Name: 赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶ赤外蛍光色素標識オリゴヌクレオチドを用いたゲルシフトアッセイの最適化プロトコル。SOX-2タンパク質とDNAプローブの相互作用を非放射性で検出し、分子生物学研究の安全性と効率性を向上させる。

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この研究は、アルフレッド・P・スローン研究フェローシップ(C.-F.C.)とNIH R01助成金(5R01GM098026-05からC.-F.C.)によって支援されました。高度な赤外線イメージングシステムへのアクセスを提供してくれたDavid Croweに感謝します。

注：蛍光標識したDNAプローブまたは標識されたDNAの他の形態を使用EMSAsは、タンパク質または細胞抽出物の調製、タンパク質-DNA結合反応、およびPAGEゲルを調製するために同じプロトコルを共有し（ 図1A）を実行します 。主な違いは、DNA標識手順、ポストランゲル処理工程、および検出方法です。 1.ジェルの準備<ol><li>ミニタンパク質ゲルシステム（8.3センチメートル幅X 7.3センチメートル縦x 0.75ミリメートルの厚さ）を使用して、0.5倍のTBE（45 mMトリス - ホウ酸、1mMのEDTA）および2.5％グリセロールを含む5％未変性ポリアクリルアミドゲルを準備します。 <ol><li> 、5×TBEの、3ミリリットル（0.45 Mトリス - ホウ酸、10mMのEDTA）、50％グリセロールの1.5 mLを4：ゲル用のゲル溶液の30ミリリットルを調製するために、30％アクリルアミド/ビスの5ミリリットル（1 37.5）を混ぜます10％アンモニウム過硫酸塩の300μL、TEMEDの15μL、そして徹底的にのddH 2 Oの20.2 mLです。 注：アクリルアミドは有害で毒性である、適切な個人保護具を使用して処理します。 </l私&gt; </ol></li><li>すぐにゲル溶液をキャストします。重合後、0.5×TBEで予め湿らせラップし、4℃で保管し、透明なプラスチックでゲルをラップします。 </li></ol>赤外蛍光色素で標識されたプローブの調製注：準備、保管、および実験中に離れて、できるだけ多くの光から赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを保管してください。 <ol><li>デザインやオーダーオリゴヌクレオチド。 <ol><li> 〜51マーのための長いオリゴヌクレオチドを設計します。 注：LIM-4 / SOX-2プローブの長いオリゴヌクレオチド配列はTATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCCです。長いオリゴヌクレオチドは、PAGEまたはHPLC精製を必要としません。 </li><li> 5 &#39;末端（5&#39;Dye）と37℃以上の溶融温度での赤外蛍光色素修飾を有する〜14量体のための補完的な短いオリゴヌクレオチドを設計します。 注：LIM-4 / SOX-の短いオリゴヌクレオチド配列2プローブは5&#39;Dye-GGGAGAAGATTTTGです。 5&#39;Dye標識した短いオリゴヌクレオチドの最小の合成スケールは100nmです。したがって、オリゴヌクレオチドはHPLC精製を必要とします。 </li></ol></li><li> 1×トリスEDTA緩衝液中で再懸濁したオリゴヌクレオチド（TE：10mMのトリス-HCl、pH8.0の、1mMのEDTA）、100μMの最終濃度まで。 </li><li>ショート（5&#39;Dye）とロングオリゴヌクレオチドをアニール。 <ol><li> ; 10mMトリス - 塩酸、pHを100mMのNaCl：（100μM）、ロングオリゴの1.2μL（100μM）、および塩化ナトリウム、トリス-EDTA緩衝液の28.2μL（STE 5&#39;Dye-ショートオリゴの0.6μLを混ぜます8.0; 1mMのEDTA）1.5 mLチューブインチ</li><li> 5分間沸騰水中でチューブを置きます。熱源の電源をオフにして、アニールしたオリゴは、暗闇の中でO / Nを冷却して水をしてみましょう。 </li></ol></li><li>二本鎖DNAプローブを作るためにクレノウDNAポリメラーゼによるアニール5&#39;Dye-ショート/ロングオリゴの5 &#39;オーバーハングを入力してください。 <ol><li>混合して反応を準備します5&#39;Dyeタグとアニールショート/ロングオリゴの30μL、8.5μLの10×クレノウ緩衝液、10mMのdNTPの1.7μL、1.7クレノウのμL（3 &#39; - &gt; 5&#39;エキソ - ）（5 U /μL）、および0.2mLのPCRチューブ内のddH 2 Oの43.1μL。 </li><li> PCR機で37℃で60分間インキュベートします。 </li><li>反応して熱を停止するために3.4μLの0.5 M EDTAを追加PCR装置で20分間75℃で不活性化します。 </li></ol></li><li> 0.1μMの最終濃度STEで塗りつぶされたプローブ（0.7μM）を希釈します。 </li><li>使用する直前まで、暗所で-20℃で保存オリゴ。オリゴは、この状態で年間まで保存することができます。 注：変異体の結合部位を有するDNAプローブを生成するには、長いオリゴヌクレオチドの変異体バージョンは、クレノウで5 &#39;オーバーハングのフィルインが続く5&#39;Dye標識短いオリゴヌクレオチドでアニールされます。一方の鎖を有するプローブは、赤外蛍光で標識されたことが示されています色素は、色素で標識された両方の鎖を有するプローブのわずか30％の強度を有します。信号強度を強化する必要がある場合、両方の鎖の長いオリゴの5 &#39;末端に赤外蛍光色素で標識し、赤外蛍光色素で標識されたプローブを作製するためにアニールされます。 </li></ol>ラベルなし/コールドプローブ（競技者）の調製注：相補的な配列（ロングとLongR）のロングオリゴヌクレオチドは、赤外蛍光色素で標識したプローブとの競合分析のための非標識プローブを作るためにアニールしました。 <ol><li> 1.5 mLチューブに100μMのロングの20μL、100μMLongRオリゴヌクレオチドの20μL、およびSTEの60μLを混ぜます。 </li><li> 、5分間沸騰水中でチューブを置き、熱源をオフにして、アニールしたオリゴは、一晩冷却して水をしてみましょう。 </li></ol> 4.結合反応と電気泳動<ol><li> 50μLを混合して5倍の結合緩衝液を1mLの準備1 MのTris-HCl、pH7.5での、60。 5 M NaClを10μL; 1 M KClを200μL、1 MのMgCl 2、0.5 M EDTA、pHが8.0の10μLの5μL; 1 M DTTの5μL; ddH 2 Oの25の10mg / mLのBSAのμL、および695μL 注：5×結合緩衝液を等分し、-20℃で保存することができます。考慮すべきもう一つのポイントは、異なる転写因子が結合緩衝液とは異なる修飾を有するということです。 </li><li>右結合反応を設定する前に、30、80 Vで過硫酸アンモニウムのすべての痕跡を除去するために+ 2.5％グリセロール0.5×TBEで5％未変性ポリアクリルアミドゲルを事前に実行していない - 60分、または現在はもはや時間的に変化するまで。 </li><li> 20μLの最終容量で結合反応を設定します。 <ol><li> 4 5×結合緩衝液のμL、80ミックス-精製されたタンパク質Aをngの200（ すなわち 、50％グリセロール中でSOX-2）、0.1μM色素共役プローブの1μL（最終濃度entration：5 nM）を、とのddH 2 O </li><li>オプション：コールドプローブ競合他社が必要な場合は、様々な濃度の冷プローブの（2倍、10倍、25倍、50倍、100倍、 など ） を追加します。 </li><li>オプション：タンパク質AとBとの間の相互作用（ すなわち 、SOX-2およびLIM-4）試験される場合、80の追加-精製タンパク質B ngの200（ すなわち 、50％グリセロール中で、LIM-4）。 </li><li>オプション：核抽出物調製物を用いて、プロテインAの特異的な結合された場合、タンパク質A（ すなわち、抗の6xHis、抗FLAG など ）に特異的な抗体を追加し、検証します。 </li><li> 15分間、暗所でのR / Tでインキュベートします。 </li></ol></li><li>ゲルに結合反応のすべてをロードし、所望の距離に10 V / cmのでゲルを実行します。 </li></ol> 5.イメージング NOTE：ゲルは、高度な赤外線撮像システムを用いてガラス板に直接スキャンしました。したがって、ゲルをさらに解決することができ、繰り返し走査（ 図1Cおよび<st栄&gt; 2）。主に、ウェスタンブロットのために、近赤外蛍光イメージングシステムはまた、ゲルをスキャンするために試験したが、唯一の高度な赤外線撮像システムは、良好な分解能を有するゲルを走査することができました。他のソフトウェアパッケージを使用してもよいが、説明した方法は、特定の赤外線イメージングソフトウェアに固有です。 <ol><li>スキャン前のddH 2 Oおよびドライウェルとスキャナの床を清掃してください。ゲルのガラスプレートを乾燥し、スキャナベッド上でゲルを含むプレートを配置拭いてください。 </li><li>赤外線イメージングソフトウェアを開き、「獲得」タブに移動します。薄いプレート（1ミリメートル）をスキャナベッド上に置かれた場合、チャンネルの設定を使用：700、輝度：オート、解像度：169μmで、品質：中、フォーカスオフセット：1.5ミリメートルを。厚い板（3ミリメートル）がスキャナベッド上に置かれた場合、チャンネルの設定を使用：700、輝度：オート、解像度：84μmで、品質：中、フォーカスオフセット：3.5ミリメートル。フォーカスオフセットに依存しますガラス板の厚さ。 </li><li>ゲルは、スキャナの占有領域を選択します。スキャンを開始するには[スタート]をクリックします。 </li><li>電気泳動を繰り返し、さらに必要に応じてスキャンします。 </li></ol>

<ol><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+probes+in+the+electrophoretic+mobility+shift+assay+to+examine+specific+dsDNA%2C+ssDNA+or+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).</li>
<li>Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+background+problems+in+nonradioactive+northern+and+Southern+blot+analyses+enables+higher+sensitivity+than+32P-based+hybridizations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations.</a> Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).</li>
<li>Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-color+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+detecting+both+nucleic+acids+and+protein+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels.</a> Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).</li>
<li>Alqadah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmitotic+diversification+of+olfactory+neuron+types+is+mediated+by+differential+activities+of+the+HMG-box+transcription+factor+SOX-2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2.</a> EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).</li>
<li>Jullien, N., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUEGO%3A+a+cost+and+time+saving+gel+shift+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure.</a> Biotechniques. 51, 267-269 (2011).</li>
<li>Poulin-Laprade, D., Burrus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+Using+Radiolabeled+DNA+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes.</a> Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).</li>
<li>Ruscher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+based+non-radioactive+electrophoretic+mobility+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay.</a> J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li>
<li>Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+goes+beyond+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Sox2 goes beyond stem cell biology.</a> Cell cycle. , (2016).</li>
<li>Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+competitor+poly%28dI-dC%29.poly%28dI-dC%29+levels+is+advised+in+DNA-protein+interaction+studies+involving+enriched+nuclear+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins.</a> Biotechniques. 20, 439-444 (1996).</li>
<li>Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+detection+of+biotin-protein+conjugates+with+a+green+fluorescent+streptavidin+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe.</a> Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).</li>
<li>Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+fluorescent+electrophoretic+mobility+shift+assay+improved+for+the+quantitative+and+multiple+analysis+of+protein-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).</li>
<li>Steiner, S., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+electrophoretic+mobility+shift+assay+in+the+analysis+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins.</a> Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

fEMSAs、タンパク質-DNA相互作用を研究するための効率的なツールであり、DNAの放射性標識に対する代替です。赤外線染料などの蛍光染料は、市販されており、放射性DNA標識と比較して、より安全で環境に優しい方法を提供します。赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを用いてEMSAsは、ポストランゲル処理工程を必要とするため、他のDNA標識技術に比べて、時間とコストを節約しないでください。放射性EMSAsを用いてバンドを検出するための時間は、プローブ1を試験したDNAの放射能濃度に応じて、30分から数日の範囲とすることができます。対照的に、FEMSAゲルの走査が著しくプロトコルの時間を短縮、平均25分を取ります。ゲルは、分析用のガラスプレートから除去する必要がないようfEMSAsはまた、放射性標識よりも有意な利点を提供します。最初の実行時間が十分でない場合、これはゲルを再スキャンすることができますタンパク質-DNA複合体を解決します。電気泳動を拡張するためのオプションは、放射性同位体またはビオチン/ストレプトアビジンを使用して利用できません。 DNAプローブの蛍光標識は、危険ではなく、容易に廃棄することができる...

EMSAsは、目的のタンパク質とタンパク質1の潜在的な標的部位を含む標識DNAプローブの混合物を解決するために、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を使用して、DNAとタンパク質間の相互作用を分析するために使用されます。タンパク質と結合したDNAプローブは、遊離DNAプローブに比べて遅く移動し、ポリアクリルアミドマトリックスを通るその移動にしたがって、遅角されます。 32 PによるDNAの放射性標識はEMSAsでの検出のための主要な方法でした。生化学研究における放射性標識の適用が有益であったが、同程度の感度で代替DNA標識の方法が原因で、放射能の取り扱いに関連した健康と安全リスクに採用されています。これらの代替方法は、ビオチン2またはジゴキシゲニン（DIG）、3（どちらも、その後の化学発光システムにより検出される）とDNAの結合、PAGEゲル4のSYBRグリーン染色を含みますまたはゲル5,6をスキャンすることによって、DNA蛍光色素コンジュゲートの直接検出。 放射性標識されたDNAプローブを使用してEMSAsの解決されたゲルは、放射性信号1,7を検出するために、オートラジオグラフィーのフィルムまたはホスホイメージャシステムを通じてポストラン処理を必要とします。ビオチン2またはDIG-共役3 DNAプローブを使用してEMSAsのゲルはまた、処理され、適当な膜に転写した後、化学発光6によって検出されなければなりません。ゲルのSYBRグリーン染色は、ポストランゲル染色および蛍光スキャナ4が必要です。ポストランゲル処理ステップは、これらのDNA標識技術を使用してEMSAsために必要とされるので、解像ゲルは一度だけ測定することができます。対照的に、フルオロフォアで標識されたDNAプローブを直接スキャナによるガラス板内部のゲル中で検出することができます。従って、DNA-タンパク質相互作用をモニターすることができると、実行中の異なる時点で複数回アッセイしますかなりの時間とコストを削減します。 EMSAsために使用されているDNA蛍光色素コンジュゲートのCy3 6,8、Cy5の6,8、フルオレセイン9、及び赤外蛍光色素4-6を含みます。 転写調節は、転写因子とその標的遺伝子のタンパク質-DNA相互作用を必要とします。これらの相互作用の調整は、動物の開発中に、共通の祖先から、多様な細胞型を生成します。公平なフォワード遺伝学的スクリーニングは、 シノラブディスエレガンス転写因子SOX-2の高度に保存されたHMG DNA結合ドメインにおいて、ミスセンス変異、G73Eを同定しました。 、分子形態学的および機能レベル5,10でAWC嗅覚ニューロンへのAWB嗅覚ニューロンの細胞恒等変換における突然変異の結果。 SOX-2示差コンテキスト依存パートナー転写因子と相互作用することによって、AWBとAWCニューロンの分化を調節し、各DNA標的部位5,10。 SOX-2端子AWB神経分化におけるLIM-4（LHX）と提携し、SOX-2端子AWCニューロンの分化におけるCEH-36（OTX / OTD）とのパートナーが。ルシフェラーゼレポーターアッセイは示しているが、そのSOX-2及び変異SOX-2 G73Eタンパク質はAWBとAWCニューロンに発現し、プロモーターを活性化する転写補助因子LIM-4とCEH-36との協力の相互作用を持っています。しかし、SOX-2及び変異SOX-2 G73Eは、プロモーターの差動活性化特性を示しました。 SOX-2、SOX-2 G73Eの差動DNA結合活性の分子的基礎を調査するために、fEMSAsは、これらのタンパク質およびそれらの潜在的な標的部位を用いて行きました。 まず、バイオインフォマティクスアプローチは、ルシフェラーゼアッセイに使用1kbのプロモーター領域内の生物学的に関連したDNA結合配列を同定するために採取しました。複数の潜在的SOX-2結合部位がプロモーター全体に存在していたので、私たちは集中しました推定上CEH-36またはLIM-4結合部位に隣接し、進化的に多様な線虫種間で保存予測SOX-2結合部位に。これらの配列は、欠失または変異し、及びその後AWBまたはAWCニューロンにおけるGFPレポーター導入遺伝子を発現するそれらの活性についてインビボで試験しました。このアプローチを通じて、我々は、具体的にはAWBとAWCニューロン、それぞれ5におけるGFPの発現に必要とされるLIM-4 / SOX-2電位とCEH-36 / SOX-2に隣接する標的部位を同定しました。私たちは、SOX-2およびSOX-2 LIM-4 / SOX-2同定し、CEH-36 / SOX-2に隣接する標的部位でFEMSAを使用してG73EのDNA結合の潜在的な違いを調べました。私たちのEMSA分析は、SOX-2 G73Eは同様の効率WT SOX-2がしたように（AWBにおける遺伝子発現のために必要）LIM-4 / SOX-2に隣接する標的部位を含むDNAプローブを結合しなかったことを示しました。しかし、SOX-2およびSOX-2 G73Eは含むDNAプローブの結合には差がありませんでしたCEH-36 / SOX-25,10（AWCにおける遺伝子発現のために必要）djacent標的部位。私たちのFEMSAは、AWBツーAWC細胞恒等変換の表現型に特異的なDNA結合活性に影響を与えることにSOX-2 G73E突然変異の性質に機械的な洞察を提供する分析します。ここで、私たちは一緒に取り組むためのケーススタディとしてLIM-4 / SOX-2に隣接する標的部位を含む赤外蛍光色素標識DNAプローブを用いて精製した6xHis-SOX-2またはの6xHis-SOX-2 G73Eを使用してFEMSAの最適化されたプロトコルを記述する重要な生物学的質問。

<table><tbody><tr><td>30%アクリルアミド/ビス溶液、37.5:1&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610158</td><td>アクリルアミドは有害で有毒です。</td></tr><tr><td>6x-His Epitope Tag 抗体 (HIS.H8)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>アンチフラッグM2抗体&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)分子生物学グレード</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>5'IRDye700標識DNAオリゴ</td><td>統合DNA技術</td><td>カスタムDNAオリゴ</td><td>これらは、原稿では「5'色素標識または赤外線蛍光色素標識DNAオリゴ」と呼ばれています。同社は、5' IRDye標識DNAオリゴヌクレオチドをカスタム合成します。最低100が必要です&nbsp;&mu;Mスケール合成およびHPLC精製。</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'-->5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LightShif Poly (dI-dC)</td><td>ThermoFisher</td><td>20148E</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp;縦型電気泳動セル&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1658000FC&nbsp;</td><td>これは、原稿では「ミニタンパク質ゲルシステム」と呼ばれています。25cm×25cm未満の透明なガラス板であれば、どんな電気泳動システムでも使用できます。</td></tr><tr><td>オデッセイ CLx 赤外線イメージングシステム</td><td>LI-COR バイオテクノロジー</td><td>オデッセイ CLx 赤外線イメージングシステム</td><td>原稿では「先進型赤外線イメージングシステム」と表記されています。</td></tr><tr><td>オデッセイ FC イメージングシステム&nbsp;</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System</td><td>原稿では「主にウェスタンブロット用の近赤外蛍光イメージングシステム」と表記されています。</td></tr><tr><td>Image Studioソフトウェア(バージョン4.0)</td><td>LI-CORバイオテクノロジーImage</td><td>Studioソフトウェア&nbsp;</td><td>これは、原稿では「特定のイメージングソフトウェア」と呼ばれています。&nbsp;</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3756-25G</td><td></td></tr><tr><td>6x Orange ローディング色素</td><td></td><td></td><td>0.25% Orange G; 30% グリセロール</td></tr><tr><td>0.5x TBE</td><td></td><td></td><td>45 mM トリスホウ酸; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x TE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x STE</td><td></td><td></td><td>100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5x Binding Buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl、pH 7.5;50 mM NaCl;200 mM KCl;5 mM MgCl<サブ>2</サブ>;5 mM EDTA、pH 8.0;5 mM DTT;250 &#956;g/mL BSAの</td></tr></tbody></table>

赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）は、タンパク質とその標的DNA配列間の相互作用を特徴付けるための器械ツールです。放射能はEMSAsにおけるDNA標識の主な方法でした。しかしながら、蛍光色素及びスキャン方法における最近の進歩は、時間を節約し、コストを低減し、安全性を向上させる、容易な取り扱いの利点のための放射能の代替として、DNAの蛍光タグの使用を促してきました。我々は最近、正常に重要な生物学的質問に対処するために、蛍光EMSA（FEMSA）を使用しています。私たちのFEMSA分析は、嗅覚ニューロンの種類の多様化に高度に保存されたHMG転写因子SOX-2に、G73E、ミスセンス変異の効果に機械的な洞察を提供します。我々は、変異SOX-2 G73Eタンパク質は、それによって嗅覚ニューロンの恒等変換を引き起こし、特定のDNA結合活性を変化させることがわかりました。ここでは、最適化され、費用対効果のステップバイステップのプロトコルを提示しますFEMSAのための生物学的な例として、LIM-4 / SOX-2に隣接する標的部位および精製SOX-2タンパク質（WTおよび変異体SOX-2 G73Eタンパク質 ）を含む赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用。

オレンジGローディングダイ（6×100 mLの30％グリセロール0.12 gでオレンジG）は、電気泳動の進行を視覚化するためにロードする前に、結合反応に添加することができます。ブロモフェノールブルーを含む他のローディング色素は、スキャン中に検出されたため、画像解析（ 図1B）に干渉されます。 EMSAsのいくつかの例では、核抽出物調製物が使用される場合は特に、deoxyinosinic -デオキシシチジルポリ（ジ-DC）は、DNA 11へのタンパク質の非特異的結合を減少させるために結合反応に含まれます。しかし、ジ-DCを50μg/ mLを5&#39;Dye DNAプローブ（ 図1B）で精製した6xHis-SOX-2の結合を廃止しました。 赤外...

ここで重要な生物学的質問に取り組むためのケーススタディとして、赤外蛍光色素標識DNAプローブと一緒に精製されたSOX-2タンパク質を用いた蛍光電気泳動移動度シフトアッセイ（FEMSA）の最適化されたプロトコルを記述します。

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

このアッセイの全体的な目的は、非放射性プローブを用いてタンパク質-DNA相互作用を検出することです。この手法は、タンパク質のDNA標的配列の決定など、分子生物学および生化学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、放射性プローブを使用する場合に比べ、簡便で安全であり、時間を節約できる代替手段であることです。この手順を開始するには、ミニプロテインゲルシステムを使用して、0.5x tris borate EDTA（TBE）および2.5% glycerolを含む5%ネイティブポリアクリルアミドゲルを調製します。4枚のゲルに使用する30 mLのゲル溶液を調製するために、蒸留水、TBE、過硫酸アンモニウム、TEMED、アクリルアミドビス、およびglycerolを混合します。調製後、直ちにゲル溶液を注入してください。重合後、ゲルを0.5x TBEで事前に濡らした透明なプラスチックラップで包み、4°Cで保存します。次に、約51量体（mer）の長いオリゴヌクレオチドを設計します。また、5'末端に赤外蛍光色素修飾を施した、約14量体の相補的な短いオリゴヌクレオチドを設計します。オリゴヌクレオチドを調製した後、1x Tris-EDTA緩衝液を用いて最終濃度100 µMになるように再懸濁します。アニーリングのため、5'末端にダイ標識された短鎖オリゴヌクレオチド 0.6 µL、長鎖オリゴヌクレオチド 1.2 µL、および塩化ナトリウム含有Tris-EDTA緩衝液 28.2 µLを1.5 mLチューブに混合します。チューブを沸騰水に5分間置き、その後熱源を切って、アニーリングしたオリゴヌクレオチドを含む水を暗所で一晩冷却します。二本鎖DNAプローブを作製するには、アニーリングさせたオリゴヌクレオチド 30 µLを、dNTPs、Klenowバッファー、Klenow 5'末端色素タグ、および二回蒸留水とともに0.2 mL PCRチューブ内で混合します。この混合液をPCRマシンを用いて37 °Cで60分間インキュベートします。その後、0.5 M EDTAを3.4 µL添加して反応を停止させ、PCRマシンを用いて75 °Cで20分間加熱不活化します。次に、充填したプローブを塩化ナトリウムTris-EDTA緩衝液で最終濃度0.1 µMまで希釈します。オリゴヌクレオチドは、使用するまで－20 °Cで遮光して保存してください。未標識プローブを調製するには、1.5 mLチューブにロングオリゴヌクレオチドを20 µL、Long Rオリゴヌクレオチドを20 µL、および塩化ナトリウムTris-EDTA緩衝液を60 µL加えて混合します。チューブを沸騰水に5分間浸した後、熱源を切り、アニールさせたオリゴヌクレオチドを含む水を一晩冷却させる。Tris HCl、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、EDTA、DTT、BSA、および二回蒸留水を混合し、5x結合バッファーを1 mL調製する。結合反応をセットアップする前に、0.5x TBEおよび2.5% glycerolを含む5% nativeポリアクリルアミドゲルを80 Vで30分から1時間、または電流が時間的に変動しなくなるまでプレランし、過硫酸アンモニウムを完全に除去しておく。次に、5x結合バッファー 4 µL、精製タンパク質A 80〜200 ng、0.1 µMの色素結合プローブ 1 µL、および二回蒸留水を混合します。この混合物を室温・暗所で15分間インキュベートします。インキュベーション後、結合反応液のすべてをゲルにロードし、10 V/cmの電圧で目的の距離まで電気泳動を行います。ゲルをできるだけ遮光するため、ゲル装置をアルミ箔で覆います。赤外線イメージングシステムのスキャナーベッドを蒸留水で清掃します。ゲルを含むガラスプレートを拭いて乾燥させ、スキャナーベッドの上に配置します。赤外線イメージングソフトウェアを開き、「Acquire」タブをクリックします。プレートが厚い場合は、チャンネルを700、強度をauto、解像度を84 micrometers、品質をmedium、フォーカスオフセットを3.5 millimetersに設定して使用してください。スキャナー上でゲルが配置されている領域を選択します。最後に、「Start」をクリックしてスキャンを開始します。電気泳動の進行状況はOrange Gローディングダイ 사용하여視覚化できますが、ブロモフェノールブルーはスキャン中に検出されるため、画像解析の妨げとなります。結合反応にdI-dCを添加したところ、精製した6xHis-SOX-2と5'末端標識DNAプローブの結合は消失しました。LIM-4変異体およびLIM-4結合部位に変異を導入したSOX-2コールドプローブは、6xHis-SOX-2への結合において、赤外蛍光色素標識プローブと競合する能力が野生型コールドプローブと同等に効率的でした。しかし、SOX-2結合部位に変異を導入したLIM-4およびSOX-2変異体コールドプローブの、6xHis-SOX-2結合に対する競合効率は、野生型コールドプローブよりも大幅に低い結果となりました。6xHisおよびflagエピトープを用いたSOX-2 DNA複合体のスーパーシフトアッセイにより、スーパーシフトしたSOX-2 DNAバンドが検出されました。この手法を習得すれば、適切に実施することで2〜4時間で完了させることができます。本手順を行う際は、赤外線プローブを暗所に保持することを忘れないでください。本手順の後、特定のDNA結合配列の重要性など、さらなる疑問を解消するために、CRISPR cas9ゲノム編集などの他の手法を実施することが可能です。この手法の開発後、生化学分野の研究者はさまざまなモデル生物においてタンパク質-DNA相互作用を探索することが可能になりました。このビデオを視聴することで、非放射性DNAラベルを用いてタンパク質-DNA相互作用を決定する方法について十分に理解できるはずです。アクリルアミドの取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は常に個人用保護具などの予防措置を講じることを忘れないでください。

an-optimized-protocol-for-electrophoretic-mobility-shift-assay-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

この動画では、移動度シフトアフィニティーキャピラリー電気泳動によるタンパク質-リガンド相互作用の解析方法について説明しています。この方法は、さまざまな荷電リガンドを持つタンパク質の結合挙動を特徴付けるために使用できます。...

Mobility Shift Affinity Capillary Electrophoresis:タンパク質-リガンド複合体の異なる移動に依存するサンプル-リガンド相互作用の解析法

このビデオでは、赤外線蛍光標識DNAプローブを使用してタンパク質-DNA相互作用を検出する電気泳動移動度シフトアッセイを実演します。タンパク質がDNAプローブに結合すると、大きな複合体が形成され、ゆっくりと移動し、ゲル上にシフトしたバンドとして現れます。...

転写因子-DNA複合体の検出のための電気泳動移動度シフトアッセイ

生体内の生体分子の研究は、生物学的な文脈における分子機能を理解するために非常に重要です。ここでは、DNAやタンパク質などの蛍光生体分子を生きた微生物に取り込むことができる新しい方法について説明します。蛍光顕微鏡で記録されたin...

エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測

ここでは、RNA /タンパク質相互作用を分析するためのプロトコルを提示する。電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）は、ネイティブゲル電気泳動中のRNA /タンパク質複合体および遊離RNAの差動移動に基づいている。放射性標識RNAプローブを用いて、RNA /タンパク質複合体は、オートラジオグラフィーによって可視化することができる。...

IRE / IRP例：RNA  - タンパク質相互作用の研究のための電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）

転写因子(TF)DNA結合に影響を与える非コード遺伝的変異を特定するための戦略的な計画とプロトコルを提示します。遺伝子型依存性TF...

機能電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いた非コーディング遺伝的変異体およびDNA親和性沈殿アッセイ（DAPA）のスクリーニング

ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、RNA-タンパク質相互作用を分析するための基本的なツールです。伝統的に、ほとんどの実験では垂直ゲルが使用されています。しかしながら、水平ゲルは、電気泳動の間に複合体をモニターする機会のようないくつかの利点を提供する。我々は、水平ネイティブゲル電気泳動を生成および使用するための詳細なプロトコールを提供する。...

タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

このプロトコルでは、電気泳動、ゲル画像を用いた近赤外蛍光に分類された DNA に変化の観察を通じて変更された DNA の DNA...

アクリルアミドゲル電気泳動法で可視化した近赤外蛍光標識 DNA を用いた DNA ポリメラーゼ活性測定法

ここでは、チアゾール オレンジをゲル電気泳動の実験で DNA の検出に使用するプロトコルを提案する.チアゾール オレンジの使用により、エチジウム...

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

ここに示すビオチン標識を用いてインビトロ生化学アッセイを用い、タンパク質-核酸相互作用の研究に広く適用可能なプロトコルを示す。...

ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ

ここでは、核酸代謝酵素をアッセイするためのプロトコールを、リガーゼ、ヌクレアーゼ、およびポリメラーゼ酵素の例を用いて提示する。このアッセイでは、蛍光標識および非標識オリゴヌクレオチドを組み合わせて、RNAおよび/またはDNAの損傷または経路中間体を模倣した二本鎖を形成することができ、酵素の挙動の特性評価を可能にします。...

修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

学ぶ赤外蛍光色素標識オリゴヌクレオチドを用いたゲルシフトアッセイの最適化プロトコル。SOX-2タンパク質とDNAプローブの相互作用を非放射性で検出し、分子生物学研究の安全性と効率性を向上させる。

赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

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