Name: 血液処理のための迅速な方法は、ヒト血液中の血漿ペプチドレベルの収量を増やすには (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 学ぶRAPID血液処理法によるヒト血液中の内因性ペプチドホルモン収量向上と正確な分子形態評価法。この手法は研究現場での応用に適しており、ペプチド研究の精度向上に貢献します。

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この作品は、教育研究03IPT614A（CG）のためのドイツの研究財団STE 1765 / 3-1（AS）とドイツ省によってサポートされていました。私たちは、その優れた技術サポートだけでなく、身体測定値の組織と実行のヘルプのためのカリン・ヨハンソンとクリスティーナHentzschelためのラインハルト・ロンメルとペトラブッセに感謝します

プロトコルは、ヒトの研究（プロトコル番号EA1 / 10分の114）のための地域倫理委員会によって承認されました。 1.血液処理<ol><li>標準的な手順やRAPID方法に従って前腕静脈およびプロセスから一晩絶食した後、07：00〜08:00の間の静脈血を採取します。被験者は、採血前に運動したり、喫煙しないように指示します。 </li><li>標準的な処理のために、4℃で10分間、3000×gで10分以内に冷やしたEDTA含有チューブ内の血液や遠心分離機を集めます。上清を収集し、ラジオイムノアッセイによってさらに処理するまで-80℃に保ちます。 </li><li>迅速な処理のために、すぐに血液を希釈し、氷冷緩衝液中で1:10（pHは3.6）、0.1M酢酸アンモニウム、0.5 M NaClを含むおよび酵素阻害剤（採血後1分以内）（ジプロチンA、E-64-D、アンチパイン、ロイペプチン、キモスタチン、1 / mlの）。その後、4℃で10分間、3,000×gで10分以内に遠心分離し、上清たちを集めますラット6で前に詳述したようにポリプロピレン製チューブにピペットをる。 <ol><li> 、100％アセトニトリル（速度10ml /分）を用いたクロマトグラフィーカートリッジを（360 mgを、55から105μm）を充電0.1％トリフルオロ酢酸（TFA、速度10ml /分）で平衡化し、1mlの一定速度で上清とロード/シリンジポンプを用いて分。 </li><li>その後3mlの0.1％TFA（流量10ml /分）でカートリッジを洗浄し、ゆっくりとTFA（2ml /分）0.1％を含有する2 mlの70％アセトニトリルで溶出します。 </li><li>ラジオイムノアッセイによってさらに処理するまで-80℃で真空遠心分離およびストアを使用してドライ溶出したサンプル。 注：ポリプロピレン（RAPID処理）とホウケイ酸（ラジオイムノアッセイ）結合特性を有意に低い表面を示すため、26の前に研究したペプチドのほとんどのペプチドの損失を最小限にチューブ内のすべてのステップを実施します。 </li></ol></li></ol> 2.測定注：このセクションの手順は、実験室で行われるべきです放射性物質との仕事のために認定されています。私が取るべき125での作業のための標準予防策。 <ol><li>放射性標識ペプチドの回復<ol><li> 125 I放射性標識ヒトのペプチドを得る（ 例えば 、アシル-グレリン、GLP-1、グルカゴン、インスリン、キスペプチン、レプチン、のNesfatin-1、PYY 3-36およびソマトスタチン-28）。 </li><li>その後、新鮮に0.1％酢酸（1mlあたり〜10万CPM）で希釈し、実験まで、粉末状のペプチドを保管してください。 </li><li>標準的な血液処理のため、直接チューブ、（実験を開始する前に、直接カウント）3,000-6,000 CPMを含む放射性標識を50μlとチューブへの血液の転送1ミリリットルを含む冷却EDTAに採血後。 </li><li> 9ミリリットルRAPIDバッファー（組成は1.3を参照のこと）および30,000〜60,000 cpmのを含む500μlの放射性標識を含むチューブに血液をEDTA含有の迅速な処理のために、転送1ミリリットルの血液。 radiolabeの1:10希釈用10倍高いボリュームに迅速な処理のためのリットル。 </li><li> 1.3.2へのステップ1.2で説明したようにその後、プロセスサンプル。 </li><li>回収実験のために、真空遠心分離によりない乾燥試料を行い、-80℃で保管しないでください。その代わりに、直接、その後ガンマカウンターを用いて放射性標識ペプチドの回収率を評価します。 </li><li> RAPIDサンプルで使用される放射性標識の量の比較可能性を得るために、全容積の1/10を分析しながら、標準試料中の全上清を測定します。測定には、ガンマカウンターにフィットするチューブに上清を転送し、カウント毎分を評価します</li><li> 100％標準として、処理を受けない125 I放射性標識ペプチドの50μlの二つのサンプルを使用しています。 2.1.7で説明したように他のサンプルと同時に測定します。 </li><li>各ペプチドについての実験を5〜6回を実行します。 </li></ol></li><li>放射性標識グレリンの高速液体クロマトグラフィー<ol><li> （c）に血液を撤回チューブと（実験の開始前に、直接カウント）15,000〜20,000 cpmのを含む200μlの放射性標識されたアシルグレリンを含むチューブへの転送1ミリリットルを含むhilled EDTA。 </li><li> RAPID処理、9ミリリットル（組成1.3を参照用）RAPIDバッファおよび15,000〜20,000 cpmのを含む200μlの放射性標識されたアシルグレリンを含むチューブに移す1ミリリットルの血液のために。 </li><li> 1.3.2へのステップ1.2で説明したようにその後、プロセスサンプル。 </li><li>逆相HPLCによるさらなる分析のために、直接水中の17％アセトニトリル（いずれも0.1％TFAを補った）で平衡化した安定な結合のC18カラム（×50mmの2.1ミリメートル、1.8μm）の上にサンプルをロードします。 </li><li> 5分間の平衡化後、40分（流速1ml /分）でサンプルを溶出するために17-40％のアセトニトリルの勾配を使用します。 </li><li> 1ミリリットル毎分の画分を収集し、ガンマカウンターを使用して放射能を分析します。 </li><li>別の実験では、負荷200μlの放射性標識されたアシルグレリンは、15,000〜20,000を含みますcpmを直接カラムにし、ステップ2.2.6に2.2.4で説明したようにHPLCを行います。 </li></ol></li><li>ラジオイムノアッセイ<ol><li>ラジオイムノアッセイのために、凍結した上清（標準処理）を解凍し、室温で乾燥した粉末（RAPID法）真空。 </li><li>直前のラジオイムノアッセイ、プラズマ（500μL）の元のボリュームに応じて二重蒸留H 2 Oで乾燥RAPIDサンプルを再懸濁。 </li><li> 12,27の前に説明したように、製造業者のプロトコルに従って商業ラジオイムノアッセイを用いてキスペプチンと合計（desacylとアシルグレリンの両方を含む）、ならびにアシルグレリンを評価します。安定したペレットの形成を可能にホウケイ酸チューブを使用してください。 <ol><li>初日には、24時間の期間のためにメーカーが提供する希釈でアッセイ緩衝液および一次抗体（ 例えば 、抗グレリン）でサンプルをインキュベートします。 </li><li> 2日目に、125 Iトレーサー（ 例えば 、125 I-グレリン）を追加し、VORTEXと24時間の期間インキュベートします。 </li><li> 3日目に、沈殿試薬、渦を追加し、製造業者により推奨されるようにインキュベートします。その後、遠心分離管、4℃で20分間、3,000×gで。上清を取り出して、ガンマカウンターを使用して、ペレット中の放射能をカウント</li></ol></li><li>総マイナスアシルグレリンの差としてdesacylグレリンを計算します。各個々のサンプルのためdesacylグレリンによってアシルを分割することにより、アシル/ desacylグレリン率を評価します。 </li><li>すべてのサンプルを処理する - 可能であれば - 1バッチで、アッセイ間変動を避けるために。今回の実験でアッセイ内変動は&lt;、&lt;アシルグレリンの合計と&lt;9％7％キスペプチンは8％でした。 </li></ol></li></ol> 3.統計分析<ol><li>コルモゴロフ - スミルノフ検定を使用して、データの分布を決定します。平均±平均の標準誤差（SEM）としてデータを表現します。 </li><li>両者の違いを評価しますt検定により群。ホルム-シダック法に続くすべてのペアワイズ多重比較手順（テューキー事後テスト）または双方向ANOVAによって複数のグループ間の差異を評価します。 </li><li> p &lt;0.05 の有意で検討し、統計プログラムを使用して分析を行います。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々は、血液処理のための迅速な方法は、ラット6で標準的な血液処理に比較して11月12日のペプチドの回復を改善することの前に報告しました。本研究では、この方法は、ヒトにおける使用に適していることを示しています。迅速な処理に続いて、テストした9 125 9のI標識ペプチドの回復は、標準的な血液処理（氷上でEDTA血液）に比べて改善されました。観察された改善は、特に、ペプチドの収率が低い場合にマスクされる可能性がある唯一の微妙な違いが予想される条件下で、関連する可能性がある19-39％の範囲でした。 標準的な血液処理後に2/3がグレリンをdesacylに分解されながら、我々はまた、正しい分子形態（アシルグレリン）を示すRAPID血液処理グレリンがHPLC後に正しい溶出位置で検出された後ことを示しました。アシル基は、D、グレリン受容体28に結合するために必須であるので電子アシル化が大幅ペプチドの生物学的機能を変化させることが期待されます。しかしながら、desacylグレリンは、ますます生物学的に活性なペプチド29<...

肥満1,2の世界的な増加罹患率の光では、食物摂取規制の分野での研究は重要性を増しています。唯一のペプチドが知られているこれまでのところそれが末梢 ​​生成され、中央に食物摂取を刺激するように作用するが、すなわちグレリン3は 、過去数十年以内に、ペプチドの広い範囲は、例えば 、食物摂取を減少させることが確認されています。レプチン、ペプチドYY（PYY）、また、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）およびインシュリン4は 、そのため、空腹および満腹ペプチドレベルの調節機構を調査する研究において頻繁に評価され、同時に、それが想定され研究ペプチドが安定してプラズマ形成中に高収量で回収されます。 例えばのために前に示したようにしかし、非常に多くの場合、これは、急速な内因性の故障にそうではありません。グレリン5を desacylするアシルから分解されるグレリン。したがって、我々は最近、血液プロセスへのための迅速な方法を説明しましたR析出温度、cidificationを採用したラットで歌う、Pは 私は外因性コントロールとDの ilution 6を sotopic、阻害をrotease。この方法は、標準的な血液処理（氷上でEDTA血液）6と比較して、正しい循環分子形態の決意について試験し、許可された11 12のペプチドの回復を改善しました。この方法は、コルチコトロピン放出因子13と同様に、グレリンの循環の検出のためにいくつかのその後の研究7-12で使用されています。したがって、この方法は、げっ歯類のペプチド研究のために有用であることがわかりました。げっ歯類の研究は常に別の種に翻訳可能ではないので、この方法は、同様に、ヒトの血液中での使用のために確立されるべきです。 本研究の目的は、広く14と頻繁にuの推奨される標準的な血液処理、氷上でEDTA血液、と比較して、ヒトでの血液処理のための迅速な方法を試験することでした臨床だけでなく、研究の場でのsed。 （食物摂取に対する効果を表1に示した）処理の後、我々は、確立されたペプチドを含む食物摂取の調節に関与する125 I標識化ペプチドの選択の回復をテストならびに新しい候補は、最近、摂食調節における役割を果たすことが示唆しました両方の方法で。ホルモンは、異なる長さおよび電荷（ 表2）のペプチドを表すために選択しました。また、グレリンのために我々は、標準およびRAPID方法以下の分子形態（複数可）を調べました。最後に、我々は、ペプチドはまた、最近RAPIDまたは標準処理以下の食物摂取15,16の調節に役割を果たしていることが示唆、内因性グレリン（アシルおよびdesacylグレリン）、ならびにキスペプチンレベルを評価しました。さらに、我々はまた、possibを研究するために（10.2から67.6 kg /日m 2の範囲）ボディマス指数の広い範囲で被験体の集団において、これらのペプチドのレベルを調査しました慢性的に改変された体重に関連するル違い。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/53959/53959table1.jpg" /><img alt="表2" src="/files/ftp_upload/53959/53959table2.jpg" />診断、評価、およびプラン： 試験参加者 すべての試験参加者は、新たにシャリテ-Universitätsmedizinベルリンで心身医学の部門の（封入病院に入院の2日以内であった）の患者を入院し、書面によるインフォームドコンセントを与えました。性別の影響を回避するために唯一の女性患者が含まれていました。 42科目の合計は、この研究に参加し、3群に分けた：正常体重（BMI 18.5〜25キロ/ m 2であり、N = 12）、神経性無食欲症（BMI &lt;17.5キロ/ m 2であり、N = 15）と肥満（BMI、&gt; 30 kg /日m 2であり、n = 15）。拒食症と肥満患者ました疾患-10の国際分類に従って診断し、それぞれ体重増加（拒食症）や体重減少（肥満）、入院。すべての正常体重の患者は、関連する身体的障害なしに起因する身体表現の症状だけに入院しました。胃腸の身体表現の症状や消化管手術の既往歴のある患者は除外しました。除外基準はまた、年齢&lt;18歳、現在妊娠中や未処理の精神病疾患を包含しました。採血は、それぞれ、体重を増加または減少させるために食事療法を受ける前に、2日目または入院後3で実施しました。人体計測パラメータは、同じ日に評価しました。

<table><tbody><tr><td>Diprotin A</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>IDP-4132</td><td></td></tr><tr><td>E-64-d</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>IED-4321-V</td><td></td></tr><tr><td>Antipain</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>IAP-4062</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Peptides International, Louisville, KY, USA</td><td>ILP-4041</td><td></td></tr><tr><td>Chymostatin</td><td>ペプチドインターナショナル、ルイビル、ケンタッキー州、米国</td><td>ICY-4063</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C18カートリッジ</td><td>ウォーターズコーポレーション、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国</td><td>WAT051910</td><td>360 mg、55-105 &micro;m</td></tr><tr><td>Acyl-ghrelin</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9088-HK</td><td>Radioactive</td></tr><tr><td>GLP-1</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9035-HK</td><td>Radioactive</td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9030</td><td>Radioactive</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9011S</td><td></td></tr> 放射性<tr><td>レプチン</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>9081-HK</td><td>放射性</td></tr><tr><td>キスペプチン-10</td><td>フェニックス・ファーマシューティカルズ、カリフォルニア州バーリンゲーム、米国</td><td>T-048-56</td><td>放射性</td></tr><tr><td>ネスファチン-1</td><td>フェニックス・ファーマシューティカルズ、カリフォルニア州バーリンゲーム、米国</td><td>T-003-26</td><td>放射性</td></tr><tr><td>PYY3-36</td><td>フェニックス・ファーマシューティカルズ、バーリンゲーム、CA、米国</td><td>T-059-02&nbsp;</td><td>放射性</td></tr><tr><td>ソマトスタチン-28</td><td>フェニックスファーマシューティカルズ、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国</td><td>T-060-16&nbsp;</td><td>放射性</td></tr><tr><td>ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA</td><td>822700-902</td><td>2.1 mm x 50 mm, 1.8 & micro;m</td></tr><tr><td>アジレント 1200 LC&nbsp;</td><td>Agilent Technologies、サンタクララ、カリフォルニア州、米国HPLC</td><td></td><td>、いくつかのコンポーネント、したがって単一のカタログ番号</td></tr><tr><td>キスペプチン&nbsp;RIA</td><td>フェニックスファーマシューティカルズ、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国</td><td>#RK-048-56</td><td>放射性</td></tr><tr><td>総グレリンRIA</td><td>ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ</td>州<td>、米国#GHRT-89HK&nbsp;</td><td>放射性</td></tr><tr><td>アクティブghrelin RIA</td><td>ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国</td><td>#GHRA-88HK</td><td>放射性</td></tr><tr><td>SigmaStat 3.1</td><td>Systatソフトウェア、サンノゼ、カリフォルニア州、米国</td><td>オンラインダウンロード</td><td></td></tr></tbody></table>

血液処理のための迅速な方法は、ヒト血液中の血漿ペプチドレベルの収量を増やすには

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

食物摂取規制の分野での研究が重要性を増しています。これは、多くの場合、食物摂取を調節するペプチドの測定を含みます。ペプチドの濃度の正確な決意のためには、血液処理中に安定であるべきです。しかし、これはすぐに、内因性のペプチダーゼによって分解されるいくつかのペプチドには当てはまりません。最近、我々はR析出温度、cidificationを用いた血液処理方法を開発し、Pは 私は外因性のコントロールおよびラットでの使用のためのD ilution（RAPID）をsotopic、阻害をrotease。ここでは、ヒトで使用するためにこの技術を確立し、回復、分子形態および食物摂取規制ホルモンの循環濃度を調査しました。迅速な方法が大幅に125 I標識ソマトスタチン28（+ 39％）、グルカゴン様ペプチド-1（+ 35％）の回復、アシルグレリン及びグルカゴン（+ 32％）、インスリンおよびキスペプチン（+ 29％向上しました）、のNesfatin-1（+ 28％）、レプチン（+ 21％）と標準的な処理（氷上でEDTA血液、P &lt;0.001）と比較して、ペプチドYY 3-36（+ 19％）。標準的な処理の後にアシルグレリンの62％がそうdesacylグレリンを表す以前のピークが得られ分解された一方で、高速液体クロマトグラフィーは、迅速な処理後の予想位置での内因性アシルグレリンの溶出を示しました。標準処理た（p = 0.03）以下の1時23分に比べて3：RAPID処理した後、正常体重の被験者の血液中のアシル/ desacylグレリン比は1でした。また、内因性キスペプチンレベルは、標準的な処理に比べRAPID後に高かった（+ 99％、P = 0.02）。 RAPID血液処理方法は、ヒトで使用することができ、より高いペプチド濃度が得られ、正確な分子形態の評価を可能にします。

RAPID血液処理は、標準的な血液処理と比較して、ヒト血液中の125 I放射性標識ペプチドの収量を増加させます。 標準的な血液処理（氷上でEDTA血液）の後、放射性標識されたペプチドの回収率は9/9ペプチド（ - K 48から68パーセント、 図1Aに至るまで）で〜60％でした。 RAPID処理アシルグレリン（n-オクタノイルグレリン、グルカゴン様ペプチド-1（+ 35％、 図1B）、（+ 39％、 図1A）、すなわちソマトスタチン28で、すべての125 I標識ペプチドの歩留まりを向上させます+ 32％、 図1C）、グルカゴン（+ 32％、 図1D）、インスリン（+ 29％、 図1E）、キスペプチン（+ 29％、 図1F）、のNesfatin-1（...

RAPID血液処理方法は、ヒトで使用され、より高いペプチド濃度をもたらすだけでなく、適切な分子形態の評価を可能にすることができます。したがって、この方法は、ペプチド研究の貴重なツールとなるでしょう。

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

このRAPID法の全体的な目的は、ヒト血液中で測定される内因性ペプチドホルモンの回収率を向上させることです。RAPID法は最近ラットでの使用に向けて確立されましたが、ヒト血液への適用にも適しています。RAPID法は回収率を向上させ、内因性ペプチドの正確な分子形態の検出を可能にします。RAPID法は使いやすく簡便です。しかし、RAPID法は標準的な採血に比べて時間がかかり、コストも高くなります。そのため、研究環境での適用がより適していると考えられます。適切なペプチドレベルを確保するためには、サンプルの適時な希釈および溶出が非常に重要であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。一晩の絶食後、標準的な時間に前腕静脈から静脈血を採取してください。その後、標準的な手順またはRAPID法に従って処理します。被験者に対し、採血前の運動および喫煙を控えるよう指示してください。標準的な処理として、冷却したEDTA含有チューブに採血し、10分以内に4°C、3000 Gsで10分間遠心分離します。上清を回収し、ラジオイムノアッセイによるさらなる処理まで-80°Cで保存してください。RAPID処理を行うには、血液を氷冷したRAPIDバッファーで直ちに10倍に希釈します。このバッファーはpH 3.6で、0.1 M 酢酸アンモニウム、0.5 M 塩化ナトリウム、および酵素阻害剤を含有しています。10分以内に、RAPIDサンプルを4°Cで3000 Gs、10分間遠心分離し、ピペットを用いて上清を回収します。次に、クロマトグラフィーカートリッジに100% acetonitrileを10 mL/minでチャージします。その後、0.1% trifluoroacetic（またはTFA）で平衡化を行います。シリンジポンプを用いて、RAPIDサンプルの上清を1 mL/minの一定速度でロードします。0.1% TFA 3 mLを用いて10 mL/minでカートリッジを洗浄した後、0.1% TFAを含む70%アセトニトリル2 mLを用いて、2 mL/minの速度でRAPIDサンプルをゆっくりと溶出させます。溶出サンプルを真空遠心濃縮機で乾燥させ、ラジオイムノアッセイによるさらなる処理まで-80 °Cで保存します。ヨウ素125で放射性標識されたヒトペプチドを入手します。実験直前まで、ペプチドは粉末状態で保存してください。その後、0.1%酢酸で調製直前に希釈します。標準的な処理では、採血後すぐに冷却したEDTA含有チューブを用い、1 mLの血液を3000～6000 CPMを含む50 µLの放射性標識剤が入ったチューブに移します。RAPID処理では、1 mLのEDTA含有血液を9 mLのRAPIDバッファーが入ったチューブに移し、30,000～60,000 CPMを含む500 µLの放射性標

a-rapid-method-for-blood-processing-to-increase-yield-plasma-peptide

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

私たちは、血漿/血清学的検査のために採取した全血からゲノムDNAを単離する新たな方法を説明しています。血漿採取した後、圧縮された血液は、通常廃棄されます。当社の新規の方法は、既存の方法に比べて大幅な改善を表し、追加の血液を要求せず、単一のコレクションからのDNAやプラズマを利用できるようになります。...

血漿タンパク保存用採血キットからゲノムDNAを抽出するために実用的で新手法

このビデオでは、消化されたタンパク質溶解物混合物からペプチドを精製する逆相高速液体クロマトグラフィーのデモを行います。これらの精製されたペプチドは、凍結乾燥され、ダウンストリームアプリケーションのために保存されます。ペプチドの解析は、細胞シグナル伝達とがんに関与するメカニズムを理解するのに役立ちます。...

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このビデオでは、血小板数のスクリーニング、採血と遠心分離、血小板の単離による高品質の多血小板血漿(PRP)の調製を実演しています。このPRPは、組織の再生と治癒の治療用途に使用されます。...

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ここでは、質量分析ベースの定量プロテオミクス解析のための自動化された血漿タンパク質消化法を紹介する。このプロトコルでは、タンパク質変性、還元、アルキル化、トリプシン消化反応のための液体の移動およびインキュベーションステップが合理化され、自動化されています。所望の精密の96の井戸版を準備するのにおよそ5時間かかる。...

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学ぶRAPID血液処理法によるヒト血液中の内因性ペプチドホルモン収量向上と正確な分子形態評価法。この手法は研究現場での応用に適しており、ペプチド研究の精度向上に貢献します。

血液処理のための迅速な方法は、ヒト血液中の血漿ペプチドレベルの収量を増やすには

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