td>BD、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD45-Vioblue&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-092-910</td><td></td></tr><tr><td>CompBeads</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>552843 compensation</td><td>beads</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Sigma Aldrich Munich, Germany</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Cytometric absolute count standard&nbsp;</td><td>Polyscience, Eppelheim, Germany</td><td>BLI-580-10</td><td></td></tr><tr><td>サイトメーターのセットアップとトラッキングビーズ&nbsp;</td><td>BD、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>642412</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma アルドリッチ、ミュンヘン、ドイツ</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>EAE Kit</td><td>Hooke Laboratories、ローレンス、アメリカ</td><td>EK2110</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE-Cy7&nbsp;</td><td>BioLegend, Fell, Germany</td><td>123114</td><td></td></tr><tr><td>First Strand cDNA-Synthesis kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific、Schwerte、ドイツ</td><td>K1612</td><td></td></tr><tr><td>Fc受容体-1ブロッキングバッファー&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometric absolute count standard</td><td>Polyscience, Eppelheim, Germany</td><td>580</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo software v10&nbsp;</td><td>Treestar、アッシュランド、米国</td><td></td><td>フローサイトメトリーソフトウェア</td></tr><tr><td>LSRII/Fortessa&nbsp;</td><td>BD、ハイデルベルク、ドイツ</td><td></td><td>フローサイト</td></tr><tr><td>メーターLy6G-APC-Cy7&nbsp;</td><td>BD、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>560600</td><td></td></tr><tr><td>Lysingソリューション&nbsp;</td><td>BD、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Maxima SYBR Green&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>K0221</td><td>蛍光DNA結合色素&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasyミニキット&nbsp;</td><td>Qiagen、ヒルデン、ドイツ</td><td>74104</td><td>RNA抽出キット</td></tr></tbody></table>

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

多発性硬化症は、認知および運動障害を生じる中枢神経系（CNS）において病変形成することを特徴とする炎症性自己免疫疾患であると推定されます。それはまた、CNS内の病変形成、運動障害を特徴とし、また、自己免疫疾患および炎症反応により駆動されるので、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、MSの有用な動物モデルです。 EAEモデルの一つは、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（MOG）マウスにおける35-55に由 ​​来するペプチドを用いて誘導されます。 EAEマウスは、進行性疾患のコースを開発しています。このコースは3つのフェーズに分かれています。前臨床段階（日0から9）、疾患の発症（日10から11）と急性期（日12から14）。 MSおよびEAEは、CNSに浸潤する自己反応性T細胞によって誘導されます。これらのT細胞は、さらに、免疫細胞の動員をもたらすケモカインおよびサイトカインを分泌します。脊髄dのため、免疫細胞の分布3疾患の段階をuringすることを検討しました。 T細胞、B細胞および単球の活性化/増殖/蓄積が開始される疾患の時点を強調するために、リンパ節、脾臓および血液中の免疫細胞の分布についても評価しました。さらに三病段階におけるいくつかのサイトカイン（IL-1β、IL-6、IL-23、TNFα、IFNγ）のレベルは、疾患の炎症過程への洞察を得るために、測定されました。結論として、データは、EAEの病理中の免疫細胞の機能プロファイルの概要を説明します。

図1は、この記事で説明されているさまざまな方法の概略図を示します。1）マウスは、MOG 35-55抗原の注射を受け、10.7±0.3日28後の初期の臨床症状を起こします。 EAEマウスの代表的な疾患経過を図1に示されている。2）種々の組織（脾臓、リンパ節、腰部脊髄）および血液を前臨床段階（2日目、4日目の間に異なる時点で制御し、EAEマウスから抽出され、6日目）、疾患の発症時（10日目）および疾患（12日目、14日目）。3）EAEの発生を調節するサイトカインのmRNA発現プロフィールの急性期の間、さまざまな決定されます組織は、定量的PCRを用いて、疾患の経過中の異なる時点で抽出した。4）単一細胞抽出種々の組織から単離されます疾患の経過および免疫細胞の分布の間の異なる時点でフローサイトメトリーを用いて決定しました。 <p...

この原稿は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルの誘導と採点の方法、およびさまざまな疾患段階におけるフローサイトメトリーと定量的PCRをそれぞれ使用して、リンパ節、脾臓、血液、脊髄の免疫細胞分布とmRNAサイトカインレベルの評価を説明しています。

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルの全体的な目的は、多発性硬化症の発症に寄与する潜在的な分子メカニズムの研究を促進することです。この手法は、免疫細胞が疾患のどの段階で中枢神経系に浸潤するかなど、多発性硬化症分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、EAEモデルが脱髄や免疫細胞の浸潤など、多発性硬化症の主要な特徴の多くを模倣していることです。この手法の意義は、この方法で試験された薬剤がすでに多発性硬化症の治療薬として承認されていることから、同疾患の治療へと広がっています。一般的に、この手法に不慣れな者は、EAEを誘導する際に考慮すべき徹底した条件があるため、困難を感じる可能性があります。マウスはストレスのない環境で飼育し、百日咳毒素は調製直後のものを使用する必要があります。リンパ節の単離および脊髄の抽出は、記述だけでは習得することが困難であるため、本手法の公式な実演が極めて重要です。まず、400 microgramsのmycobacterium tuberculosisを含む200 microlitersのcomplete Freund's adjuvantに乳化させた200 microgramsのmyelin oligodendrocyte glycoproteinを、10～13週齢の雌マウスに皮下注射します。直ちにかつ24時間後に、0.2 µgの百日咳毒素を200 µLのPBSに溶解し、マウスに腹腔内投与します。臨床症状の発現を妨げる可能性のあるストレスを回避するため、EAE誘導前にマウスをハンドリングおよび実験環境に順応させておくことが不可欠です。投与の1週間後から、表に記載されている臨床症状についてマウスを毎日観察します。EAE誘発後のリンパ節免疫細胞集団を評価するため、誘発後 appropriate なタイミングで、切開部位を 80%isopropanol で湿らせ、股関節領域の皮膚を慎重に除去します。ピンセットを用いて、脂肪組織から鼠径リンパ節を慎重に取り出します。その後、リンパ節の重量を測定し、サンプルを氷上の PBS に浸します。脊髄細胞を解析するために、動物の背面にイソプロパノールを塗布し、メスを用いて脊柱に沿って縦方向に切開します。次に、皮膚を取り除き、後肢に神経支配を行っている脊髄の腰部を切り出します。PBSを満たしたシリンジで脊柱内を洗浄し、脊髄を抽出します。腰髄の約1/3を除去した後、脊髄断片の重量を測定し、組織を氷上のPBS中で保存します。脾臓の免疫細胞集団を解析するため、組織を切開して下腹部にアクセスします。次に、脾臓を取り出し、組織の約1/8を切除します。脾臓の断片を計量し、組織を氷上のPBSで保存します。次に、2 mLシリンジのプランジャーを使用して、残りの組織を50 mLチューブ上の70 micronメッシュシーブで磨砕し、続いてストレーナーを5 mLのPBSで洗浄します。ろ過した細胞を遠心分離します。ペレットを500 µLの細胞溶解バッファーで再懸濁し、細胞を1.5 mLチューブに移します。室温で10分間静置した後、500 µLのPBSで細胞を2回洗浄します。2回目の洗浄後、ペレットを100 µLの0.2% BSA含有PBSで再懸濁し、2 µLのFc受容体ブロッキングバッファーを細胞に加えます。室温の暗所で15分間置いた後、13 µLの抗体カクテルを用いて細胞をさらに室温の暗所で15分間標識します。インキュベーション終了後、500 µLのPBSで細胞を少なくとも2回洗浄し、最終的なペレットを500 µLの新鮮なPBSに再懸濁します。その後、細胞を氷上のフローサイトメトリーチューブに移します。最後に、フローサイトメトリーでサンプルを解析するために、測定の直前に、絶対細胞数を決定するためのフローサイトメトリー用絶対数標準物質を30 microliters、細胞に添加します。その後、フローサイトメーターでサンプルを解析します。この図が示すように、EAE誘導の急性期には、リンパ節内のすべての免疫細胞集団の一過性の増加が観察されます。しかしながら、脾臓においては、マクロファージ、B細胞、T細胞、および好中球のみに浸潤の増加が見られます。血液中では、すべての免疫細胞集団が、前臨床相において末梢血循環中の transient な増加を示し、これは疾患の急性相における腰髄での同様の疾患依存的な増加と一致します。ただし、単球集団は除外されます。これは、単球が脊髄に進入した後にマクロファージへと分化するためと考えられます。ここでは、異なる細胞集団を評価するためのゲーティング戦略を示します。細胞数は、解析した組織量または血液量に関連しており、絶対細胞数を反映しています。リンパ節では、前臨床期にIL-23 mRNAの発現が増加し、一方でIL-6の発現は疾患の進行に依存して増加します。脾臓では、前臨床期にIL-6およびIL-23の発現が増加しますが、IL-1 beta mRNAの発現は疾患の発症まで影響を受けません。血液中では、TNF-alpha mRNAのみの発現が疾患依存的に上昇します。腰髄においては、急性期にTNF-alpha、IL-1 betaおよびinterferon gammaが誘導される一方、IL-6は疾患の発症期にのみ上昇します。EAEモデルの作製に習熟し、適切に実施すれば、10匹のマウスにおけるその後の細胞分離および効果解析を8時間で完了させることができます。この手順に続き、mRNA発現解析の結果を確認するために、ウェスタンブロットやELISAなどの他の手法を実施することができます。この技術の開発により、多発性硬化症の分野の研究者が中枢神経系における脱髄のメカニズムを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、EAEモデルの誘導方法および、再現性のあるフローサイトメトリーの結果を得るための免疫細胞の分離方法について、十分に理解できるはずです。完全フロイントアジュバントの使用は極めて危険であることに留意し、本処置の実施には、マウスの皮膚を持ち上げ、注射針が完全に皮膚を貫通していることを確認するといった予防策を講じる必要があります。

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