Name: の開発と特性評価インビトロ微小血管ネットワークおよび内皮の定量的測定の Ca 2+ 私と一酸化窒素の生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いた内皮細胞の培養とカルシウム・一酸化窒素産生の定量測定法。HUVECを用いた生理学的シア流条件下でのリアルタイムシグナル応答解析が可能です。

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この作品は、国立心肺血液研究所によってサポートされていましたHL56237、糖尿病および消化器の国立研究所腎臓病研究所DK97391-03、国立科学財団（NSF-1227359およびEPS-1003907）を付与します。

1.マイクロ流体デバイスの製造<ol><li> SU-8 50マスター型の標準的なフォトリソグラフィ製作<ol><li>スピンコーティングする前に、シリコンウエハを清掃してください。 15分間イソプロピルアルコール（IPA）、続いて15分間アセトンで裸の2インチのシリコンウエハをすすぎます。 1時間150℃のホットプレート上に配置することによって、ウエハを脱水。脱水後、室温でウエハを冷却します。 </li><li> SU-8フォトレジストをシリコンウェハをコートをスピン。ウェハ上に2ミリリットルSU-8フォトレジストを追加します。 30秒毎分300回転/秒の加速度で1000rpmで、続いて10秒間100回転/秒の加速で500回転にウェハをランプアップします。 （補足ビデオ1を参照してください） </li><li>プリベーク30分間、95℃で10分間、次いで、ソフトベーク65℃のホットプレート上のウエハ。 </li><li>スピンコートされたフォトレジストにフィルムマスクから設計パターンを変換するためにUV露光を使用してください。フィルムマスクのような薄い透明フィルム上にパターンを印刷します。の上にフィルムマスクを配置フォトレジストをコーティングし、スピンとを300mJ / cm 2の線量でUVにさらします。 （補足動画2を参照してください） 注：このプロトコルでは、マイクロチャネルネットワークのパターン（4幅100μmの娘チャネルに分岐する159ミクロン幅の広い母チャンネル）は、CADソフトウェアで設計されています。フィルム上のパターンは、クリアフィールドとして表示され、フィルムの残りはブラックインクで覆われています。 SU-8ネガ型フォトレジストであるため、UVに曝露されるフォトレジストの部分が架橋され、​​金型の開発（ステップ1.1.6）中の溶剤に不溶となるであろう。現像後、この不溶部分が設計されたネットワークのパターンを複製し、マスターモールドとしての役割を果たす。 </li><li>ポストベーク1分、10分後、95℃で65℃のホットプレート上で露光されたウエハ。 </li><li>マスターモールドを開発します。使用未架橋フォトレジストを除去するための溶媒としてのSU-8の開発者。 3分間のSU-8現像液にウェハを浸し、IPAですすぎます1分間。 </li><li> IPAリンス後には白スジの形成（非硬化フォトレジストの残留物）が存在しなくなるまで、この開発サイクルを2-3回繰り返します。静かに窒素ガスでウエハを乾燥し、顕微鏡下でのパターンの小さな特徴を調べます。必要に応じて追加の開発サイクルを繰り返します。 </li><li>ハード15分間、150℃のホットプレート上でウェーハを焼きます。 </li></ol></li><li>ソフトリソグラフィー<ol><li>手動重量で2部のポリジメチルシロキサン（PDMS）エラストマー（ベースと硬化剤）を混ぜます。 10：1の比。 </li><li>脱ガス15分間ハウスバキュームに接続されたデシケーターとPDMS混合物。フォトレジストマスターモールドにPDMSソリューションをキャストします。 PDMSの厚さは、入口/出口管の安定した保持を提供するために、3 mm以上である必要があります。 15分間、再び脱ガスPDMS、および必要に応じて窒素ガスで残りの気泡を除去。 3時間65℃のオーブンでキャストPDMSを治します。 </li><li>の表面を清掃してくださいスコッチテープとプラズマクリーナー（30秒プラズマ処理）を有するガラスカバースリップ。 30秒間500回転/秒の加速レートで4,000 rpmのにランピングすることにより、カバーガラス上にスピンコート未硬化PDMS（0.5ミリリットル）。少なくとも30分間、65℃のオーブン中でPDMSをスピンコートしたカバースリップを硬化させます。 </li><li>カットし、マスターモールドから硬化PDMSをリリース。次に母チャンネルの先端に直径1mmの穴パンチャーを有する入口および出口を作成します。 </li><li> PDMSスピンコートしたカバーガラスにデバイスを結合。 1分間のプラズマクリーナーとPDMSとカバーガラスの表面を酸化させます。酸素プラズマ処理後、接合面での脱イオン水（DI水）の液滴を配置し、2つの部品を配置します。永久的な結合を達成するために30分間65℃のオーブンでデバイスを焼きます。 </li></ol></li></ol><img alt="補足ビデオ1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">補足ビデオ1（右クリックしてダウンロード）。</a> <img alt="補足動画2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">補足動画2（右クリックしてダウンロード）。</a> 2.内皮細胞播種と文化<ol><li>デバイス滅菌およびフィブロネクチンコーティング<ol><li>酸化からの入口/出口の周りにPDMS表面の疎水性を保持します。酸化を防止するために、スコッチテープの小さなストライプと入口と出口の周りにPDMSの表面を覆います。この手順では、充填工程（2.1.3）の間に、すべてのデバイスの上面の上に広がるのDI水を防止することができます。 </li><li>酸素プラズマFOとPDMS装置を扱いますR 5分では、このように、表面が親水性に変化するマイクロチャネルを通る流体の流れを促進し、充填手順（2.1.3）に捕捉気泡を防止します。 </li><li>入口からDI水でデバイスを埋めるために取り付けられた針またはピペットで注射器のいずれかを使用してください。出口に蓄積されたDI水（30-50μL）の液滴があるまで充填を続けます。マイクロチャネル内に閉じ込められた気泡があるかどうかを確認するために、顕微鏡下でデバイスを調べます。ティッシュペーパーとの入口と出口での過度の水滴を除去します。 </li><li>層流バイオセーフティフード内で3時間の最小値のためのUVとペトリ皿の中でデバイスを滅菌します。 、蒸発を防ぐPDMSの薄片と入口/出口をカバーするには、皿の内側に濡れたティッシュペーパーを入れ、パラフィルムで皿を包みます。 </li><li>コー​​トフィブロネクチンを持つデバイス。 （冷蔵庫に/ mlのフィブロネクチンで一晩100μgので被覆次いで、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で最初にデバイスをリンス4°C）。入口で溶液の液滴を配置し、その後、ハウス真空、針またはピペットで注射器と出口で負圧を作成します。 </li><li>細胞培養培地でデバイスを記入してください。細胞培養培地をロードする前に3回手動でPBSでデバイスを洗浄します。 37℃のインキュベーター内でデバイスをウォームアップ。 </li></ol></li><li> ECの播種および長期灌流 注：従来の静的な2DのEC文化と比較すると、連続灌流を用いたin vitro微小血管ネットワークモデルは、より近いin vivoの条件に細胞培養環境を作りました。このプロトコルで実証インビトロ微小血管ネットワークは二週間まで維持することができます。十分に制御された灌流は、連続的に、栄養素を補給廃棄物を削除して、過合流EC単層の防ぐことができます。したがって、異なるphysiologica下で細胞および血行力学環境​​を模倣し、長期の研究に拡張することができますリットルおよび病理学的条件。 <ol><li> 8％のデキストラン（モル重量7万）でHUVEC培地中の一次のHUVEC（MCDB 131）を混合します。デキストランは、ローディング媒体の粘度を増加させ、より良い細胞播種の結果を達成するために使用されます。推奨される細胞密度は、約2~4×10 6細胞/ mlです。 </li><li>デバイスに細胞を播種します。入口の上に細胞の10-20μlの液滴を配置します。出口でのガラスパスツールピペットを使用して、デバイス、または毛細管作用を傾けることのいずれかによって穏やかな流れを導入します。成功したセルの負荷のための鍵は、最小のチャネル内の流速1mm未満/秒を制御することです。 </li><li>細胞播種を確認してください。最初の播種後、顕微鏡下で播種の状態をチェックする前に、（37℃、5％CO 2の加湿雰囲気下）、15〜20分間デバイスをインキュベートします。必要であれば、所望の細胞密度を達成するために追加のセル負荷を行います。 </li><li>穏やかに37（細胞培養培地でデバイスをリンス°C）は、デキストランを除去しました。文化（37℃、5％のCO 2）インキュベーターの最初の6時間の流れの不在下での装置。 </li><li>長期灌流用チューブの接続を設定します。移動を防止するためにペトリ皿にデバイスをテープ。入口と出口のチューブ挿入用のシャーレのふたに小さな穴を作成します。細胞培養培地灌流用の針で注射器に入口チューブを接続します。ごみ収集作業員への出口チューブを接続します。 インキュベーターの外に灌流ポンプを配置しながら、細胞培養インキュベーターに入れ、デバイスと廃棄物の収集をし、長い入口チューブにより、デバイスとそれを接続します。注意して​​ください。灌流速度は、実験設計によって決定されます。本発明の装置では、0.35マイクロリットル/分の灌流速度と1-2ダイン/ cm 2の間のせん断応力範囲を使用しています。この灌流条件では、HUVECを約3-4日でコンフルエンスに達します。 </li></ol></li></ol> 3. Immunofluorescent染色<ol><li>室温で15分間すすぎ、そして30分間ブロッキングの1％BSA PBSを1倍、続いて4℃で30分間、2％パラホルムアルデヒドの灌流によってデバイスでのECを修正しました。細胞培養に用いたものと同じである灌流速度を使用します。 </li><li> 0.1％トリトンX-100抗体染色のために固定された電気部品を透過。 VEカドヘリンをラベルに5-7分間トリトンでデバイスを灌流し、ラベルF-アクチンへ3分。 </li><li>デバイスに抗体をロードします。従来のソリューションを洗い流すために15分間、1×PBSでデバイスを灌流。手動での2μg/ mlの（総容量は20-50μlである）の濃度で、デバイスへのVEカドヘリン（抗ヤギ）に対する一次抗体をロードします。 4°Cで一晩冷蔵庫にデバイスを保管してください。 45〜60分間7μgの/ mlの濃度でシリンジポンプによって二次抗体（ロバ抗ヤギ）を灌流。 </li><li>ファロイジンでEC F-アクチンにラベルを付けます。 1×PBS FOでデバイスを灌流手動で7-10分間ファロイジン（10μg/ ml）をロードする前に、R 15分。 </li><li>ラベルEC核は（材料リストを参照してください）​​。 </li><li> 1×PBSでデバイスをすすぎ、およびイメージングするまで4℃でそれを維持します。 </li></ol>内皮の4蛍光イメージングの[Ca 2+] i の <ol><li>アルブミン（10 mg / mlで）37℃で15分間-Ringer溶液でデバイスを灌流。細胞培養に用いたのと同じ灌流速度を使用します。アルブミン-リンゲル液のすべての成分の濃度は、 物質一覧に記載されています。 </li><li> ECのための共焦点システムのfluo-4 AMでの[Ca 2+] i のイメージングを設定します。 Ca 2+イメージングのための共焦点顕微鏡システムを使用してください。励起用アルゴンレーザー（488 nm）を使用し、510〜530 nmのように発光帯を設定します。 512×512走査フォーマットで：25X目標（0.95水浸、NA）を使用して画像を収集します。私の各スタックのための2ミクロンのzステップとスキャン間隔を使用します20秒の魔術師。 </li><li>アルブミン - リンゲル液とルーメンのfluo-4 AMを洗い流した後、37℃で40分間のfluo-4 AM（5μM）を持つデバイスを灌流。 </li><li>フルオ4ロードされた微小血管の画像を取得します。 10分間のベースラインの画像を収集します。 ATP（10μM）でデバイスを灌流し、20分間の蛍光強度（FI）の変更を記録。 </li></ol>一酸化窒素生産の5蛍光イメージング<ol><li> 15分間のアルブミン - リンゲル液でデバイスを灌流。細胞培養に用いたものと同じである灌流速度を使用します。 </li><li> ATP誘導性の一酸化窒素産生を測定するための蛍光イメージングシステムをセットアップします。 12ビットのデジタルCCDカメラと一酸化窒素測定のためのコンピュータ制御シャッターを備えた顕微鏡を使用します。光源として75 Wキセノンランプを使用してください。 注：干渉フィルタ（40分の480 nm）をダイクロイックミラーによってDAF-2 DA用の励起および発光波長を選択バンドパス障壁と（505 nm）を（50分の535 nm）で。画像を収集するために：20X対物レンズ（NA0.75）を使用してください。光退色最小限に抑えるために、干渉フィルタの前に中性濃度フィルタ（0.5 N）を位置決めし、0.12秒の露光時間を制限します。 </li><li> DAF-2 DA（5μM）で細胞をロードします。 37℃で約35-40分間、DAF-2 DAを持つデバイスを灌流。最初のロード後にDAF-2の蛍光強度（FI DAF）のベースラインを記録します。 注：DAF-2 DAは実験7を通して灌流液で連続的に存在しています。 </li><li> DAF-2画像を収集します。 5分間FI DAFのベースラインを記録します。 ATP（10μM）でデバイスを灌流し、1分間隔で30分間の画像を収集。同じ焦点面に細胞の同一グループからのすべての画像を収集します。 </li></ol> 6.データ解析<ol><li>手動で個々の細胞レベルで収集した画像からの利益（ROIを）の地域を選択します。各ROIは、蛍光輪郭によって示すことができる一つの個別のセルの面積をカバーします。 </li><li>バックグラウンド蛍光を減算し、各ROIの平均FIを計算します。 </li><li> ECにおけるATP誘導性の変化を測定した[Ca 2+] iとNO産生。 （FI 0アルブミン -リンガー灌流中の平均ベースラインFIは、ATPを添加する前に、あるFI / FI 0 * 100）のFluo-4 FIの変化を計算することにより、ECの[Ca 2+] i の中のATP誘導性の変化を定量化マイナス測定バックグラウンド。経時FI DAFの第一の差動変換を行うことにより、NO産生量を定量化しません。 注：FI DAFの時間経過は、時間とともに累積NO産生を表します。したがって、NO産生率は、基礎とATPが条件刺激の両方の下でFI DAFのプロファイルに基づいて計算されていません。データ分析及び実験手順の詳細は、以前の刊行物7に記載されています。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは一切競合する利益や利害を持っていません。

<html>この記事では、の[Ca 2+] iおよびNO産生が、マイクロ流体デバイスを用いて培養微小血管ネットワーク、ECジャンクションおよび細胞骨格F-アクチン分布の特徴付け、およびECの定量的測定の開発のための詳細なプロトコルを提示します。灌流マイクロ流体デバイスは、生体内微小血管の形状とせん断流動条件の近いシミュレーションを可能にするin vitroモデルを提供します。培養された微小血管ネットワークは、初代ヒトECを用いて形成することができるので、この方法は患者のサンプルから変更された血液成分を培養微小血管への患者の血液サンプルの直接灌流により人間のECにどのように影響するかを病理学的に調査し、臨床への洞察を提供するための有用なツールとして機能することができます問題。微小血管開発人間のECは、ヒトおよび動物の組織との間の薬物応答の潜在的矛盾を回避するために、薬物スクリーニングのために使用することができます。 ve_contentは &quot;&gt;このプロトコルに示したマイクロ流体デバイスの基板は、ガラスカバースリップ（150-180ミクロ...

インビボでの血管壁の内側を覆う内皮細胞（EC）は、常に流れるように露出しているが、培養された電気部品は、多くの場合、静的な条件下で増殖させ、炎症促進性の表現型1,2を示しています。マイクロフルイディクス技術は、所望の流れ条件の下で成長し、特に血管のECのために、培養細胞のための機会を提供する幾何学的に拘束されたマイクロスケール（サブミリメートル）チャネル3を介して正確に制御された流体を可能にします。これらの機能は、従来の静的な2D細胞培養物よりもin vivoでの細胞培養条件近づけます。彼らは、マイクロ流体デバイスは、血管系の種類をモデル化するために使用され、機械的および/または化学的な刺激に対するEC応答を研究する際に非常に重要です。 静的な細胞培養、生物医学Fにおける適応とマイクロフルイディクスのアプリケーションの上にマイクロチャネルネットワークによって実証利点にもかかわらずieldは限られたままです。最近のレビューによって報告された、この分野（85％）の出版物の大半は、エンジニアリングジャーナル4に残っています。マイクロ流体デバイスの性能は、ほとんどの生物学者は、このようなトランスウェルアッセイおよびこの小型化されたデバイスへのマクロスケール培養皿/ガラススライドのような現在の技術からスイッチするための十分な説得力はなかったです。マイクロフルイディクスは、前方にこのフィールドを移動するには学際的なコラボレーションを必要とする学際的なフィールドです。この技術的な記事の目的は、生物学的なアプリケーションおよびマイクロ流体微小血管の機能的検証を提供しながら、専門分野間の知識のギャップを減らし、生物学者によって製造手順が理解できるようにすることです。可視化実験プロトコルは、マイクロ流体デバイスとエンジニアと生物学者の間で緊密な連携を表し、それらの生物学的ユーティリティ、両方の製造を含みます。 我々は最近、いくつかの報告しましたマイクロ流体素子5でのin vitro微小血管ネットワークを使用して生物学的用途。適切マイクロチャネルネットワークの寸法を設計し、所望のせん断応力を適用するためには、数値モデルは密接に流れプロファイルを推定する計算流体力学ソフトウェアで構築されました。 すなわちコンフルエンスに達したマイクロチャンネル中に播種した一次ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、連続灌流で3~4日で、マイクロチャネルの全内面を覆っ。適切なバリアの形成はVE-カドヘリン染色によって実証および静的細胞培養条件下で無傷の微小血管内に形成されたものと比較しました。個別に灌流し、無傷の微小血管6-8で開発された実験プロトコルを適用することにより、我々は定量的に蛍光とアデノシン三リン酸（ATP）に応答して、ECの変化の[Ca 2+] iおよび一酸化窒素（NO）の産生を測定しましたdicators共焦点と従来の蛍光顕微鏡。 ECにおけるアゴニスト誘導増加は、の[Ca 2+] iおよびNO産生は、微小血管の透過性6-15における炎症性メディエータによって誘発される増加のために必要な細胞内シグナルとして報告されています。いくつかの以前の研究は、DAF-2 DAロードマイクロ流体デバイス16,17の画像を示したが、適切な解像度およびデータ分析はまだ18を達成していませんでした。我々の知る限りでは、この研究は、内皮におけるアゴニスト誘導性の動的変化の[Ca 2+] iとNO産生利用マイクロ流体ベースのシステムの最初の定量的測定を示しています。 微細加工技術は、ダウンして数ミクロンのマイクロチャネルを作製し、in vivoでの微小血管系の幾何学的構造を模倣するために複雑なパターンの開発を可能にする柔軟性を持っています。ここでは、分岐、3つのレベルを持つ典型的なマイクロチャネルネットワークを提示しました。このネットワークは、微細加工クリーンルーム及びソフトリソグラフィーで行われるフォトリソグラフィ技術の組合せによって製造されます。

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>A929</td><td></td></tr><tr><td>生検パンチ</td><td>ミルテック</td>ス <td>33-31 AA</td><td></td></tr><tr><td>ウシ アルブミン</td><td>MP バイオメディカル</td><td>810014</td><td></td></tr><tr><td>ウシ脳抽出物 (BBE)</td><td>ロンザ</td><td>CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>12-542C</td><td></td></tr><tr><td>DAF-2 DA</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ヤギ IgG (H+L) 二次抗体</td><td>ライフテクノロジー</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS、カルシウム、マグネシウムなし</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (核染色)&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4084</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>ブタ皮からのゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-078</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-548B</td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>豚腸粘膜由来ヘパリンナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 緩衝生理食塩水</td><td>ロンザ</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol (IPA)</td><td>VWR</td><td>89125</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Mammalian Ringer Solution Ingredient</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (132 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl (4.6 mM)</td><td>FisherScientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O (2.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 &middot;7H2O (1.2 mM)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>グルコース (5.5 mM)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO<サブ>3</サブ> (5.0 mM)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>ヘペスソルト (9.1 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6007H</td><td></td></tr><tr><td>ヘペス酸 (10.9 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6003H</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Culture Medium</td><td>Life Technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ファロイジン(F-アクチン染色)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Exel Int</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>3M</td><td>34-8711-3070-3</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2050 Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 開発者</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chemical Book</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン中和剤溶液</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA 溶液 (TE)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>チューブ</td><td>コールパーマー</td><td>PTFEマイクロボアチューブ、0.012 "ID x 0.030" OD</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin</td><td>サンタクルス</td><td>バイオテクノロジーSC-6458</td><td></td></tr><tr><td>機器の名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント/説明</td></tr><tr><td>バイオセーフティ層流フード</td><td>NuAire</td><td>NU-425クラスII、タイプA2</td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>浜松</td><td>オルカ</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>デシケーター</td><td>Bel-Art</td><td>F42022</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>ウェネスコ</td><td>HP-1212</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp oven</td><td>Barnstead</td><td>3608-5</td><td></td></tr><tr><td>リソグラフィーベンチ</td><td>Karl Suss</td><td>MA6 接触式リソグラフィー</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>L200 ND &CCDカメラ用Diaphod 300</td><td></td></tr><tr><td>シャッター</td><td>サッター機器</td><td>ラムダ10-2</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>PVA TePla/Harrick プラズマ</td><td>M4L/PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>Brewer Science</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプシステム</td><td>ハーバード装置</td><td>703005</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア名</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント/説明</td></tr><tr><td>CADソフトウェア</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2015</td><td></td></tr><tr><td>CFDシミュレーションソフトウェア</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td><td></td></tr><tr><td>画像はNOプロダクションで取得および分析します&nbsp;</td><td>ユニバーサルイメージングメタ</td><td>フロー</td><td></td></tr></tbody></table>

の開発と特性評価<em&gt;インビトロ</em&gt;微小血管ネットワークおよび内皮の定量的測定の[ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt;私</sub&gt;と一酸化窒素の生産

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

インビボでの血管壁の内側を覆う内皮細胞（EC）は、常に流れるように露出しているが、培養された電気部品は、多くの場合、静的な条件下で増殖させ、炎症促進性の表現型を示しています。マイクロ流体デバイスの開発は、二十年以上のエンジニアに受け入れてきたが、それらの生物学的用途が限定されたまま。より生理学的に関連する生物学的用途によって検証試験管内微小血管モデル内のフィールドを進め、in vivoでおよびin vitroの研究で間のギャップを埋めることが重要です。ここで、我々は長期的な灌流能力を備えたマイクロ流体デバイスを用いて培養微小血管網の開発のための詳細な手順を提示します。また、共焦点と従来の蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムでECの[Ca 2+] iおよび一酸化窒素（NO）の生産におけるアゴニスト誘発変化の定量的測定のためのアプリケーションを示しています。形成された微小血管ネット連続灌流との仕事は、ECの間でよく発達した接合部を示しました。 VEカドヘリン分布を静的培養EC単層よりも無傷の微小血管で観察されたものと近かったです。 EC過渡増加するATP誘発性の[Ca 2+] iとNO産生を定量的培養微小血管の機能性を検証し、個々の細胞レベルで測定しました。このマイクロ流体デバイスは、電気部品が近いin vivoでの従来の静的な2D培養に比べ細胞培養環境を作るよく制御され、生理学的に関連する流れ、下に成長することができます。マイクロチャンネルネットワーク設計は、非常に汎用性があり、製造プロセスが簡単で、再現性があります。デバイスは、容易に高解像度の画像化を可能にする共焦点又は従来の顕微鏡システムに一体化することができます。培養された微小血管ネットワークが初代ヒトのECにより形成することができるので、最も重要なのは、このアプローチはどのように調査するために有用なツールとして機能します病理学的に患者サンプルから変更された血液成分は人間のECに影響を与え、臨床問題への洞察を提供します。それはまた、薬物スクリーニングのためのプラットフォームとして開発することができます。

このセクションでは、このプロトコルを使用して開発した培養微小血管網で得られた結果の一部を示しています。マイクロチャネルのパターンは、3レベルの分岐ネットワーク（ 図1A）です。この設計では、4幅100μm娘チャネルに再び2 126ミクロン幅チャネル、および支店に159μmの広い母のチャネルブランチ。 3次元数値シミュレーションは、このマイクロチャネルネットワーク内のせん断応力の3つの異なるレベルを示し0.35μL/分の流速（ 図1B）、下のせん断応力分布を推定するために行きました。マイクロチャネル内の層流は、乱れまたは二次流の存在なしに流体力学的に安定であることが予測されます。 SU-8マスター型は、標準的なフォトリソグラフィ工程（ 図1C）で作製した後、PDMSデバイスは、マイクロチャネルねを複製するために、ソフトリソグラフィ技術によって作製しました透明、通気性足場（ - E 図1D）にtworkデザイ...

Primary Human Umbilical Vein endothelial cells (HUVECs)は、マイクロ流体ネットワークデバイス内で合流するように増殖しました。内皮細胞結合とF-アクチンの分布が示され、アデノシン三リン酸(ATP)に応答した細胞内カルシウム濃度と一酸化窒素産生の変化が個々の細胞レベルでリアルタイムで定量されました。

の開発と特性評価<em&gt;インビトロ</em&gt;微小血管ネットワークおよび内皮の定量的測定の[Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt;私</sub&gt;と一酸化窒素の生産

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

本手順の全体的な目的は、内皮細胞を生理的に適切なせん断流下で培養し、アゴニストによって誘発されるカルシウムおよび一酸化窒素産生の変動を測定できるマイクロ流体デバイスを開発することです。この手法は、in vitroマイクロ血管モデルを検証し、in vivo研究とin vitro研究の乖離を埋めることで、マイクロ血管研究の将来的な発展に寄与します。本手法の主な利点は、さまざまな血管系を模倣できるようマイクロチャネルの設計に汎用性があること、および従来の静的な培養条件よりもin vivoに近い細胞培養環境を改善できることです。手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室のSuleiとXiangの2名です。開始前に、テキストプロトコルに記載されている通り、標準的なフォトリソグラフィーを用いてマスターモールドを作成し、ソフトリソグラフィーを用いてPDMSマイクロチャネルデバイスを作製してください。マイクロチャネルデバイスを準備するには、まず入口と出口を薄いPDMS片で覆い、デバイスを濡れたティッシュを入れたペトリ皿の中に配置します。次に、ディッシュをParafilmで包み、UVライト下でデバイスを少なくとも3時間滅菌します。次のステップはフィブロネクチンの塗布です。まず、インレットに30～50 µLのPBSを1滴滴下します。出口側に真空をかけてデバイスを洗浄します。次に、入口側に100 µg/mLのフィブロネクチンを1滴滴下します。出口側に真空をかけ、フィブロネクチン溶液をロードします。次に、入口と出口を塞ぎます。ディッシュを再びParafilmで包み、デバイスを4°Cで一晩インキュベートします。翌日、デバイスをPBSで3回手動で洗浄します。次に、30～50 µLの細胞培養培地を注入し、37 °Cのインキュベーター内でデバイスを少なくとも15分間予熱します。まず、HUVECを8% Dextran含有HUVEC培養培地に、1 mLあたり200万～400万細胞の密度で混合します。Dextranは粘性を高め、細胞播種効率を向上させるために必要です。次に、10〜20 µLの細胞を入口に載せ、重力またはガラスパステールピペットによる毛細管現象を用いて出口から導入します。続いて、デバイスを15〜20分間インキュベートします。その後、顕微鏡下で播種状態を確認してください。必要に応じて、目的の細胞密度にするために細胞を追加的に導入します。十分な数の細胞を導入したら、デキストランを除去するために、通常の温めた細胞培養培地でデバイスを緩やかに洗浄します。その後、培地の灌流を行わずに6時間培養します。次に、長期灌流のためのチューブ接続を準備します。デバイスをペトリ皿にテープで固定し、入口側のチューブを針付きシリンジに接続します。デバイスの入口と出口の両方にチューブを挿入します。流出チューブを廃液回収容器に接続します。次に、ディッシュと廃液容器をインキュベーターに入れます。長い流入チューブを装着したシリンジを、インキュベーターのドアを通過させて外部灌流ポンプに接続します。次に、実験計画に従って灌流速度を設定します。灌流を適切に制御することで、微小血管ネットワーク内の培養を最大2週間維持することが可能です。これにより、さまざまな生理的および病理的条件下での細胞および血液動態環境を模倣した、より長期的な研究へと拡張できます。VE-cadherinの標識などの免疫染色の開始にあたり、まず2%パラホルムアルデヒドを用いて4°Cで30分間灌流し、細胞を固定します。ブロッキング、透過処理、および抗体による染色のための連続的な灌流後、細胞をイメージングするまでデバイスを4°Cに保持してください。細胞内のカルシウム濃度をイメージングするには、Ringer液で調製した10 mg/mLのアルブミンを、37°Cで15分間灌流します。次に、5 µMのFluo-4 AMを用いて、37 °Cで40分間デバイスに灌流させます。その後、37 °Cで15分間、アルブミンリンガー液を用いて管腔に結合したFluo-4 AMを洗い流します。次に、Fluo-4 AMを用いた細胞内カルシウムレベルイメージングのために、共焦点システムを起動します。Fluo-4を負荷した微小血管の画像を撮影します。ベースライン画像を10分間収集します。次に、10 micromolar ATPをデバイスに持続的に灌流し、蛍光強度の変化を20分間記録します。細胞内での一酸化窒素生成をイメージングするために、37 degrees Celsiusで albumin Ringers を15分間デバイスに灌流します。次に、37 °Cで5 µMのDAF-2 DAを約35〜40分間細胞に灌流させます。続いて、ATP誘導性の一酸化窒素産生を測定するために、蛍光イメージングシステムをセットアップします。5分間ベースラインを記録し、その後、デバイスに10 µMのATPを灌流し、1分間隔で30分間画像を収集します。細胞内のの一酸化窒素測定において、強度プロファイルのデタッチアダプターは、一酸化窒素の濃度ではなく、時間経過に伴う一酸化窒素の累積産生量を表していることを理解することが重要です。収集した画像から、個々の細胞レベルで関心領域（ROI）を手動で選択します。各ROIは、蛍光の輪郭で示される個々の細胞の領域をカバーします。ATPにより誘導される血管内皮細胞のカルシウムおよび一酸化窒素の変化を定量します。Fluo-4の蛍光強度から組織のバックグラウンドを差し引くことで、その変化量を算出します。DAF-2の蛍光強度の経時的変化を一次微分することにより、一酸化窒素の生成速度を定量します。デバイス内のマイクロチャネルパターンは、3段階の分岐ネットワークとなっています。流速 0.35 µL/min におけるせん断応力分布を推定するために、3D数値シミュレーションを実施しました。記述された方法に従い、内皮細胞をネットワーク内に播種しました。次に、F-actinと核を標識しました。同様に、VE-cadherinも染色しました。その結果は、無傷の細静脈におけるVE-cadherinの発現と同様でした。次に、ATPによって誘導される細胞内カルシウム濃度の上昇および一酸化窒素の産生について検討しました。カルシウム濃度は、プロトコルセクションに記載されている通り、Fluo-4 AMを用いて検討しました。一酸化窒素の産生は、プロトコルセクションに記載されている通り、DAF-2 DAを用いてモニターしました。結果は、個別に灌流させた完全な静脈細動脈から得られたものと同等でした。この手法は、生物学的条件下および動的な流体環境において容易に、かつ厳密な制御が可能であり、これは従来のマイクロスキル技術では不可能であったことです。このビデオを視聴することで、デバイスの作製方法、ならびにカルシウムおよび一酸化窒素の測定方法について十分に理解できるはずです。この技術は研究者がアゴニスト誘発の基礎的なメカニズムを調査することを可能にしただけでなく、生物医学研究におけるより幅広い応用の道を開きました。

development-characterization-vitro-microvessel-network-quantitative

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

新生児マウスの網膜は血管新生を調節する別の遺伝子や薬剤の役割の調査を可能にし、血管新生のよく特徴付け生理学的モデルを提供...

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色<em生体内で&gt;</em

マイクロチャネル·オン·チップ·プラットフォームは、フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせによって開発されました。内皮マイクロチャネルプラットフォームは、 インビボにおける微小血管の3次元（3D）ジオメトリを模倣する制御された連続かん流の流れの下で実行され、高品質かつリアルタイムイメージングを可能にし、微小血管の研究に適用することができる。...

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

管形成アッセイは、 インビトロ血管新生を測定するための高速、定量可能な方法である。内皮細胞は、馴化培地と混合し、基底膜抽出物でメッキされる。管形成は容易に定量時間と新たに形成された細管内で発生する。...

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ<em&gt;体外</em&gt;血管新生に関する研究

血管細胞機能は、細胞内メッセンジャーの活性に依存します。 ここで説明するのは、単離された大動脈の個々の内皮細胞および平滑筋細胞における生理学的および薬理学的刺激に応答した細胞内カルシウムおよび一酸化窒素レベルの測定を可能にするex vivo...

細胞内カルシウムの二光子イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;取扱い及び内皮における一酸化窒素産生および単離されたラット大動脈の平滑筋細胞

ここで説明は、(1) たてそのまま脳血管内皮「チューブ」と内皮細胞のカルシウムと膜内皮由来過分極電位 (2) 同時計測を隔離するためのプロトコルです。さらに、これらのメソッド内皮細胞カルシウムと個々...

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

誘導多能性幹細胞(iPSC-EPs)に由来する内皮前駆体は、心血管疾患治療に革命を起こさせ、より忠実な心血管疾患モデルの作成を可能にする可能性を秘めています。本明細書において、三次元(3D)コラーゲン微小環境におけるiPSC-EPの封入およびこれらの細胞の血管球電位の定量分析について説明する。...

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

ここでは、マイクロ流体チップと、新生血管形成の初期微小環境を再現する、自動制御された高効率循環マイクロ流体システムを提供し、高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布によって内皮細胞(ECs)を同時に刺激することを可能にする。...

新血管新生初期事象を模倣する微発性モデル

このアッセイは、3Dコラーゲンゲルで培養した胚様体に分化したマウス胚性幹細胞を利用して、 in...

インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

脳実質細動脈からの無傷のマウス脳内皮「チューブ」の集中的な調製は、脳血流調節を研究するために例示される。さらに、我々は、細胞内[Ca2+]および膜電位の変化を含む重要な細胞シグナル伝達経路の蛍光イメージングおよび電気生理学的測定のためのこの内皮研究モデルの実験的強みを実証する。...

マウス脳実質の動脈内皮の単離と機能解析

このプロトコルは、長鎖および超長鎖飽和脂肪酸のBODIPY-C12およびBODIPY-C16蛍光類似体による刺激時に内皮細胞における細胞脂質取り込みを測定するためのin...

蛍光脂肪酸類似体を用いた内皮脂肪酸取り込みの定量化

学ぶマイクロ流体デバイスを用いた内皮細胞の培養とカルシウム・一酸化窒素産生の定量測定法。HUVECを用いた生理学的シア流条件下でのリアルタイムシグナル応答解析が可能です。

の開発と特性評価

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