マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

この原稿は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルの誘導と採点の方法、およびさまざまな疾患段階におけるフローサイトメトリーと定量的PCRをそれぞれ使用して、リンパ節、脾臓、血液、脊髄の免疫細胞分布とmRNAサイトカインレベルの評価を説明しています。

実験的自己免疫性脳脊髄炎またはEAEモデルの全体的な目標は、多発性硬化症の発症の根底にある潜在的な分子メカニズムの研究を促進することです。この方法は、免疫細胞が病気のどの段階で中枢神経系に浸潤するかなど、多発性硬化症領域の主要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、EAEモデルが脱髄や免疫細胞浸潤など、多発性硬化症の主要な特徴の多くを模倣

この手法の意味は、この方法でテストされた薬がすでにこの病気に対して承認されているため、多発性硬化症の治療にまで及びます。一般に、この方法に不慣れな個人は、EAEを誘発する際に考慮しなければならない徹底的な条件があるため、苦労するでしょう。マウスはストレスのない環境で飼育する必要があり、百日咳毒素は新たに準備する必要があります。

リンパ節の分離と脊髄の抽出は説明だけでは習得が難しいため、この方法の公式デモンストレーションは重要です。まず、10〜13週齢の雌マウスに200マイクログラムのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を皮下注射します。200マイクロリットルのフルフロイントアジュバントで乳化し、400マイクログラムの結核菌を含有しています。

直ちに、そして24時間後に、200マイクロリットルのPBS中に0.2マイクログラムの百日咳毒素をマウスに腹腔内注射する。マウスは、EAE誘導前に取り扱いと実験環境の両方に適応し、ストレスを誘発することで臨床症状の発症を防ぐことができることが不可欠です。注射の1週間後、表に記載されているように、マウスの臨床症状を毎日検査します。

EAE誘導リンパ節免疫細胞集団を評価するには、導入後の適切な時点で、切開領域を80%イソプロパノールで濡らし、股関節領域の皮膚を慎重に取り除きます。鉗子を使用して、脂肪組織から鼠径リンパ節を慎重に取り除きます。次に、ノードを秤量し、サンプルを氷上のPBSに置きます。

脊髄細胞を分析するには、動物の背中をイソプロパノールで濡らし、メスを使用して脊椎を縦方向に切り込みます。次に、皮膚を取り除き、背骨の腰部を解剖し、後肢を神経支配します。PBSを充填したシリンジで脊椎を洗い流し、脊髄を取り出します。

腰椎の約1/3を切除した後、脊椎片の重量を量り、組織を氷上のPBSで保存します。脾臓免疫細胞集団を解析するには、組織を開いて腹部の下部にアクセスします。次に脾臓を取り出し、組織の約1/8を切り取ります。

脾臓片を秤量し、組織を氷上のPBSに保存します。次に、2mLシリンジのプランジャーを使用して、50ミリリットルのチューブに70ミクロンのメッシュふるいで残りの組織を浸軟させ、続いて5ミリリットルのPBSストレーナーを洗浄します。ろ過した細胞を遠心分離します。

ペレットを500マイクロリットルの細胞溶解バッファーに再懸濁し、細胞を1.5ミリリットルのチューブに移します。室温で10分後、500マイクロリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。2回目の洗浄後、ペレットをPBS中の0.2%BSAの100マイクロリットルに再懸濁し、細胞に2マイクロリットルのFc受容体1ブロッキングバッファーを追加します。

室温で暗所で15分間過ごした後、13マイクロリットルの抗体カクテルで細胞を標識し、暗所で室温でさらに15分間観察します。インキュベーションの終わりに、細胞を500マイクロリットルのPBSで少なくとも2回洗浄し、最終ペレットを500マイクロリットルの新鮮なPBSに再懸濁します。次に、細胞を氷上のフローサイトメトリーチューブに移します。

最後に、フローサイトメトリーでサンプルを分析するには、フローサイトメトリー測定の直前に、30マイクロリットルのフローサイトメトリー絶対カウント標準を細胞に加えて、絶対細胞カウントを決定します。次に、フローサイトメーターでサンプルを分析します。この図が示すように、EAE誘導の急性期には、リンパ節内のすべての免疫細胞集団の一時的な増加が観察されます。

しかし、脾臓では、マクロファージ、B細胞、T細胞、好中球のみが浸潤の増加を示します。血液中では、すべての免疫細胞集団は、前臨床段階で末梢循環の一時的な増加を示し、これは疾患の急性期における腰椎の同様の疾患依存性の増加に対応します。単球集団は例外であり、これはおそらく脊髄への侵入後にマクロファージに分化します。ここでは、異なる細胞集団の評価のためのゲーティング戦略を示します。

細胞の数は、分析された組織の量または血液量に関連しており、絶対細胞数を反映しています。リンパ節では、IL-23 mRNAの発現は前臨床段階で増加しますが、IL-6の発現は疾患依存的に増加します。脾臓では、IL-6およびIL-23の発現は前臨床段階で増加しますが、IL-1ベータmRNAの発現は疾患の発症まで影響を受けません。

血液中では、TNF-α mRNAのみの発現がアップレギュレーションされ、疾患依存的な方法で発現します。腰椎では、TNF-α、IL-1ベータ、インターフェロンガンマが急性期に誘導されますが、IL-6は疾患の発症期にのみアップレギュレーションされます。EAEモデル、その後の細胞単離、および効果解析は、適切に実行されれば、10匹のマウスで8時間で完了します。

この手順に続いて、ウェスタンブロットやELISAなどの他の方法を実行して、mRNA発現解析の結果を確認できます。その開発後、この技術は、多発性硬化症の分野の研究者が中枢神経系の脱髄のメカニズムを探求する道を開きました。このビデオを見れば、EAEモデルを誘導する方法と、再現性のあるフローサイトメトリーの結果を得るために免疫細胞を分離する方法について十分に理解できるはずです。

完全なフロイントのアジュバントを使用する作業は非常に危険であることを忘れないでください、そしてこの手順を実行する際には、マウスの皮膚を持ち上げ、注射器による完全な皮膚浸透を確保するなどの予防措置を講じる必要があります。