の開発と特性評価インビトロ微小血管ネットワークおよび内皮の定量的測定の[Ca ²⁺]_私と一酸化窒素の生産

この手順の全体的な目標は、生理学的に関連するせん断流下で内皮細胞を成長させ、アゴニストによって誘発されるカルシウムおよび一酸化窒素産生の変化を測定するマイクロ流体デバイスを開発することです。このメッセージは、in vitroマイクロベッセルモデルを検証し、in vivo研究とin vitro研究の間のギャップを埋めることにより、マイクロベッセル研究の未来を前進させるのに役立ちます。この技術の主な利点は、さまざまな血管系を模倣するためのマイクロチャネルの用途の広い設計であり、元の培養に対する条件付き静的よりもin vivoに近い細胞培養環境を改善します。

手順を実演するのは、私の研究室の2人であるSuleiとXiangです。開始する前に、標準のフォトリソグラフィーを使用してマスターモールドを作成し、ソフトリソグラフィーを使用してテキストプロトコルで説明されているようにPDMSマイクロチャネルデバイスを作製します。マイクロチャネルデバイスを準備するには、まず入口と出口を薄いPDMSで覆い、デバイスを濡れたティッシュでペトリ皿の中に置きます。

次に、皿をパラフィルムで包み、UVライトの下で少なくとも3時間滅菌します。次のステップは、フィブロネクチンを塗布することです。まず、30〜50マイクロリットルのPBSを入口に一滴垂らします。

デバイスをすすぐために、出口に真空を作ります。次に、1ミリリットルあたり100マイクログラムのフィブロネクチンを入口に置きます。出口に真空を作り、フィブロネクチン溶液をロードします。

次に、入口と出口を覆います。皿を再びパラフィルムで包み、デバイスを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、手動でデバイスをPBSで3回すすぎます。

次に、30〜50マイクロリットルの細胞培養培地をロードし、37°Cのインキュベーターでデバイスを少なくとも15分間温めます。まず、HUVECを8%のデキストランを含むHUVEC培養培地に混合し、1ミリリットルあたり200万〜400万細胞で調製します。デキストランは、粘度を高め、細胞の播種を改善するために必要です。

次に、10〜20マイクロリットルの細胞を入口に置き、重力を使用するか、出口のガラスパスツールピペットからの毛細管現象を使用して細胞を導入します。次に、デバイスを15〜20分間インキュベートします。その後、播種状況を顕微鏡で確認します。

必要に応じて、目的のセル密度を達成するために、より多くのセルをロードします。十分な細胞がロードされたら、通常の温かい細胞培養培地でデバイスを穏やかにすすぎ、デキストランを除去します。その後、培地灌流なしでデバイスを6時間培養します。

次に、長期灌流用のチューブ接続をセットアップします。デバイスをペトリ皿にテープで固定し、インレットチューブを針でシリンジに接続します。デバイスの入口と出口の両方にチューブを挿入します。

アウトレットチューブを廃棄物収集器に接続します。次に、皿と廃棄物容器をインキュベーターに入れます。長いインレットチューブ付きのシリンジを、インキュベーターのドアを通過する外部灌流ポンプに接続します。

次に、実験計画に従って灌流速度を設定します。適切に制御された灌流により、微小血管ネットワーク内の培養物を最大2週間維持することができます。したがって、さまざまな生理学的および病理学的条件に関する細胞および血行動態環境を模倣する長期研究に拡張することができます。

VE-カドヘリン標識などの免疫染色を開始するには、まず、2%のパラホルムアルデヒドを摂氏4度で30分間灌流して細胞を固定します。一連の灌流によるブロッキング、透過処理、および抗体による染色を行った後、細胞がイメージングされるまでデバイスを摂氏4度に保ちます。細胞内のカルシウム濃度を画像化するには、10ミリグラム/ミリグラムのアルブミンをリンガー溶液に15分間、摂氏37度で灌流します。

次に、5マイクロモルのFluo-4 AMで37°Cで40分間デバイスを灌流します。次に、ルーメン結合したFluo-4 AMをアルブミンリンガーで37°Cで15分間洗い流します。次に、Fluo-4 AMを使用して細胞間カルシウムレベルイメージングのための共焦点システムを起動します。Fluo-4を装填した微小血管の画像を取得します。

ベースライン画像を 10 分間収集します。次に、10マイクロモルATPでデバイスを連続的に灌流し、蛍光強度の変化を20分間記録します。細胞内の一酸化窒素産生を画像化するには、アルブミンリンガーを装置に灌流し、摂氏37度で15分間灌流します。

次に、5マイクロモルのDAF-2 DAで細胞を37°Cで約35〜40分間灌流します。次に、ATPによる一酸化窒素の産生を測定するための蛍光イメージングシステムを設定します。ベースラインを 5 分間記録し、次に 10 マイクロモル ATP でデバイスを灌流し、1 分間隔で 30 分間画像を収集します。

細胞の一酸化窒素測定では、強度プロファイルのデタッチアダプターが一酸化窒素濃度ではなく、時間経過に伴う累積一酸化窒素生産を表していることを理解することが重要です。個々のセルレベルで収集された画像から関心領域を手動で選択します。各ROIは、floresenseアウトラインで示すことができる1人の個人の細胞の領域をカバーします。

ATPによる内皮カルシウムと一酸化窒素の変化を定量化します。Fluo-4のfloresense強度の変化を計算することにより、組織の背景を差し引いたもの。DAF-2のフローレセンス強度の最初の微分変換を経時的に実施することにより、亜酸化窒素の生成速度を定量化します。

デバイスのマイクロチャネルパターンには、3レベルの分岐ネットワークがあります。3D数値シミュレーションを行い、0.35マイクロリットル/分でのせん断応力分布を推定しました。内皮細胞は、記載されているようにネットワークに播種されていました。

次に、F-アクチンと核を標識しました。同様に、VEカドヘリンも染色されました。結果は、無傷の細静脈でのVE-カドヘリン発現と同様でした。

次に、ATPによる細胞内カルシウム産生の増加と一酸化窒素産生について検討した。カルシウムレベルは、プロトコルのセクションで説明されているように、Fluo-4 AMを使用して調べました。一酸化窒素の産生は、プロトコルのセクションで説明されているように、DAF-2 DAを使用してモニターしました。

結果は、個別に灌流された無傷の細静脈で得られた結果と同等でした。高度なものは、従来のマイクロスキル技術では不可能だった生物学的条件と動的流体環境で簡単かつ厳密に制御できました。このビデオを見れば、デバイスの製造方法と、カルシウムと一酸化窒素の測定方法について十分に理解できるはずです。

この技術が研究者に道を開いた後、アゴニスト誘導の根底にあるものを調査するだけでなく、バイオ医学研究のより広範なアプリケーションを開くことにもなりました。