マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルの全体的な目的は、多発性硬化症の発症に寄与する潜在的な分子メカニズムの研究を促進することです。この手法は、免疫細胞が疾患のどの段階で中枢神経系に浸潤するかなど、多発性硬化症分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、EAEモデルが脱髄や免疫細胞の浸潤など、多発性硬化症の主要な特徴の多くを模倣していることです。

この手法の意義は、この方法で試験された薬剤がすでに多発性硬化症の治療薬として承認されていることから、同疾患の治療へと広がっています。一般的に、この手法に不慣れな者は、EAEを誘導する際に考慮すべき徹底した条件があるため、困難を感じる可能性があります。マウスはストレスのない環境で飼育し、百日咳毒素は調製直後のものを使用する必要があります。

リンパ節の単離および脊髄の抽出は、記述だけでは習得することが困難であるため、本手法の公式な実演が極めて重要です。まず、400 microgramsのmycobacterium tuberculosisを含む200 microlitersのcomplete Freund's adjuvantに乳化させた200 microgramsのmyelin oligodendrocyte glycoproteinを、10～13週齢の雌マウスに皮下注射します。

直ちにかつ24時間後に、0.2 µgの百日咳毒素を200 µLのPBSに溶解し、マウスに腹腔内投与します。臨床症状の発現を妨げる可能性のあるストレスを回避するため、EAE誘導前にマウスをハンドリングおよび実験環境に順応させておくことが不可欠です。投与の1週間後から、表に記載されている臨床症状についてマウスを毎日観察します。

EAE誘発後のリンパ節免疫細胞集団を評価するため、誘発後 appropriate なタイミングで、切開部位を 80%isopropanol で湿らせ、股関節領域の皮膚を慎重に除去します。ピンセットを用いて、脂肪組織から鼠径リンパ節を慎重に取り出します。その後、リンパ節の重量を測定し、サンプルを氷上の PBS に浸します。

脊髄細胞を解析するために、動物の背面にイソプロパノールを塗布し、メスを用いて脊柱に沿って縦方向に切開します。次に、皮膚を取り除き、後肢に神経支配を行っている脊髄の腰部を切り出します。PBSを満たしたシリンジで脊柱内を洗浄し、脊髄を抽出します。

腰髄の約1/3を除去した後、脊髄断片の重量を測定し、組織を氷上のPBS中で保存します。脾臓の免疫細胞集団を解析するため、組織を切開して下腹部にアクセスします。次に、脾臓を取り出し、組織の約1/8を切除します。

脾臓の断片を計量し、組織を氷上のPBSで保存します。次に、2 mLシリンジのプランジャーを使用して、残りの組織を50 mLチューブ上の70 micronメッシュシーブで磨砕し、続いてストレーナーを5 mLのPBSで洗浄します。ろ過した細胞を遠心分離します。

ペレットを500 µLの細胞溶解バッファーで再懸濁し、細胞を1.5 mLチューブに移します。室温で10分間静置した後、500 µLのPBSで細胞を2回洗浄します。2回目の洗浄後、ペレットを100 µLの0.2% BSA含有PBSで再懸濁し、2 µLのFc受容体ブロッキングバッファーを細胞に加えます。

室温の暗所で15分間置いた後、13 µLの抗体カクテルを用いて細胞をさらに室温の暗所で15分間標識します。インキュベーション終了後、500 µLのPBSで細胞を少なくとも2回洗浄し、最終的なペレットを500 µLの新鮮なPBSに再懸濁します。その後、細胞を氷上のフローサイトメトリーチューブに移します。

最後に、フローサイトメトリーでサンプルを解析するために、測定の直前に、絶対細胞数を決定するためのフローサイトメトリー用絶対数標準物質を30 microliters、細胞に添加します。その後、フローサイトメーターでサンプルを解析します。この図が示すように、EAE誘導の急性期には、リンパ節内のすべての免疫細胞集団の一過性の増加が観察されます。

しかしながら、脾臓においては、マクロファージ、B細胞、T細胞、および好中球のみに浸潤の増加が見られます。血液中では、すべての免疫細胞集団が、前臨床相において末梢血循環中の transient な増加を示し、これは疾患の急性相における腰髄での同様の疾患依存的な増加と一致します。ただし、単球集団は除外されます。これは、単球が脊髄に進入した後にマクロファージへと分化するためと考えられます。ここでは、異なる細胞集団を評価するためのゲーティング戦略を示します。

細胞数は、解析した組織量または血液量に関連しており、絶対細胞数を反映しています。リンパ節では、前臨床期にIL-23 mRNAの発現が増加し、一方でIL-6の発現は疾患の進行に依存して増加します。脾臓では、前臨床期にIL-6およびIL-23の発現が増加しますが、IL-1 beta mRNAの発現は疾患の発症まで影響を受けません。

血液中では、TNF-alpha mRNAのみの発現が疾患依存的に上昇します。腰髄においては、急性期にTNF-alpha、IL-1 betaおよびinterferon gammaが誘導される一方、IL-6は疾患の発症期にのみ上昇します。EAEモデルの作製に習熟し、適切に実施すれば、10匹のマウスにおけるその後の細胞分離および効果解析を8時間で完了させることができます。

この手順に続き、mRNA発現解析の結果を確認するために、ウェスタンブロットやELISAなどの他の手法を実施することができます。この技術の開発により、多発性硬化症の分野の研究者が中枢神経系における脱髄のメカニズムを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、EAEモデルの誘導方法および、再現性のあるフローサイトメトリーの結果を得るための免疫細胞の分離方法について、十分に理解できるはずです。

完全フロイントアジュバントの使用は極めて危険であることに留意し、本処置の実施には、マウスの皮膚を持ち上げ、注射針が完全に皮膚を貫通していることを確認するといった予防策を講じる必要があります。