マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導
2016年5月8日
この原稿は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルの誘導と採点の方法、およびさまざまな疾患段階におけるフローサイトメトリーと定量的PCRをそれぞれ使用して、リンパ節、脾臓、血液、脊髄の免疫細胞分布とmRNAサイトカインレベルの評価を説明しています。
実験的自己免疫性脳脊髄炎またはEAEモデルの全体的な目標は、多発性硬化症の発症の根底にある潜在的な分子メカニズムの研究を促進することです。この方法は、免疫細胞が病気のどの段階で中枢神経系に浸潤するかなど、多発性硬化症領域の主要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、EAEモデルが脱髄や免疫細胞浸潤など、多発性硬化症の主要な特徴の多くを模倣
していることです。この手法の意味は、この方法でテストされた薬がすでにこの病気に対して承認されているため、多発性硬化症の治療にまで及びます。一般に、この方法に不慣れな個人は、EAEを誘発する際に考慮しなければならない徹底的な条件があるため、苦労するでしょう。マウスはストレスのない環境で飼育する必要があり、百日咳毒素は新たに準備する必要があります。
リンパ節の分離と脊髄の抽出は説明だけでは習得が難しいため、この方法の公式デモンストレーションは重要です。まず、10〜13週齢の雌マウスに200マイクログラムのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を皮下注射します。200マイクロリットルのフルフロイントアジュバントで乳化し、400マイクログラムの結核菌を含有しています。
直ちに、そして24時間後に、200マイクロリットルのPBS中に0.2マイクログラムの百日咳毒素をマウスに腹腔内注射する。マウスは、EAE誘導前に取り扱いと実験環境の両方に適応し、ストレスを誘発することで臨床症状の発症を防ぐことができることが不可欠です。注射の1週間後、表に記載されているように、マウスの臨床症状を毎日検査します。
EAE誘導リンパ節免疫細胞集団を評価するには、導入後の適切な時点で、切開領域を80%イソプロパノールで濡らし、股関節領域の皮膚を慎重に取り除きます。鉗子を使用して、脂肪組織から鼠径リンパ節を慎重に取り除きます。次に、ノードを秤量し、サンプルを氷上のPBSに置きます。
脊髄細胞を分析するには、動物の背中をイソプロパノールで濡らし、メスを使用して脊椎を縦方向に切り込みます。次に、皮膚を取り除き、背骨の腰部を解剖し、後肢を神経支配します。PBSを充填したシリンジで脊椎を洗い流し、脊髄を取り出します。
腰椎の約1/3を切除した後、脊椎片の重量を量り、組織を氷上のPBSで保存します。脾臓免疫細胞集団を解析するには、組織を開いて腹部の下部にアクセスします。次に脾臓を取り出し、組織の約1/8を切り取ります。
脾臓片を秤量し、組織を氷上のPBSに保存します。次に、2mLシリンジのプランジャーを使用して、50ミリリットルのチューブに70ミクロンのメッシュふるいで残りの組織を浸軟させ、続いて5ミリリットルのPBSストレーナーを洗浄します。ろ過した細胞を遠心分離します。
ペレットを500マイクロリットルの細胞溶解バッファーに再懸濁し、細胞を1.5ミリリットルのチューブに移します。室温で10分後、500マイクロリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。2回目の洗浄後、ペレットをPBS中の0.2%BSAの100マイクロリットルに再懸濁し、細胞に2マイクロリットルのFc受容体1ブロッキングバッファーを追加します。
室温で暗所で15分間過ごした後、13マイクロリットルの抗体カクテルで細胞を標識し、暗所で室温でさらに15分間観察します。インキュベーションの終わりに、細胞を500マイクロリットルのPBSで少なくとも2回洗浄し、最終ペレットを500マイクロリットルの新鮮なPBSに再懸濁します。次に、細胞を氷上のフローサイトメトリーチューブに移します。
最後に、フローサイトメトリーでサンプルを分析するには、フローサイトメトリー測定の直前に、30マイクロリットルのフローサイトメトリー絶対カウント標準を細胞に加えて、絶対細胞カウントを決定します。次に、フローサイトメーターでサンプルを分析します。この図が示すように、EAE誘導の急性期には、リンパ節内のすべての免疫細胞集団の一時的な増加が観察されます。
しかし、脾臓では、マクロファージ、B細胞、T細胞、好中球のみが浸潤の増加を示します。血液中では、すべての免疫細胞集団は、前臨床段階で末梢循環の一時的な増加を示し、これは疾患の急性期における腰椎の同様の疾患依存性の増加に対応します。単球集団は例外であり、これはおそらく脊髄への侵入後にマクロファージに分化します。ここでは、異なる細胞集団の評価のためのゲーティング戦略を示します。
細胞の数は、分析された組織の量または血液量に関連しており、絶対細胞数を反映しています。リンパ節では、IL-23 mRNAの発現は前臨床段階で増加しますが、IL-6の発現は疾患依存的に増加します。脾臓では、IL-6およびIL-23の発現は前臨床段階で増加しますが、IL-1ベータmRNAの発現は疾患の発症まで影響を受けません。
血液中では、TNF-α mRNAのみの発現がアップレギュレーションされ、疾患依存的な方法で発現します。腰椎では、TNF-α、IL-1ベータ、インターフェロンガンマが急性期に誘導されますが、IL-6は疾患の発症期にのみアップレギュレーションされます。EAEモデル、その後の細胞単離、および効果解析は、適切に実行されれば、10匹のマウスで8時間で完了します。
この手順に続いて、ウェスタンブロットやELISAなどの他の方法を実行して、mRNA発現解析の結果を確認できます。その開発後、この技術は、多発性硬化症の分野の研究者が中枢神経系の脱髄のメカニズムを探求する道を開きました。このビデオを見れば、EAEモデルを誘導する方法と、再現性のあるフローサイトメトリーの結果を得るために免疫細胞を分離する方法について十分に理解できるはずです。
完全なフロイントのアジュバントを使用する作業は非常に危険であることを忘れないでください、そしてこの手順を実行する際には、マウスの皮膚を持ち上げ、注射器による完全な皮膚浸透を確保するなどの予防措置を講じる必要があります。
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概要
この原稿は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルの誘導とスコアリングの方法について説明しています。また、フローサイトメトリと定量PCRを使用して様々な組織における免疫細胞分布とmRNAサイトカインレベルの評価についてもカバーしています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 免疫学
- 自己免疫
背景
- EAEモデルは多発性硬化症の研究に使用されます。
- 脱髄など、疾患の重要な特徴を模倣します。
- 免疫細胞浸潤の理解は治療法開発にとって重要です。
- 成功したEAE誘導には適切な条件が不可欠です。
研究目的
- 多発性硬化症の分子メカニズムを調査すること。
- 中枢神経系における免疫細胞浸潤のタイミングを決定すること。
- 多発性硬化症の潜在的な治療法の有効性を評価すること。
使用された方法
- 実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の誘導。
- 免疫細胞分布評価のためのフローサイトメトリ。
- mRNAサイトカインレベル測定のための定量PCR。
- 様々な疾患段階での分析。
主な結果
- リンパ節、脾臓、血液、脊髄における免疫細胞分布の特徴づけ。
- 異なる疾患段階におけるサイトカインmRNAレベルの定量化。
- EAE進行中の免疫応答のタイミングに関する洞察。
- 多発性硬化症研究のための信頼できるツールとしてのEAEモデルの検証。
結論
- EAEモデルは多発性硬化症メカニズムの研究に効果的です。
- 結果は疾患における免疫細胞ダイナミクスの理解に貢献します。
- 結果は多発性硬化症の治療戦略に情報を提供する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The EAE model provides a mechanistic platform for interrogating autoimmune pathways in multiple sclerosis, enabling target validation through immune cell profiling and cytokine dynamics. By mapping temporal immune infiltration across tissues, the method supports preclinical de-risking of immunomodulatory candidates. This facilitates data-driven go/no-go decisions in neuroinflammatory drug discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of T-cell, B-cell, and monocyte trafficking to identify drivers of CNS inflammation.
- Operational Value: Standardized immune cell isolation from lymph nodes, spleen, blood, and spinal cord supports reproducible target engagement assays.
- Predictive Value: Cytokine mRNA quantification (IL-6, IL-23, TNF-α, IFN-γ, IL-1β) across disease phases informs biomarker selection for mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Flow cytometry protocols with absolute counting standards enable quantitative immune cell profiling for assay standardization.
- Reproducibility: Defined disease phases (preclinical, onset, acute) provide temporal windows for consistent immune monitoring across compound testing.
- Scalability: Tissue processing workflows (spleen maceration, spinal cord flushing) support batch analysis of immune populations in preclinical studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Immune cell distribution in spinal cord mirrors CNS pathology, enabling correlation of peripheral biomarkers with target engagement.
- Translational Continuity: Cytokine expression kinetics in blood and lymphoid tissues inform predictive modeling of drug effects on immune trafficking.
- Risk Mitigation: Longitudinal immune profiling reduces mechanistic ambiguity in lead optimization for neuroinflammatory indications.
Pipeline & Workflow Integration
The EAE model integrates into discovery workflows by providing immune-mediated phenotype readouts between target validation and lead optimization stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of autoimmune mechanisms via temporal immune cell tracking in secondary lymphoid organs and CNS.
- Screening: Standardized immune cell yields from spleen and lymph nodes support high-throughput flow cytometry screening of immunomodulators.
- Analytics: Absolute cell counts and mRNA cytokine levels deliver quantitative outputs for comparing treatment effects across disease phases.
- Translational Research: Blood-to-spinal cord immune cell correlation supports biomarker-driven progression from discovery to preclinical efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Standard operating procedures for EAE induction and tissue harvesting enable cross-project reuse in autoimmune disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in autoimmune target validation through longitudinal immune profiling.
- Operational Value: Standardized tissue processing and flow cytometry protocols ensure reproducible immune quantification across sites.
- Strategic Value: Early immune biomarker identification improves capital efficiency by de-risking candidates before costly CNS penetration studies.
- Portfolio Impact: Immune kinetics data enable risk-adjusted prioritization of immunomodulators based on target engagement evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, surgical tissue dissection, and flow cytometry to ensure sample integrity.
- Dependent on sterile preparation of complete Freund's adjuvant and pertussis toxin for consistent disease induction.
- Necessitates standardized timing of tissue harvest relative to clinical scoring to align immune data with disease phases.
- Requires flow cytometry infrastructure with absolute counting capabilities for accurate immune cell quantification.
- Limited by inter-animal variability in disease onset, necessitating cohort-based statistical analysis for robust conclusions.
