血液処理のための迅速な方法は、ヒト血液中の血漿ペプチドレベルの収量を増やすには

このRAPID法の全体的な目標は、ヒトの血液中で測定される内因性ペプチドホルモンの収量を改善することです。RAPID法は、ラットでの使用のために最近確立され、ヒトの血液での使用にも適しています。RAPID法は収量を向上させ、内因性ペプチドの正しい分子形態の検出を可能にします。

RAPID法は使いやすいです。ただし、RAPID法は、標準的な採血と比較して、より時間と費用がかかります。したがって、研究環境でより適用可能かもしれません。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、サンプルのタイムリーな希釈と、適切なペプチドレベルを確保するために非常に重要な溶出として重要です。前腕静脈から一晩の絶食後、標準化された時間に静脈血を採取します。そして、標準的な手順、またはRAPID法に従って処理します。

採血前に運動や喫煙をしないように被験者に指示します。標準的な処理では、冷却したEDTA入りチューブで血液を採取し、10分以内に3000Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を採取し、ラジオイムノアッセイによるさらなる処理まで摂氏マイナス80度に保ちます。

RAPID処理を行うには、氷冷したRAPIDバッファーで血液を直ちに1〜10に希釈します。PH 3 ポイント 6 で、ゼロポイント 1 モルのアモニウムアシテートが含まれています。ゼロポイント5モル塩化ナトリウム、および酵素阻害剤。

10分以内に、RAPIDサンプルを3000Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を回収します。次に、クロマトグラフィーカートリッジに100%アクチトニトリルを毎分10ミリリットルで充填します。0.1%トリフルオロ酢酸またはTFAによる平衡化後。

シリンジポンプを使用して、RAPIDサンプル上清を毎分1ミリリットルの一定速度でロードします。カートリッジを0.1%TFAの3ミリリットルで毎分10ミリリットルで洗浄した後、0.1%TFAを含む70%アセトニトリルの2ミリリットルでRAPIDサンプルを毎分2ミリリットルでゆっくりと溶出します。溶出したサンプルを真空遠心分離機で乾燥させ、マイナス80°Cで保存し、ラジオイムノアッセイによるさらなる処理まで行います。

ヨウ素125ラジオ標識ヒトペプチドを入手します。実験までペプチドを粉末状に保ちます。その後、0.1%酢酸で新たに希釈します。

標準的な処理では、採血直後、冷却されたEDTA含有チューブに、3000〜6000CPMを含む50マイクロリットルの放射性標識を含むチューブに1ミリリットルの血液を移します。RAPID処理のためには、血液を含む1ミリリットルのEDTAを9ミリリットルのRAPID緩衝液を保持するチューブに移し、500マイクロリットルの放射性標識には30, 000〜60, 000 CPMが含まれています。1〜10希釈のため、RAPID処理には10倍の量の放射性標識を使用してください。

RAPIDメソッドのさまざまなステップを適用した直後に、ガンマカウンターを使用して放射性標識ペプチドの回収率を評価します。試料を真空遠心分離で乾燥させず、マイナス80°Cで保存してください。測定のために、上清をガンマカウンターに収まるチューブに移します。

そして、分あたりのカウントを評価します。標準サンプル中の上清全体を測定します。RAPIDサンプルでは、総体積の10分の1を分析して、使用した放射性標識の量を同等にします。

100% 標準試料として、処理を受けていない 50 マイクロリットルのヨウ素 125 放射性標識ペプチドを含む 2 つのサンプルを使用します。すべてのサンプルの放射能を同時に測定します。チューブを含むチルドEDTAで血液を採取し、15, 000〜20, 000 CPMを含む200マイクロリットルの放射性標識アシルグレリンを保持しているチューブに1ミリリットルを移し、標準的な処理を行います。

RAPID処理のためには、9ミリリットルのラピッドバッファーと、15, 000〜20, 000 CPMを含む放射性標識アシルグレリン200マイクロリットルを保持するチューブに1ミリリットルの血液を移します。その後、以前と同様にサンプルを処理します。逆相HPLCによるさらなる分析では、0.1%TFAを添加した水中の17%アセトニトリルで平衡化した安定結合C18カラムにサンプルを直接ロードします。

5分間の平衡化後、17〜40%アセトニトリルのグラジエントを使用して、サンプルを40分で1分あたり1ミリリットル溶出します。1分ごとに1ミリリットルの画分を収集し、ガンマカウンターを使用して放射能を分析します。別の実験では、15, 000〜20, 000 CPMを含む放射性標識アシルグレリンを200マイクロリットルの放射性標識アシルグレリンを直接カラムにロードし、以前と同様にHPLCを実行します。

ラジオイムノアッセイでは、凍結した上清と真空乾燥粉末を室温で解凍します。ラジオイムノアッセイの直前に、乾燥したRAPIDサンプルを血漿の元の量に応じて、二重蒸留水に再懸濁します。キスペプチンと総グレリン、およびアシルグレリンを、メーカーのプロトコルに従って市販のラジオイムノアッセイを使用して評価します。

安定したパレット形成が可能なホウケイ酸チューブをご使用ください。1日目に、サンプルをアッセイバッファーおよび一次アチボディと、メーカーが提供する希釈液で24時間インキュベートします。2日目に、ヨウ素125トレーサーを加え、ボルテックスし、24時間インキュベー

3日目に、沈殿試薬をボルテックスに加え、メーカーが推奨するようにインキュベートします。次に、チューブを3, 000Gで摂氏4度で20分間遠心分離します。上清を取り除き、ガンマカウンターを使用してパレット内の放射能をカウントします。

総グレリンからアシルグレリンを差し引いた差として、デサシルグレリンを計算します。個々のサンプルごとにアシルをデサシルグレリンごとにダイビングすることにより、アシル、デサシルグレリン比を評価します。可能であれば、アッセイ間のばらつきを避けるために、すべてのサンプルを1つのバッチで処理します。

RAPID血液処理は、標準的な血液処理と比較して、ヒト血液中のヨウ素125放射性標識ペプチドの収量を増加させます。標準的な血液処理後、放射性標識ペプチドの回収率は、9つのペプチドで48%から68%の範囲でした。RAPID処理は、71%から98%の範囲の回復で、すべてのヨウ素125標識ペプチドの収量を改善しましたここに示されているのは、標準またはRAPID血液処理後のヒト血液中のヨウ素125標識アシルグレリンの溶出プロファイルです。

RAPID処理後、グレリンと標識されたヨウ素125は、期待された位置で回避されました。標準手順の後、以前のピークが観察されました。おそらくデサシルグレリンに対応しています。

これは、ペプチドの62%の分解に相当します。RAPID血液処理は、標準的な処理と比較して、アシル、デサシルグレリンの比率を改善します。RAPID処理後、正常体重の被験者の血液中のアシル、デサシルグレリン比は1〜3でした。

標準的な血液処理後の1対23と比較して。同様の結果は、拒食症および肥満の条件下で観察されました。RAPID血液処理は、標準的な処理と比較して、内因性キスペプチンの血中濃度を増加させます。

拒食症の被験者と正常体重の被験者の両方で、循環内因性キスペプチンレベルは、標準的な処理と比較してRAPID後に有意に高かった。.この差は、肥満の条件下では有意ではありませんでした。一度習得し、適切に実行すると、このテクニックは1時間以内に行うことができます。

この方法は、ペプチドの予想濃度が低い場合、またはグループ間の差が小さい場合に特に重要です。ペプチドの一般的な推奨値は示せません。各ペプチドの潜在的な利点は、最初に一度テストする必要があります。

この技術は、さまざまな分野の研究者が内因性ペプチドホルモンの収量、さらに重要なことに正しい分子型を探求する道を開きます。このビデオを見た後、人間の血液処理にRAPID法を適用する方法をよく理解しているはずです。