Name: ELISAによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学ぶ ヌクレオソームELISA法で翻訳後修飾を検出する方法。マイクロコッカルヌクレアーゼ処理とELISAアッセイを用いて、クロマチン修飾状態を高感度に定量し、エピジェネティクス研究に応用できます。

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NU - ELISA法の開発は、NIHの助成金RO1AG023687によってサポートされていました。

1。哺乳動物細胞培養 NU - ELISAは、培養で増殖することができます任意の哺乳動物細胞の種類に実行することができます。そこで我々は、いくつかの異なる抗体（ABS）でアッセイを可能にする、ヌクレオソームがいくつかの同じロードされたELISAプレートを準備するのに十分な量で単離することができるように、細胞の大規模なバッチに適度な準備をすることを好む。以下の培養スケールでは十分な材料を提供します。 マウスembyronic幹細胞は、フィーダー細胞なしで細胞の1つまたは2つの15cmのプレートを成長させる。線維芽細胞の場合は、合流するために5〜10 15 cmのプレートを成長させる。 2。原子核のアイソレーション注：すべてのステップが示されている場合を除き、あらかじめ冷却した緩衝液で氷の上です。 <ol><li>プレート当たり3 mlのトリプシンで細胞をトリプシン処理、結合、および氷冷PBS /酪酸の20 mlを加える。 5分間1000rpmで遠心する。 </li><li> 10ミリリットルのPBS /酪酸、5分間1000rpmで遠心分離で細胞を再懸濁します。 </li><li>プロテアーゼ阻害剤（Sigma - Aldrich社P - 8340）4 mlの溶解バッファーで再懸濁します。氷の上でタイプBの乳棒で20ストロークを均質化するダウンス。 </li><li>で10分間4℃で2000グラムで遠心分離（上清は、このプロトコルのために必要されていない細胞質が、含まれているが、必要であればそれは他の用途のために保存することができます）。 </li><li> 2ミリリットルの氷冷洗浄緩衝液C（プロテアーゼ阻害剤を含む）でペレットを再懸濁します。 </li><li>レイヤ5ミリリットル、30％ショ糖クッション上に再懸濁した物質は、その後、スイングバケットローターで5分間2400グラムで遠心。核はクッションを通って移動し、破片は、インターフェイスのままです。 </li><li>慎重にすべての液体のボリュームを削除し、250μlの氷冷洗浄緩衝液C +プロテアーゼ阻害剤の核を再懸濁します。 </li></ol> 3。 その場でミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）消化のでヌクレオソームの単離我々はクロマチンが上清に遊離無傷ヌクレオソームを駆動する低張処理することにより、MNaseでそれらを導入することで、核内にその場で消化されているプロシージャを使用してください。 <ol><li>サンプルに3μlの0.1 M CaCl 2を追加。 37℃のヒートブロックに入れ。 37℃の温度を仮定することができます。 </li><li> 2台のMNaseを（ミクロコッカスヌクレアーゼ、シグマアルドリッチ、MNaseバッファの2units/10μlで溶解）を追加、その後37℃のためにインキュベートしますピペットチップを使用して頻繁に混合しながら12分間のCを、。 </li><li>反応を停止するには、0.5MのNa - EDTA、pH8.0の6μlを添加する。氷上に置く。 </li><li> 4分間2000グラムで遠心分離、上清を捨てる。 300μlの0.2mMののNa - EDTAでペレットを再懸濁する。時折優しいペッティングで1時間氷上で保存する。 （これらの低張条件は核から遊離ヌクレオソームを解放）。 </li><li> 4℃で4分間3000gで遠心する℃、氷の上で、自由なヌクレオソームを含む上清を、保存します。 </li><li> 300μlの0.2mMののNa - EDTAで再び沈殿を再懸濁します。時折優しいペッティングで1時間氷上で保存する。 </li><li> 4℃で4分のために3000グラムで遠心分離℃を上清を保持し、手順5からの最初の上清と組み合わせる。結果mononucleosome製剤は-80℃で分注し、保存することができます。 </li></ol>注：クロマチンの量が粗雑に10μlのサンプルの260nmの吸光度を測定することによって定量することができる水990μlに追加。 260 = 10（1 / 100希釈を調整後）クロマチンの約1mg/mlに相当する。主に長さが146塩基のDNAが含まれていなければなりませんMNase消化の質と程度を、監視するために彼らのDNAの含量のためにも、上記の手順の間に、少量のサンプルが保持される場合があるので、後で分析する。ラダリング型は、不完全なMNase消化の指標である。 注：図1は、核の分離とMNase消化の手順の図示した要約が含まれています。 4。ヌクレオソーム- ELISA（NU - ELISA） 我々は、96ウェルELISAマイクロタイタープレート上に固定されているネイティブそのままnuclesosomesを含有する画分にPTMSを検出する。各サンプルについて、我々は2倍希釈系列を作り、これらは三連のウェル上にコーティングされています。 <ol><li> 4 °50μl/ウェルのコーティング緩衝液で希釈したヌクレオソームとC。一晩コートMaxiSorpプレートヌクレオソームの提案されたシリアル倍の希釈液を底部で唯一のコーティング緩衝液（0μgのクロマチン）を、0.1μgの、濃度0.05μg、0.025μgの、0.0125μgの、0.00625μgの、0.00313μgの、0.00156μgを追加することによって、下の行に一番上の行から調製される行。 （注：プレートのカバーは、このステップのために必要です。） </li><li>午前中に、プレート洗浄機で10分間の合計のために室温（RT）で200μl/ウェルPBS/0.5％ツイーン20でプレートを4回洗浄する。 </li><li> 100μl/ウェルPBS/0.05％のTween - 20 / 5％BSAで室温でブロック1時間。 </li><li>活発に反転プレートを振とうしてブロッキングバッファーを除去するシンク上。カバーと-20℃でプレートを保存したり、次の手順に進みます。 </li><li> PBS/0.05％ローテーターで室温で1時間インキュベートのTween - 20 / 5％BSA、50も希釈/μL1:1000の体積（または必要に応じて）に1 · ABSを追加。 </li><li>室温とプレートウォッシャーで10分の合計のための200μl/ウェルPBS/0.5％ツイーン20でプレートを4回洗浄する。 </li><li>ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識2 °腹筋、PBS/0.05％ローテーター上で時間室温でのTween - 20 / 5％BSAで（または必要に応じて）1:5000に希釈を追加。 </li><li> 200μl/ウェルPBS/0.5％ツイーン20でプレートを4回洗浄する。各洗浄には、プレートウォッシャーを使用して室温で10分の合計です。 </li><li>室温で10分間各ウェルにTMB基質50μlを加えてプレートを開発する。 H 2 SO 4を50μlを添加することにより/よく2Nの反応を停止し、プレートを450 nmのを読んで。 （ヒント：前の読書吸光度に井戸の気泡を放​​散するためにプレートのローターを使用して2分間1500rpmで遠心分離）。 </li><li>定量的および統計的分析のためのスプレッドシートファイルへの読み取り値をエクスポートします。 </li></ol>試薬<table border="1"><tbody><tr><td> PBS /酪酸 </td></tr><tr><td> 135 mM NaClを</td></tr><tr><td> 2.5mMのKClを</td></tr><tr><td> 8ミリのNa 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1.5mMのKH 2 PO 4 </td></tr><tr><td>の10mMのNa -酪酸</td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 溶解バッファー </td></tr><tr><td> 250mMスクロース</td></tr><tr><td> 10mMトリス- HCl、pH7.4の</td></tr><tr><td>の10mMのNa -酪酸</td></tr><tr><td> 4mMのMgCl 2の </td></tr><tr><td> 0.1％トリトンX - 100 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 洗浄バッファーC </td></tr><tr><td> 250mMスクロース</td></tr><tr><td> 10mMトリス- HCl、pH7.4の</td></tr><tr><td>の10mMのNa -酪酸</td></tr><tr><td> 4mMのMgCl 2の </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> ショ糖クッション </td></tr><tr><td>洗浄バッファーCで30％（w / v）スクロース</td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Microccocalヌクレアーゼ緩衝剤 </td></tr><tr><td> 5mMのナポ4緩衝液、pH 7.0の</td></tr><tr><td> 0.025ミリメートルのCaCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> コーティング緩衝液 </td></tr><tr><td> 80ミリリットルの溶液A + 170ミリリットル溶液B + 250ミリリットルのdH 2 O </td></tr><tr><td>解決策：0.2 M Na 2 CO 3の </td></tr><tr><td> B液：0.2 M NaHCO 3を </td></tr></tbody></table> 5。代表的な結果 NU - ELISA法を用いて、複数の同一のプレートのシリーズはmononucleosomesの形で準備したクロマチンで読み込むことができる準備されています。我々は通常、それぞれが異なる抗PTM特異的抗体（ABS）でプローブすることができるように同一にロードされたプレートのシリーズを用意。我々はまた、常に、その修正の状態合計クロマチンのローディングコントロールに関係なく、ヒストンを検出する抗体でプローブすることができますプレートを準備。このコントロールは、後で定量的に異なる試料から調製したヌクレオソームのPTM内容を比較するために不可欠です。我々はこのアプローチを使用して生の吸光度値を修正特定のクロマチンサンプル内PTMSのレベルを定量するために：まず、ないクロマチンを（背景は通常無視できる）含まないコントロールウェルから得られた値を使用して、任意のバックグラウンド信号を引きます。私たちは、その後、その修正の状態に関係なく、ヌクレオソームを検出する抗体をアッセイした同じロードされたプレートから入手したNU - ELISAの結果にPTM -特定の信号を標準化する。 （我々はこの目的のためにヒストンH2AまたはH2Bに特異的なポリクローナルAbsを使用している）。私たちは、その後、クロマチンの各希釈に平均値と分散を決定し、そしてELISAアッセイの直線部分から得られたデータを使用してください。 NU - ELISAの数学と統計分析の詳細な例は、以前は次の4報告されている<img src="/files/ftp_upload/2593/2593fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 NU - ELISAの手順の概略diagam。 A.哺乳動物細胞を収穫している、B.の核はダウンスhで細胞から分離されていますomogenization、C.は、細胞を遠心分離後、30％w / vのスクロースクッション、D.の上にロードされている混乱、核はペレット内に堆積され、E、FのクロマチンはMNaseによって主にmononucleomesにその場で消化され、G、H 、私 。可溶性mononucleosomesは低張処理し、残留核物質の繰り返し遠心分離によって抽出されます。J.の Mononucleosomesは異なる試料から（ラベルはSAMP。この場合は1と2）は同じロードされたプレートのシリーズでマイクロタイターウェルにコーティングして尋問されています合計クロマチンの負荷を決定するためにPTM -固有の腹筋とPTM -独立の腹筋。そのPTM内容が異なる2つのサンプルに差動信号の検出レベルのK.の描写が、まだ、抗H2B免疫反応性によって判断、同じような全体的なクロマチンのコンテンツを持っている。

<ol><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+an+epigenetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and an epigenetic code.</a> Bioessays. 22, 836-845 (2000).</li>
<li>Dai, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epiproteomic+signatures+distinguish+embryonic+stem+cells+from+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells.</a> Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).</li>
<li>Tanasijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+accumulation+of+epigen+etic+heterogeneity+during+human+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture.</a> Epigenetics. 4, 330-338 (2009).</li>
<li>Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThomas%2C+JO+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).</li>
<li>Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThorne%2C+AW+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

NU - ELISAは、特定の細胞型内に存在するヌクレオソームPTMSのグローバルステータスを確認する方法を提供する。 NU - ELISAの研究は世界的なヌクレオソーム変更の状態が発散細胞型4の比較で異なることが示されている。細胞はトリコスタチンA -またはときにマウスembyronicの幹細胞は4を差別化しているなどのエピジェネティックな調節剤にさらされているときに加えて、NU - ELISA PTMのプロファイルが変更されます。方法はまた、ヒトES細胞5のクロマチンを研究するために正常に適用されています。 NU - ELISAは、現在の形で、細胞のエピゲノムの合計内に存在するPTMSの唯一のコンポジット署名を検出することができるに注意する必要があります。これは、特定の遺伝子座における特定のPTMの分布を決定することができるゲノムワイドなクロマチン免疫沈降、と著しく異なります。 NU - ELISAの手順の最初のステップは、哺乳動物の核6,7からmononucleosomesを分離する従来の方法を適合させたもの。これらの適応の方法は、哺乳動物細胞から高品質の無傷mononucleosomesを得るために好都合な方法を提供し、得られた画分は、クロマチンコンテンツで包括的ですが、追加の核物質が大量に含まれています。特定の腹筋が使用されているので、混入非ヌクレオソーム材料は、高い純度を必要とする量産仕様のアプローチとは異なり、NU - ELISAアッセイで忍容性は良好です。しかし、NU - ELISAは、西部が西部劇とヌクレオソームPTMSの検出のための質量分析に優れた代替手段を提供するので、4ブロッティングよりも高感度かつ定量的です。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>ミクロコッカスNucleae </td><td>シグマ</td><td> N3755 </td><td> -20℃で保存し、2U/10μlバッファのアリコートを作る</td></tr><tr><td>ヌンクMAXISORPマイクロタイタープレート</td><td>フィッシャー</td><td> 12-565-135 </td><td>接着プレートカバーもフィッシャーを通じて注文することができます</td></tr><tr><td>自動化されたプレートウォッシャー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1ステップTMB - ELISA基質</td><td>ピアース</td><td> 34028 </td><td> 4℃で使用前に室温に事前暖かいまたは仕様書で指示</td></tr><tr><td>マイクロタイタープレートリーダー</td><td> Bio - Rad社製マイクロプレートリーダー（モデル：680） </td><td></td><td>ほとんどの比色プレートリーダーのモデルが適しています。 </td></tr></tbody></table>

elisaによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

真核生物のゲノムは、DNAとタンパク質の両方を含むクロマチンとして存在する。クロマチンの基本単位は2つのヒストンH2A、H2B、H3、およびH4 1のそれぞれに関連付けられているDNAの146塩基対を含むヌクレオソーム、です。ヒストンのN末端尾部には、リジンとアルギニンに富み、アセチル化、メチル化、および他の翻訳後修飾（PTMS）によって転写後に変更されます。ヌクレオソームのPTMの構成は、このような性質2,3におけるエピジェネティックな遺伝子調節のモードを提供し、関連するDNAの転写活性に影響を与えることができます。我々はヌクレオソームELISA（NU - ELISA）は定量的に細胞から抽出したヌクレオソームのグローバルPTMの署名を決定するという方法を開発した。 NU - ELISAはウェスタンブロット法よりも感度が高く定量的であり、そして特定の細胞型のepiproteomic状態を調べるために便利です。このビデオジャーナルの記事では、NU - ELISA解析を実行する詳細な手順を示しています。

ヌクレオソームELISA（NU - ELISA）は、ネイティブ、無傷のヌクレオソームの調製品で、翻訳後修飾のグローバルなパターンを検出する高感度かつ定量的な方法です。これらの変更は、メチル化、アセチル化、および特定のヒストンのアミノ酸残基でリン酸化が含まれており、それ故にNU - ELISAは、特定の細胞型の総合的なクロマチンの修飾状態のグローバルプロテオミクスアッセイを提供する。

ELISAによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出

真核生物のゲノムは、DNAとタンパク質の両方を含むクロマチンとして存在しています。クロマチンの基本単位はヌクレオソームであり、これには146...

この手順の全体的な目的は、100万個の細胞から得られた全細胞ヌクレオソーム調製物における翻訳後修飾の相対的レベルを正確に定量することです。これは、まず哺乳類細胞の高品位で均質な培養物を調製し、次いでダウンス型ホモジナイザーを用いた機械的破砕と遠心分離によって、細胞から核を単離することで達成されます。次のステップは、核内に存在するクロマチンを消化し、一連の低張抽出を行うことで、無傷のヌクレオソームを得ることです。最後に、適切なコントロールを用いたELISAアッセイでヌクレオソームを解析し、特定の翻訳後修飾を同定します。最終的に、ヌクレオソームサンプル内に存在する特定の修飾の相対レベルを示す結果を得ることができます。ウェスタンブロッティングやクロマチン免疫沈降などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、多くのヌクレオソーム修飾状態の全体像を容易に把握できる点にあります。本手法はウェスタンブロッティングよりもはるかに感度と精度が高く、一般的な分子生物学実験の設備が整ったほとんどの研究室で実施可能です。本手法は、主要な分化やリプログラミングイベントが発生した際に何が起こるかなど、幹細胞およびエピジェネティクス分野における重要な疑問への回答に寄与します。手順を開始するには、まず15 cmプレートあたり3 mLのトリプシンを用いて細胞をトリプシン処理し、新鮮なトリプシン化細胞を調製します。氷冷したPBS butyrateを20 mL加えます。細胞を50 mLコニカルチューブに移し、1000 RPMで5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を吸引して、洗浄のために氷冷したPBS butyrateを10 mL加えます。細胞懸濁液を再度1000 RPMで5分間遠心分離します。上清を除去し、書面によるプロトコルに従い、プロテアーゼ阻害剤を含むライシスバッファー 4 mL で細胞ペレットを再懸濁します。次に、細胞を氷上の A type B pestle down homogenizer にピペットで移し、20回ストロークしてホモジナイズします。その後、ホモジネートを氷上の遠心チューブに移します。サンプルを2000 Gで10分間、4 °Cで遠心分離します。細胞質成分を含む上清を取り除き、再懸濁します。ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷した2 mLの洗浄バッファーCに懸濁させ、再懸濁した物質を、冷やした遠心チューブ内の5 mLの30%スクロースクッションの上に静かに重ねます。核を単離するため、スイングバケットローターを用いて2,400 Gで5分間遠心分離します。核はクッションを通過して移動し、細胞のデブリは界面に留まります。遠心分離後、すべての液体を注意深く取り除き、核をプロテアーゼ阻害剤を含む氷冷した250 µLの洗浄バッファーCで再懸濁し、1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移します。ヌクレオソームの単離を開始するため、核に0.1 molarの塩化カルシウムを3 µL加え、温度が安定するまで37 °Cのヒートブロックに置きます。次に、micro cocal nucleaseバッファーに溶解した2 unitsのmicro cocal nuclease（10 µL）を加え、37 °Cで12分間インキュベートします。ピペットチップを用いて頻繁に混合してください。インキュベーション後、0.5 M sodium EDTA pH 8 を 6 µL 加えて反応を停止させ、氷上に置いて冷却します。次に、サンプルを 2000 ×g で 4 分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨ててペレットを再懸濁させます。0.2 mM sodium EDTA 300 µL 中で、時々穏やかにピペッティングして混ぜながら、サンプルを氷上で 1 時間インキュベートします。4°Cで3000 Gにて4分間遠心分離した後、遊離ヌクレオソームを含む上清を新しい遠心チューブに回収し、追加のヌクレオソーム回収に備えて氷上で保存します。ペレットを、前述と同様に300 µLの0.2 mM EDTA溶液に懸濁し、時折穏やかに混合しながら、氷上で1時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを遠心分離します。得られた上清を、マイクロ遠心チューブ内の残りのサンプルと合わせて氷上に置きます。ヌクレオソームELISAアッセイを開始するために、96ウェルELISAプレートに、ヌクレオソームとコーティングバッファーを用いて、最上段のウェルを0.1 µg/50 µLとして5段階の2倍連続希釈系列を分注します。すべての希釈系列は3連（triplicate）で分注してください。コントロールとして、コーティングバッファーのみを入れたウェルを含めることを忘れないでください。プレートを4°Cで一晩インキュベートし、翌日に処理を行います。プレートウォッシャーを使用し、室温で、1ウェルあたり200 µLの0.5% Tween 20含有PBSで4回洗浄します（合計10分間）。次に、ブロッキング溶液を1ウェルあたり100 µLずつ加え、室温のローテーターで1時間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを逆さまにしてシンクの上で激しく振ることで、ブロッキングバッファーを除去します。続いて、PBSに0.05% Tween 20および5% PSAを含む溶液で希釈した一次抗体を、1ウェルあたり50 µLの容量で加え、室温のローテーターで1時間インキュベートします。一次抗体反応後、プレートウォッシャーを用いて前述と同様にプレートを洗浄します。洗浄手順が完了したら、5% BS, A および 0.5%20 を含む PBS で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ接合二次抗体を、1ウェルあたり 50 µL ずつ添加し、ローテーターを用いて室温で1時間インキュベートします。二次抗体反応後、前述と同様にプレートを洗浄します。プレートウォッシャーを使用してプレートを処理します。各ウェルに50 µLのTMB ELISA基質を加え、室温で10分間インキュベートします。ELISAプレートのウェルが青色に変化し、その色の強さは各ウェルに含まれるヌクレオソーム修飾量に比例します。次に、各ウェルに2 N 硫酸を 50 µL 添加して反応を停止させます。色は茶色に変化します。プレートを 1500 RPM で 2 分間遠心分離し、気泡を除去してください。これでプレートをコロリメトリックプレートリーダーで定量分析する準備が整いました。最後に、450 nanometersでプレートを測定し、解析のために結果をエクスポートします。この手法に習熟し、適切に実施できれば、開発後は2日間で完了させることができます。この技術により、幹細胞研究分野の研究者が、エピプロテオーム全体のレベルで分化およびリプログラミングイベントに対するエピジェネティックな応答を探索することが可能になりました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ユビキチン化は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。この変更に関与する遺伝子の変異が様々なヒト疾患に関連付けられています。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明...

タンパク質のユビキチン化の検出

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

ここでは、ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の能力を特徴づけるために使用できる生化学的アッセイについて説明し、1)ATP依存性のヌクレオソームのスライドを触媒し、2)ヌクレオソーム基質と関与し、3)ATPをヌクレオソームまたはDNA依存的に加水分解します。...

ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の活性を分析するための生化学的アッセイ

このプロトコルは、質量分析（MS）を用いて、ヒストンの翻訳後修飾を特徴付けるための完全に統合されたワークフローの概要を説明します。ワークフローは、ナノ流液体クロマトグラフィーおよびデータ分析のための命令を使用して、細胞培養物または組織、ヒストン誘導体、消化、MS分析から、ヒストンの精製を含みます。 3日 - プロトコルは2以内に完了するために設計されています。...

ヒストンの抽出からデータ解析まで：ボトムアップ質量分析法を用いてヒストンの翻訳後修飾の解析のための完全なワークフロー

このプロトコルは、示差的に同位体標識姉妹ヒストンを含むヌクレオソームの再構成を説明します。これと同時に、非対称的に翻訳後修飾ヌクレオソームはpremodifiedヒストンのコピーを使用した後に発生することができます。これらの製剤は、容易に高分解能NMR分光法を用いて、同時に両方の姉妹ヒストンに、修正クロストークのメカニズムを研究するために使用することができます。...

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

ヒストン 3 リジン 79 ジメチル化 (H3K79me2) - 内にあるヒストン マークのクロマチン免疫沈降 (チップ) の胎生期および生後の脳組織から神経前駆細胞の培養を特定し効果的かつ再現可能な手法を提案しますヒストン 3...

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

複数の調査、ターゲット蛋白質の翻訳後修飾を内因性は非常に挑戦的なすることができます。ここで説明したテクニックを活用開発特定 PTM ターゲットでターゲットのアセチル化、ユビキチン化、sumo 化 2/3、およびチロシンのリン酸化の変更を検出する親和性のマトリックス最適化された換散バッファーとフィルター システム1...

標的タンパク質の翻訳後修飾の内因性プロファイルを識別するために包括的な免疫沈降濃縮システムを活用

ユビキチン化は、細胞プロセスで重要な役割を果たし、デュビキチン化によって緊密に調整される翻訳後修飾です。両方の反応の欠陥は、人間の病理の下にある。精製成分を用いてインビトロでユビキチン化・デュビキチン化反応を行うためのプロトコルを提供します。...

ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

本プロトコルは、トポイソメラーゼ阻害剤およびホルムアルデヒドによって誘導されるユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化を含む、DNA-タンパク質架橋(DPC)およびそれらの翻訳後修飾(PTM)を検出および定量するための改変方法を強調し、それによってDPCおよびそのPTMの形成および修復の研究を可能にする。...

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光、飛行時間型質量分析(LC-TIMS-ToF...

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光分析、飛行時間型質量分析を用いたヒストン修飾スクリーニング(英語)

ヒトのスピンドリンファミリーメンバー4(SPIN4)における遺伝的変異が最近、骨の過剰増殖という新しい発達障害の患者で確認されました。ヌクレオソームの文脈における修飾ヒストンの生化学的同定をSPIN4結合基質として記述するプロトコルと新しい結果が提示されています。...

ペプチドアレイおよびネイティブヌクレオソームプルダウンによるヒトスピンドリンファミリーメンバー4(SPIN4)の結合基質としての修飾ヒストンの同定

学ぶ ヌクレオソームELISA法で翻訳後修飾を検出する方法。マイクロコッカルヌクレアーゼ処理とELISAアッセイを用いて、クロマチン修飾状態を高感度に定量し、エピジェネティクス研究に応用できます。

ELISAによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出

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