赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

このアッセイの全体的な目標は、非放射性プローブを使用してタンパク質-DNA相互作用を検出することです。この方法は、タンパク質のDNA標的配列の決定など、分子生物学および生化学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、放射性プローブを使用するよりも簡単で安全、かつ時間を節約できる方法です。

この手順を開始するには、ミニタンパク質ゲルシステムを使用して、0.5xトリスホウ酸塩EDTAまたはTBE、および2.5%グリセロールを含む5%天然ポリアクリルアミドゲルを調製します。4つのゲルに対して30ミリリットルのゲル溶液を調製するには、蒸留水、TBE、過硫酸アンモニウム、TEMED、アクリルアミドビス、およびグリセロールを混合します。すぐにゲル溶液を渡します。

重合後、0.5x TBEで予め湿らせた透明なプラスチックラップでゲルを包み、摂氏4度で保存します。次に、約51 merの長いオリゴヌクレオチドを設計します。約14 merの相補的な短いオリゴヌクレオチドを設計し、5つのプライム末端で赤外蛍光色素を修飾します。

オリゴヌクレオチドを調製したら、1x Tris-EDTAバッファーに再懸濁し、最終濃度が100マイクロモルになるまで上昇させます。アニーリングには、0.6マイクロリットルの5つのプライム色素ショートオリゴヌクレオチド、1.2マイクロリットルのロングオリゴヌクレオチド、および28.2マイクロリットルの塩化ナトリウムTris-EDTAバッファーを1.5ミリリットルのチューブに混合します。チューブを沸騰したお湯に5分間入れてから、熱源をオフにし、アニールされたオリゴヌクレオチドを含む水を暗闇で一晩冷まします。

二本鎖DNAプローブを作製するには、アニーリングしたオリゴヌクレオチド30μLをDNTP、Klenowバッファー、Klenow five prime色素タグ、および2回蒸留水と0.2ミリリットルのPCRチューブで混合します。混合物をPCRマシンで摂氏37度で60分間インキュベートします。次に、3.4マイクロリットルの0.5モルEDTAを追加して反応を停止し、PCRマシンで摂氏75度で20分間不活化します。

その後、充填したプローブを塩化ナトリウムTris-EDTAバッファーで最終濃度0.1マイクロモルに希釈します。オリゴヌクレオチドは、使用する準備ができるまで暗所で摂氏マイナス20度で保管します。標識されていないプローブを調製するには、20マイクロリットルの長オリゴヌクレオチド、20マイクロリットルのロングRオリゴヌクレオチド、および60マイクロリットルの塩化ナトリウムTris-EDTAバッファーを1.5ミリリットルのチューブに混合します。

チューブを沸騰したお湯に5分間入れてから、熱源をオフにし、アニールされたオリゴを含む水を一晩冷まします。Tris HCl、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、EDTA、DTT、BSA、および二蒸留水を混合して、1ミリリットルの5x結合バッファーを調製します。結合反応を設定する前に、5%天然ポリアクリルアミドゲルを0.5x TBEおよび2.5%グリセロールで事前に実行し、80ボルトの過硫酸アンモニウムの微量をすべて30分から1時間、または電流が時間とともに変化しなくなるまで

次に、4マイクロリットルの5倍結合バッファー、80〜200ナノグラムの精製プロテインA、1マイクロリットルの0.1マイクロモル色素標識プローブ、および二重蒸留水を混合します。混合物を室温で暗所で15分間インキュベートします。インキュベーション後、すべての結合反応をゲルにロードし、ゲルを10ボルト/センチメートルで目的の距離まで泳動させます。

ゲル装置をアルミニウムで覆い、ゲルをできるだけ暗く保ちます。赤外線イメージングシステムのスキャナーベッドを蒸留水で清掃します。ゲルの入ったガラスプレートを拭いて乾かし、スキャナーベッドの上に置きます。

赤外線イメージングソフトウェアを開き、[取得]タブをクリックします。プレートが厚い場合は、チャネルに700、強度に自動、解像度に84マイクロメートル、品質にミディアム、フォーカスオフセットに3.5ミリメートルの設定を使用します。スキャナー上でゲルが占める領域を選択します。

最後に、[開始]をクリックしてスキャンを開始します。電気泳動の進行はOrange Gローディング色素で可視化できますが、ブロモフェノールブルーはスキャン中に検出されるため、画像解析に支障をきたします。結合反応にdI-dCを添加すると、精製した6xHis-SOX-2と5つのプライム色素DNAプローブとの結合がなくなりました。

LIM-4結合部位で変異したLIM-4変異体およびSOX-2コールドプローブは、6xHis-SOX-2に結合するための赤外線蛍光色素標識プローブと競合する点で、野生型コールドプローブと同等の効率を示します。しかし、SOX-2結合部位で変異したLIM-4およびSOX-2変異型コールドプローブの競合効率は、6xHis-SOX-2に結合するための野生型コールドプローブよりもはるかに低い。6xHisおよびフラッグエピトープを用いたSOX-2 DNA複合体のスーパーシフトアッセイにより、SOX-2 DNAバンドがスーパーシフトされました。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2〜4時間で完了します。この手順を試行するときは、赤外線プローブを暗闇に置いておくことを忘れないでください。この手順に続いて、特定のDNA結合配列の重要性などの追加の質問に答えるために、CRISPR cas9ゲノム編集などの他の方法を実行できます。

その開発後、この技術は、生化学の分野の研究者がさまざまなモデル生物のタンパク質-DNA相互作用を探求する道を開きました。このビデオを見れば、非放射性DNA標識を使用してタンパク質とDNAの相互作用を決定する方法について十分に理解できるはずです。アクリルアミドの取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には常に個人用保護具などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。