ELISAによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出

この手順の全体的な目標は、100万個の細胞から得られた全細胞ヌクレオソームの調製物内の翻訳後修飾の相対レベルを正確に決定することです。これは、最初に哺乳類細胞の高品質で均質な培養物を準備することによって達成されます。次に、ダウン、ホモジナイザー、遠心分離による機械的破壊により、核を細胞から単離します。

次のステップは、核内に存在するクロマチンを消化し、一連の低張抽出を行うことにより、無傷のヌクレオソームを取得することです。最後に、ヌクレオソームをELIZAアッセイと適切なコントロールを用いて調べ、特定の翻訳後修飾を同定します。最終的には、ヌクレオソームサンプル内に存在する特定の修飾の相対レベルを示す結果を得ることができます。

ウェスタンブロッティングやクロマチン免疫沈降法などの既存の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、多数のヌクレオソーム修飾状態の全体像を容易に決定できることです。この分析法は、ウェスタンブロッティングよりもはるかに感度と精度が高く、一般的な分子生物学実験用の設備が整ったほとんどのラボで実施できます。この方法は、幹細胞およびエピジェネティクスの分野における重要な問題、例えば、主要な分化やリプログラミングイベントが発生したときに何が起こるかなど、答えるのに役立ちます。

手順を開始するには、まず、15センチメートルプレートあたり3ミリリットルのトリプシンで細胞をアニズし、新たにトリプス化された細胞にします。氷冷したPBS酪酸20ミリリットルを追加します。細胞を50ミリリットルの円錐管に移し、チューブを遠心分離して1000RPMで5分間細胞を収集し、上清を吸引し、10ミリリットルの氷冷PBS酪酸を加えて細胞懸濁液を1000RPMで5分間再度遠心分離します。

上清を除去し、書かれたプロトコルに記載されているように、細胞ペレットをプロテアーゼ阻害剤を含む4ミリリットルの溶解緩衝液に再懸濁します。次に、細胞をAタイプBの乳棒にピペットで固定し、ホモジナイザーを氷上で20ストロークで均質化します。次に、ホモジネートを氷上の遠心分離チューブに移します。

サンプルを2000 Gで10分間遠心分離します。摂氏4度で。細胞質材料とresusを含むスーパーネームを、削除します。

ペレットを2ミリリットルの氷冷洗浄バッファーCに懸濁します プロテアーゼ阻害剤を使用して、再懸濁した材料を冷遠心チューブ内の5ミリリットル、30%スクロースクッションに穏やかに層状にします。スイングバケット内で2, 400Gで5分間遠心分離機を単離するために、ローター核はクッションを通って移動し、細胞の破片は界面に残ります。遠心分離後、すべての液体量を慎重に除去し、プロテアーゼ阻害剤を含む250マイクロリットルの氷冷洗浄緩衝Cに核を再懸濁し、核を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。

ヌクレオソームの単離を開始するには、0.1モルの塩化カルシウムを3マイクロリットルの核に加え、温度が平衡化するまで摂氏37度のヒートブロックに入れます。次に、10マイクロリットルのマイクロコカルヌクレアーゼに2ユニットのマイクロコカルヌクレアーゼを加え、緩衝液を緩衝し、摂氏37度で12分間インキュベートします。ピペットチップで頻繁に混合します。

インキュベーション後、6マイクロリットルの0.5モルナトリウムE-D-T-A-P-H 8で反応を停止し、氷上に置いて冷まします。次に、遠心分離後4分間、サンプルを2000 Gで遠心分離し、スナットを廃棄してペレットを再懸濁します。300マイクロリットルの0.2ミリモルまたはナトリウムEDTAで、サンプルを氷上で1時間インキュベートし、時折穏やかにピペッティングして混合します。

3000 Gで4分間遠心分離した後。摂氏4度で、新しいFugeチューブに遊離ヌクレオソームを含む上清を収集し、氷上に意図的に追加のヌクレオソームreusを保存します。前と同じように、ペレットを300マイクロリットルの0.2ミリモルまたはナトリウムEDTに懸濁し、時折穏やかに混合しながら氷上で1時間インキュベー

インキュベーション後、サンプルを遠心分離します。再度、得られたスナットと氷上のマイクロフージチューブ内の残りのサンプルを組み合わせます。ヌクレオソームElizaアッセイを開始するには、ヌクレオソームとコーティングバッファーの5つの2倍連続希釈の5つの下降シリーズを含む96ウェルElizaプレートをロードし、トップウェルで50マイクロリットルあたり0.1マイクログラムから始めて、すべての希釈シリーズを3回ロードする必要があります。

コーティングバッファー付きのウェルは、コントロールとしてのみ含めることを忘れないでください。翌日、プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。プレートワッシャーを使用して、室温でPBS中の20の間で0.5%のウェルあたり200マイクロリットルでプレートを4回、合計10分間洗浄します。

次に、ブロッキング溶液のウェルあたり100マイクロリットルを加え、ローテーター上で室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、逆プレートをシンクの上で勢いよく振ってブロッキングバッファーを取り出します。次に、希釈した一次抗体をウェルあたり50マイクロリットルの容量で5%PSAの溶液に0.05%のPBSで20°Cの溶液に加え、室温でローテーター上で溶液を1時間インキュベートします。

一次抗体のインキュベーション後、プレートワッシャーを使用して、前と同様にプレートを洗浄します。洗浄手順が完了したら、5%BS、A、および0.5%20のPBSで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体をウェルあたり50マイクロリットル加え、二次抗体インキュベーション後、ローテーターで室温で1時間インキュベートします。以前と同じようにプレートを洗います。

プレートワッシャーを使用してプレートを開発します。各ウェルに50マイクロリットルのTMB Eliza基質を加え、10分間インキュベートします。室温では、ELIZAプレートのウェルは青色に変わり、強度は各プレート内に存在するヌクレオソーム修飾の量に比例します。

それでは反応を止めてください。2つの通常の硫酸のウェルあたり50マイクロリットルを追加することによって。色が茶色に変わり、プレートを1500RPMで2分間遠心分離し、気泡を消散させます。

これで、プレートはカラーメトリックプレートリーダーで定量化する準備が整いました。最後に、450ナノメートルでプレートを読み取り、結果をエクスポートして分析します。一度習得すると、このテクニックは、開発後に適切に実行されれば、2日で実行できます。

この技術は、幹細胞研究の分野の研究者が、エピプロテオーム全体のレベルで分化およびリプログラミングイベントに対するエピジェネティックな応答を探求するための扉を開きました。