赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

このアッセイの全体的な目的は、非放射性プローブを用いてタンパク質-DNA相互作用を検出することです。この手法は、タンパク質のDNA標的配列の決定など、分子生物学および生化学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、放射性プローブを使用する場合に比べ、簡便で安全であり、時間を節約できる代替手段であることです。

この手順を開始するには、ミニプロテインゲルシステムを使用して、0.5x tris borate EDTA（TBE）および2.5% glycerolを含む5%ネイティブポリアクリルアミドゲルを調製します。4枚のゲルに使用する30 mLのゲル溶液を調製するために、蒸留水、TBE、過硫酸アンモニウム、TEMED、アクリルアミドビス、およびglycerolを混合します。調製後、直ちにゲル溶液を注入してください。

重合後、ゲルを0.5x TBEで事前に濡らした透明なプラスチックラップで包み、4°Cで保存します。次に、約51量体（mer）の長いオリゴヌクレオチドを設計します。また、5'末端に赤外蛍光色素修飾を施した、約14量体の相補的な短いオリゴヌクレオチドを設計します。

オリゴヌクレオチドを調製した後、1x Tris-EDTA緩衝液を用いて最終濃度100 µMになるように再懸濁します。アニーリングのため、5'末端にダイ標識された短鎖オリゴヌクレオチド 0.6 µL、長鎖オリゴヌクレオチド 1.2 µL、および塩化ナトリウム含有Tris-EDTA緩衝液 28.2 µLを1.5 mLチューブに混合します。チューブを沸騰水に5分間置き、その後熱源を切って、アニーリングしたオリゴヌクレオチドを含む水を暗所で一晩冷却します。

二本鎖DNAプローブを作製するには、アニーリングさせたオリゴヌクレオチド 30 µLを、dNTPs、Klenowバッファー、Klenow 5'末端色素タグ、および二回蒸留水とともに0.2 mL PCRチューブ内で混合します。この混合液をPCRマシンを用いて37 °Cで60分間インキュベートします。その後、0.5 M EDTAを3.4 µL添加して反応を停止させ、PCRマシンを用いて75 °Cで20分間加熱不活化します。

次に、充填したプローブを塩化ナトリウムTris-EDTA緩衝液で最終濃度0.1 µMまで希釈します。オリゴヌクレオチドは、使用するまで－20 °Cで遮光して保存してください。未標識プローブを調製するには、1.5 mLチューブにロングオリゴヌクレオチドを20 µL、Long Rオリゴヌクレオチドを20 µL、および塩化ナトリウムTris-EDTA緩衝液を60 µL加えて混合します。

チューブを沸騰水に5分間浸した後、熱源を切り、アニールさせたオリゴヌクレオチドを含む水を一晩冷却させる。Tris HCl、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、EDTA、DTT、BSA、および二回蒸留水を混合し、5x結合バッファーを1 mL調製する。結合反応をセットアップする前に、0.5x TBEおよび2.5% glycerolを含む5% nativeポリアクリルアミドゲルを80 Vで30分から1時間、または電流が時間的に変動しなくなるまでプレランし、過硫酸アンモニウムを完全に除去しておく。

次に、5x結合バッファー 4 µL、精製タンパク質A 80〜200 ng、0.1 µMの色素結合プローブ 1 µL、および二回蒸留水を混合します。この混合物を室温・暗所で15分間インキュベートします。インキュベーション後、結合反応液のすべてをゲルにロードし、10 V/cmの電圧で目的の距離まで電気泳動を行います。

ゲルをできるだけ遮光するため、ゲル装置をアルミ箔で覆います。赤外線イメージングシステムのスキャナーベッドを蒸留水で清掃します。ゲルを含むガラスプレートを拭いて乾燥させ、スキャナーベッドの上に配置します。

赤外線イメージングソフトウェアを開き、「Acquire」タブをクリックします。プレートが厚い場合は、チャンネルを700、強度をauto、解像度を84 micrometers、品質をmedium、フォーカスオフセットを3.5 millimetersに設定して使用してください。スキャナー上でゲルが配置されている領域を選択します。

最後に、「Start」をクリックしてスキャンを開始します。電気泳動の進行状況はOrange Gローディングダイ 사용하여視覚化できますが、ブロモフェノールブルーはスキャン中に検出されるため、画像解析の妨げとなります。結合反応にdI-dCを添加したところ、精製した6xHis-SOX-2と5'末端標識DNAプローブの結合は消失しました。

LIM-4変異体およびLIM-4結合部位に変異を導入したSOX-2コールドプローブは、6xHis-SOX-2への結合において、赤外蛍光色素標識プローブと競合する能力が野生型コールドプローブと同等に効率的でした。しかし、SOX-2結合部位に変異を導入したLIM-4およびSOX-2変異体コールドプローブの、6xHis-SOX-2結合に対する競合効率は、野生型コールドプローブよりも大幅に低い結果となりました。6xHisおよびflagエピトープを用いたSOX-2 DNA複合体のスーパーシフトアッセイにより、スーパーシフトしたSOX-2 DNAバンドが検出されました。

この手法を習得すれば、適切に実施することで2〜4時間で完了させることができます。本手順を行う際は、赤外線プローブを暗所に保持することを忘れないでください。本手順の後、特定のDNA結合配列の重要性など、さらなる疑問を解消するために、CRISPR cas9ゲノム編集などの他の手法を実施することが可能です。

この手法の開発後、生化学分野の研究者はさまざまなモデル生物においてタンパク質-DNA相互作用を探索することが可能になりました。このビデオを視聴することで、非放射性DNAラベルを用いてタンパク質-DNA相互作用を決定する方法について十分に理解できるはずです。アクリルアミドの取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は常に個人用保護具などの予防措置を講じることを忘れないでください。