の開発と特性評価

本手順の全体的な目的は、内皮細胞を生理的に適切なせん断流下で培養し、アゴニストによって誘発されるカルシウムおよび一酸化窒素産生の変動を測定できるマイクロ流体デバイスを開発することです。この手法は、in vitroマイクロ血管モデルを検証し、in vivo研究とin vitro研究の乖離を埋めることで、マイクロ血管研究の将来的な発展に寄与します。本手法の主な利点は、さまざまな血管系を模倣できるようマイクロチャネルの設計に汎用性があること、および従来の静的な培養条件よりもin vivoに近い細胞培養環境を改善できることです。

手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室のSuleiとXiangの2名です。開始前に、テキストプロトコルに記載されている通り、標準的なフォトリソグラフィーを用いてマスターモールドを作成し、ソフトリソグラフィーを用いてPDMSマイクロチャネルデバイスを作製してください。マイクロチャネルデバイスを準備するには、まず入口と出口を薄いPDMS片で覆い、デバイスを濡れたティッシュを入れたペトリ皿の中に配置します。

次に、ディッシュをParafilmで包み、UVライト下でデバイスを少なくとも3時間滅菌します。次のステップはフィブロネクチンの塗布です。まず、インレットに30～50 µLのPBSを1滴滴下します。

出口側に真空をかけてデバイスを洗浄します。次に、入口側に100 µg/mLのフィブロネクチンを1滴滴下します。出口側に真空をかけ、フィブロネクチン溶液をロードします。

次に、入口と出口を塞ぎます。ディッシュを再びParafilmで包み、デバイスを4°Cで一晩インキュベートします。翌日、デバイスをPBSで3回手動で洗浄します。

次に、30～50 µLの細胞培養培地を注入し、37 °Cのインキュベーター内でデバイスを少なくとも15分間予熱します。まず、HUVECを8% Dextran含有HUVEC培養培地に、1 mLあたり200万～400万細胞の密度で混合します。Dextranは粘性を高め、細胞播種効率を向上させるために必要です。

次に、10〜20 µLの細胞を入口に載せ、重力またはガラスパステールピペットによる毛細管現象を用いて出口から導入します。続いて、デバイスを15〜20分間インキュベートします。その後、顕微鏡下で播種状態を確認してください。

必要に応じて、目的の細胞密度にするために細胞を追加的に導入します。十分な数の細胞を導入したら、デキストランを除去するために、通常の温めた細胞培養培地でデバイスを緩やかに洗浄します。その後、培地の灌流を行わずに6時間培養します。

次に、長期灌流のためのチューブ接続を準備します。デバイスをペトリ皿にテープで固定し、入口側のチューブを針付きシリンジに接続します。デバイスの入口と出口の両方にチューブを挿入します。

流出チューブを廃液回収容器に接続します。次に、ディッシュと廃液容器をインキュベーターに入れます。長い流入チューブを装着したシリンジを、インキュベーターのドアを通過させて外部灌流ポンプに接続します。

次に、実験計画に従って灌流速度を設定します。灌流を適切に制御することで、微小血管ネットワーク内の培養を最大2週間維持することが可能です。これにより、さまざまな生理的および病理的条件下での細胞および血液動態環境を模倣した、より長期的な研究へと拡張できます。

VE-cadherinの標識などの免疫染色の開始にあたり、まず2%パラホルムアルデヒドを用いて4°Cで30分間灌流し、細胞を固定します。ブロッキング、透過処理、および抗体による染色のための連続的な灌流後、細胞をイメージングするまでデバイスを4°Cに保持してください。細胞内のカルシウム濃度をイメージングするには、Ringer液で調製した10 mg/mLのアルブミンを、37°Cで15分間灌流します。

次に、5 µMのFluo-4 AMを用いて、37 °Cで40分間デバイスに灌流させます。その後、37 °Cで15分間、アルブミンリンガー液を用いて管腔に結合したFluo-4 AMを洗い流します。次に、Fluo-4 AMを用いた細胞内カルシウムレベルイメージングのために、共焦点システムを起動します。Fluo-4を負荷した微小血管の画像を撮影します。

ベースライン画像を10分間収集します。次に、10 micromolar ATPをデバイスに持続的に灌流し、蛍光強度の変化を20分間記録します。細胞内での一酸化窒素生成をイメージングするために、37 degrees Celsiusで albumin Ringers を15分間デバイスに灌流します。

次に、37 °Cで5 µMのDAF-2 DAを約35〜40分間細胞に灌流させます。続いて、ATP誘導性の一酸化窒素産生を測定するために、蛍光イメージングシステムをセットアップします。5分間ベースラインを記録し、その後、デバイスに10 µMのATPを灌流し、1分間隔で30分間画像を収集します。

細胞内のの一酸化窒素測定において、強度プロファイルのデタッチアダプターは、一酸化窒素の濃度ではなく、時間経過に伴う一酸化窒素の累積産生量を表していることを理解することが重要です。収集した画像から、個々の細胞レベルで関心領域（ROI）を手動で選択します。各ROIは、蛍光の輪郭で示される個々の細胞の領域をカバーします。

ATPにより誘導される血管内皮細胞のカルシウムおよび一酸化窒素の変化を定量します。Fluo-4の蛍光強度から組織のバックグラウンドを差し引くことで、その変化量を算出します。DAF-2の蛍光強度の経時的変化を一次微分することにより、一酸化窒素の生成速度を定量します。

デバイス内のマイクロチャネルパターンは、3段階の分岐ネットワークとなっています。流速 0.35 µL/min におけるせん断応力分布を推定するために、3D数値シミュレーションを実施しました。記述された方法に従い、内皮細胞をネットワーク内に播種しました。

次に、F-actinと核を標識しました。同様に、VE-cadherinも染色しました。その結果は、無傷の細静脈におけるVE-cadherinの発現と同様でした。

次に、ATPによって誘導される細胞内カルシウム濃度の上昇および一酸化窒素の産生について検討しました。カルシウム濃度は、プロトコルセクションに記載されている通り、Fluo-4 AMを用いて検討しました。一酸化窒素の産生は、プロトコルセクションに記載されている通り、DAF-2 DAを用いてモニターしました。

結果は、個別に灌流させた完全な静脈細動脈から得られたものと同等でした。この手法は、生物学的条件下および動的な流体環境において容易に、かつ厳密な制御が可能であり、これは従来のマイクロスキル技術では不可能であったことです。このビデオを視聴することで、デバイスの作製方法、ならびにカルシウムおよび一酸化窒素の測定方法について十分に理解できるはずです。

この技術は研究者がアゴニスト誘発の基礎的なメカニズムを調査することを可能にしただけでなく、生物医学研究におけるより幅広い応用の道を開きました。