Name: 原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学ぶ脳組織のマルチスケール粘弾性特性評価法。原子間力顕微鏡、インパクトインデント、レオロジーを用いて、単細胞から全脳までの力学的性質を測定し、神経疾患や外傷モデリングに活用します。

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私たちは、全米多発性硬化症協会とサイモンズ社会脳センターによるこの仕事の支援に感謝します。BQは、米国国防科学工学大学院フェローシッププログラムからの支援を認めています。

<ol><li>van Dommelen, J. A. W., Hrapko, M., Peters, G. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Properties+of+Brain+Tissue%3A+Characterisation+and+Constitutive+Modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanosensitivity+of+the+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Mechanical Properties of Brain Tissue: Characterisation and Constitutive Modelling.</a> Mechanosensitivity of the Nervous System. , 249-281 (2009).</li>
<li>Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-mechanical+characterization+of+lung+tissue+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2911(2011).</li>
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<li>Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+mechanical+properties+of+living+cells+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (76), e50497(2013).</li>
<li>Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+relaxation+and+creep+on+living+cells+with+the+atomic+force+microscope%3A+a+means+to+calculate+elastic+moduli+and+viscosities+of+cell+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components.</a> Nanotechnology. 21, 445101(2010).</li>
<li>Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creep+function+of+a+single+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Creep function of a single living cell.</a> Biophysical Journal. 88 (3), 2224-2233 (2005).</li>
<li>Lu, H., Wang, B., Ma, J., Huang, G., Viswanathan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+creep+compliance+of+solid+polymers+by+nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanics+Time-Dependent+Materials%22%5BJournal%5D)">Measurement of creep compliance of solid polymers by nanoindentation.</a> Mechanics Time-Dependent Materials. 7 (3/4), 189-207 (2003).</li>
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<li>Kalcioglu, Z., Qu, M., Van Vliet, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+characterization+of+relaxation+times+of+tissue+surrogate+gels+and+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%227th+Army+Science+Conference+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Multiscale characterization of relaxation times of tissue surrogate gels and soft tissues.</a> 7th Army Science Conference Proceedings. , (2010).</li>
<li>Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+relaxation+microscopy%3A+Imaging+local+stress+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Stress relaxation microscopy: Imaging local stress in cells.</a> Journal of Biomechanics. 43 (2), 349-354 (2010).</li>
<li>Kalcioglu, Z. I., Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+impact+indentation+of+hydrated+biological+tissues+and+tissue+surrogate+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Magazine%22%5BJournal%5D)">Dynamic impact indentation of hydrated biological tissues and tissue surrogate gels.</a> Philosophical Magazine. 91 (7-9), 1339-1355 (2011).</li>
<li>Kalcioglu, Z. I., Ra Mrozek, R. a, Mahmoodian, R., VanLandingham, M. R., Lenhart, J. L., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+mechanical+behavior+of+synthetic+organogels+as+biofidelic+tissue+simulants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Tunable mechanical behavior of synthetic organogels as biofidelic tissue simulants.</a> Journal of Biomechanics. 46 (9), 1583-1591 (2013).</li>
<li>Janmey, P. A., Georges, P. C., Hvidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+rheology+for+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic rheology for biologists.</a> Methods in Cell Biology. 83, 3-27 (2007).</li>
<li>Miller, K., Kurtcuoglu, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+K+%22Biomechanics+of+the+Brain%22">Biomechanics of the Brain</a>. , Springer Science & Business Media. (2011).</li>
<li>Lévy, R., Maaloum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+spring+constant+of+atomic+force+microscope+cantilevers%3A+thermal+fluctuations+and+other+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods.</a> Nanotechnology. 13 (1), 33-37 (2002).</li>
<li>Fuierer, R. Basic Operation Procedures for the Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuierer%2C+R+%22MFP-3D+Procedureal+Operation+%22Manualette%22%22">MFP-3D Procedureal Operation "Manualette"</a>. , Asylum Research. (2006).</li>
<li>Elkin, B. S., Ilankovan, A., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+regional+mechanical+properties+of+the+rat+hippocampus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Age-dependent regional mechanical properties of the rat hippocampus and cortex.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 132, 011010(2010).</li>
<li>Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+heterogeneity+of+the+rat+hippocampus+measured+by+atomic+force+microscope+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation.</a> Journal of Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).</li>
<li>Lee, E. H., Radok, J. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Contact+Problem+for+Visooelastic+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Mechanics%22%5BJournal%5D)">The Contact Problem for Visooelastic Bodies.</a> Journal of Applied Mechanics. 27 (3), 438-444 (1960).</li>
<li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft%2C+inhomogeneous+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).</li>
<li>Constantinides, G., Kalcioglu, Z. I., McFarland, M., Smith, J. F., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+mechanical+properties+of+fully+hydrated+gels+and+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Probing mechanical properties of fully hydrated gels and biological tissues.</a> Journal of Biomechanics. 41 (15), 3285-3289 (2008).</li>
<li>Shen, F., Tay, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Bilston+Nonlinear+Viscoelastic+Model+for+Finite+Element+Head+Injury+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering+--+Transactions+of+the+ASME%22%5BJournal%5D)">Modified Bilston Nonlinear Viscoelastic Model for Finite Element Head Injury Studies.</a> Journal of Biomechanical Engineering -- Transactions of the ASME. 128 (5), 797-801 (2006).</li>
<li>van Dommelen, J. aW., vander Sande, T. P. J., Hrapko, M., Peters, G. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+brain+tissue+by+indentation%3A+Interregional+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of brain tissue by indentation: Interregional variation.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 3 (2), 158-166 (2010).</li>
<li>Rother, J., Nöding, H., Mey, I., Janshoff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+microrheology+reveals+significant+differences+in+the+viscoelastic+response+between+malign+and+benign+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Open+biology%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines.</a> Open biology. 4 (5), 140046(2014).</li>
<li>Du, P., Lu, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+Young%27s+Relaxation+Modulus+of+PDMS+Using+Stress+Relaxation+Nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Symposium+DD+-+Microelectromechanical+Systems+-+Materials+and+Devices+III%22%5BJournal%5D)">Measuring the Young's Relaxation Modulus of PDMS Using Stress Relaxation Nanoindentation.</a> Symposium DD - Microelectromechanical Systems - Materials and Devices III. 1222 (c), (2009).</li>
<li>Elkin, B. S., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+the+P17+and+adult+rat+brain+from+indentation+in+the+coronal+plane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of the P17 and adult rat brain from indentation in the coronal plane.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 135, 114507(2013).</li>
<li>Brands, D. W., Bovendeerd, P. H., Peters, G. W., Wismans, J. S., Paas, M. H., van Bree, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+dynamic+behavior+of+brain+tissue+and+two+model+materials%5BTitle%5D)+AND+%2243rd+Stapp+Car+Crash+Conference+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Comparison of the dynamic behavior of brain tissue and two model materials.</a> 43rd Stapp Car Crash Conference Proceedings. , 313-320 (1999).</li>
<li>Hrapko, M., van Dommelen, J. A. W., Peters, G. W. M., Wismans, J. S. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+mechanical+behaviour+of+brain+tissue+in+compression+and+shear%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the mechanical behaviour of brain tissue in compression and shear.</a> Biorheology. 45 (6), 663-676 (2008).</li>
<li>Pogoda, K., Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compression+stiffening+of+brain+and+its+effect+on+mechanosensing+by+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Compression stiffening of brain and its effect on mechanosensing by glioma cells.</a> New Journal of Physics. 16 (7), 075002(2014).</li>
<li>Peters, G. W. M., Meulman, J. H., Sauren, A. A. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+applicability+of+the+time%2Ftemperature+superposition+principle+to+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">The applicability of the time/temperature superposition principle to brain tissue.</a> Biorheology. 34 (2), 127-138 (1997).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本論文で各技術は、脳組織の機械的性質の異なる側面を測定します。クリープコンプライアンスと応力緩和弾性率は時間に依存する機械的特性の尺度です。貯蔵弾性率および損失弾性率は、速度に依存する機械的特性を表します。インパクトインデントも速度に依存する機械的特性を測定したが、エネルギー散逸のコンテキストインチ組織の機械的特性を特徴づけるとき、両方のAFM対応インデントおよびレオロジーは、通常の方法を使用しています。前述のように時間に依存する材料特性を提供することに加えて、種々の実験パラメータは、細胞および組織の弾性率4、さらに周波数依存特性24を測定するために使用することができるので、AFM対応インデントは特に有用です。しかし、実験のデータと設計の正確な解釈は準拠して、水和した組織のために挑戦することができます。レオメトリー対策が適切一括ながら組織、AFM-有効インデントの絆は、細胞の微小環境に関連するマイクロスケールのボリュームを検査します。インパクトのインデントは、材料が焦点衝撃による外傷性脳損傷を研究するような用途において有用である濃厚、動的衝撃荷重の文脈に変形する方法を具体的に定量化する手段を提...

生物学的器官を含むほとんどの軟組織石灰化した骨または工学材料と比較して機械的及び構造的に複雑な、低剛性であり、非線形および時間依存の変形を示します。体内の他の組織と比較して、脳組織は1Paで数百程度の弾性率をEと、格段に準拠しています。脳組織は、異なるとの構造的不均一性を示し、また、機能的に異なるグレーと白質領域を互いにかみ合っ。脳組織の力学を理解することは、傷害の間に脳の応答を模倣する材料と計算モデルの設計に役立つ機械的損傷の予測を容易にし、保護戦略の設計を可能にします。さらに、このような情報は、組織再生のための設計目標を考慮するために使用することができ、より良好な多発性硬化症や自閉症などの疾患と関連している脳組織の構造的変化を理解します。 HERE、我々はメソ、ミクロで、脳組織を含む機械的に準拠した組織の粘弾性特性を特徴づけるために利用可能ないくつかの実験的アプローチ、およびマクロスケールを説明し、実証します。 マイクロスケールで、我々はクリープコンプライアンスを行い、原子間力顕微鏡（AFM）対応のインデントを使用して緩和実験を強制します。典型的に、AFM対応くぼみは、試料2-4の弾性率（または瞬間剛性）を推定するために使用されます。しかし、同一の器具はまた特性5-10（タイムまたはレートに依存）マイクロ粘弾性を測定することができます。 図1に示すこれらの実験の原理は、時間の経過とともに、脳組織内にプローブを片持ちAFMをインデント力や押し込み深さの特定の大きさを維持し、それぞれ押し込み深さと力の対応する変化を測定することです。これらのデータを用いて、クリープCOMPを算出することができますそれぞれliance J Cと緩和弾性率G R、。 メソスケールで、我々は振り子ベースのインストルメントナノインデンターを使用して、組織構造と水和レベルを維持する流体に浸漬条件における衝撃インデントの実験を行いました。実験は、 図2に示されている。振り子が組織と接触するように揺動するように、振動振り子が組織内に静止するまでの変位を時間の関数として記録されているプローブ。プローブの結果として生じる減衰高調波振動運動から、我々は、組織11,12の（エネルギー散逸率に関する）の最大侵入深さx MAX、エネルギー散逸能力K、及び散逸品質係数Qを算出することができます。 マクロスケールで、我々は、周波数依存のせん断弾性率を定量化するために、平行平板レオメーターを使用しました。組織の貯蔵弾性率G &#39;及び損失弾性率G &quot;を 、と呼ばれるレオメトリーのこのタイプでは、高調波角度歪みを適用する（剪断歪みに対応する）既知の振幅と周波数で及びreactionalトルクを測定（及びせん断応力に対応します） 図3に示すように、測定されたトルクの結果として得られる振幅と位相遅れおよびシステムの幾何学的な変数から、我々は興味13,14の印加周波数で&quot;G &#39;及びGを計算することができます。

<table><tbody><tr><td>キシラジン</td><td>ロイド ラボラトリー処方</td><td></td><td>薬</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>AnaSed 注射剤</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム(振動刃ミクロトーム)</td><td>ライカ</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-A Medium</td><td>Gibco</td><td>A1247501</td><td>成人組織用 CO2非依存神経培地</td></tr><tr><td>原子間力顕微鏡、MFP-3D-BIO</td><td>アサイラム・リサーチ</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>シャーレ・ヒーター</td><td>アサイラム・リサーチ</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- AFM プローブ、0.03 N/m、10&nbsp;&マイクロ;m半径ホウケイ酸球</td><td>Novascan</td><td>PT.</td><td></td>GS</tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>ムール貝由来の生体接着</td></tr>剤 <tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>代替サプライヤーは、</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム、1 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59223C</td><td>代替サプライヤーを使用できます</td></tr><tr><td>計装インデンター、NanoTest Vantage</td><td>Micro Materials Ltd.</td><td>-</td><td>プローブ先端を機械加工する必要があります(スチールフラットパンチ、1&nbsp;mm径、4-5&nbsp;mmの長さ)</td></tr><tr><td>NanoTest Liquid Cell</td><td>Micro Materials Ltd.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>平行平板レオメーター MCR501</td><td>Anton-Parr-PP25</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Anton-Parr-25</td><td></td> <td>mm直径フラット測定プレート</td></tr><tr><td>接着剤サンド</td><td>ペーパーMcMaster-Carr</td><td>4184A48</td>代替<td>サプライヤーを使用可能</td></tr><tr><td>Loctite4013インスタント接着剤</td><td>ヘンケル</td><td>20268</td><td>代替サプライヤーを使用可能</td></tr></tbody></table>

原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

機械的な模擬または組織再生研究のためかどうか、脳の性質に触発された材料を設計エンジニアには、脳組織自体がよく、様々な長さと時間スケールで特徴づけされなければなりません。多くの生物学的組織のように、脳組織は、複雑な階層構造を示します。しかし、大部分の他の組織とは対照的に、脳はPaで数百のオーダーのヤング弾性率をEと、非常に低い機械的剛性のものである。この低剛性は、キーの機械的特性の実験的特性評価に課題を提示することができます。ここでは、異なる長さスケールおよび負荷速度で、例えば、脳組織などの水和、コンプライアントの生物学的材料の弾性および粘弾性特性を測定するように適応されているいくつかの機械的特性評価技術を実証します。マイクロスケールで、我々は原子間力顕微鏡対応のインデントを使用して、クリープコンプライアンスと力緩和実験を行います。 mesosでCALEは、我々は振り子ベースのインストルメント圧子を使用して、衝撃インデント実験を行います。マクロスケールで、我々は周波数に依存するせん断弾性率を定量化するために平行プレートレオメトリーを行っています。また、それぞれの方法に伴う課題や制限について説明します。一緒にこれらの技術は、より良い脳の構造を理解するために、バイオ風の材料を操作するために使用することができます脳組織の徹底的な機械的特性評価を可能にします。

図4は 、それぞれ適用された力あるいは押し込み深さ（ 図4A、D）、与えられた、クリープコンプライアンスのための時間応答（ 図4B、E）対代表インデントと力を示し、リラクゼーション実験を強制します。これらのデータおよびシステムの幾何学的形状を使用して、クリープコンプライアンスJの C（t）と緩和弾性率G R（t）を強制することは、脳の異なる領域（ 図4C、F）について計算することができます。以前の研究は、脳23の異なる領域の弾性率の差を示しているが、粘弾性特性は、所与の組織切片内の地域間変動を示していないマウスの脳組織切片のためにこのようにして測定しました。 インパクトのインデントは、空間的および時間的にconcen...

私たちは、ミクロ、メソ、マクロスケールで脳の粘弾性力学的特性を特徴づける一連の技術を提示します。

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

これらの機械的特性評価手法の全体的な目的は、異なる長さスケールおよび負荷速度における生体組織の粘弾性特性を測定することです。これらの手法は、バイオエンジニアリングにおける重要な疑問に答えるために利用できます。例えば、極めて高い負荷速度の下で脳がどのように変形するのか、あるいは多発性硬化症や自閉症などの疾患が脳組織の機械的特性にどのような影響を及ぼすのか、といった点です。これらの手法の主な利点は、生体組織のような剛性が非常に低く含水率が非常に高い材料に対して、広範な負荷条件下での試験が可能であることです。また、単一細胞レベルから脳全体に至るまで、非常に幅広い材料体積での試験も可能です。これらの手法の意義は、外傷時の脳の反応のモデリングへと展開され、これは保護戦略を設計する上で重要となります。本法は脳の機械的特性に関する知見を提供できるだけでなく、心臓や肝臓などの他の柔軟な生体組織にも適用可能です。柔軟な組織の機械的特性評価において、測定プローブと組織との間に適切な接触を確立することが極めて重要です。公称ばね定数 0.03 N/m の AFM プローブに、直径 20 µm のホウケイ酸ガラスビーズを慎重に装着し、プローブホルダーにセットします。ペトリ皿に固定した脳スライスを、37 °C に予熱した AFM ステージ搭載ヒーターの上に配置します。次に、あらかじめ温めておいた培地を約2 mL加えます。続いて、脳切片を囲む培地の中にAFMプローブを降ろす際、表面張力でプローブが破損するのを防ぐため、プローブの先端に培地を1滴慎重に滴下します。その後、AFMヘッドをステージ上の正しい位置に戻し、培地に浸かるまでヘッドをゆっくりと降ろします。光学顕微鏡を使用してステージを移動させ、関心領域を校正済みAFMプローブの直下に配置し、AFMプローブを降ろして組織表面に接触させます。クリープコンプライアンス試験を行うために、ソフトウェアの関数エディタで印加力関数を作成します。この関数は、5 nanonewtonの設定値まで0.1秒でランプアップし、それを20秒間保持した後、1秒で0 nanonewtonまでランプダウンするように構成します。ソフトウェアは、荷重印加機能の実行中に、AFMプローブが組織に押し込まれた際の圧入データを記録します。クリープコンプライアンス試験の実行後、ソフトウェアで圧入関数を作成し、応力緩和試験を行います。組織への圧入時にAFMプローブが受ける荷重データをソフトウェアで収集しながら、この関数を実行してください。衝撃圧子試験を開始するには、ピンセットを使用して球状プローブを振り子にスライドさせて装着します。次に、溶融石英サンプルポストをプレートに取り付け、プレートを並進ステージにねじ込んで固定します。水和した脳組織の動的衝撃実験を可能にするには、まずリキッドセルのキャリブレーションを行ってください。ソフトウェアのキャリブレーションメニューに移動し、「Liquid Cell」を選択して、ソフトウェアの指示に従い溶融石英サンプルに接触させます。次に、インデンタータイプに「Normal」を選択し、インデンター荷重にはデフォルト値の0.05 millinewtonsを使用します。その後、「continue」をクリックして、垂直インデンター構成のキャリブレーションを実行します。次に、サンプルステージを少なくとも5 mm戻し、レバーアームを取り付けます。インデンタータイプにLiquid Cellを選択し、新しい構成でリキッドセル校正を繰り返します。Continueをクリックして、リキッドセル校正係数を取得します。次に、コンデンサ電極の間隔を広げます。コンデンサ電極の間隔を広げると、測定可能な最大深さが増加し、柔軟性の高い材料をテストする際に必要となります。レンチを使用して、コンデンサ電極の間隔を調整する3つのナットを、時計回りに少しずつ回してください。時計回りに1回転させるごとに、メンテナンスメニューから「Bridge Box Adjustment」を選択し、良好なペンデュラムテストの結果を得てください。Approx. Depth Calibrationの値が70,000 nanometers per volt以上になるまで、ナットをゆっくりと調整し続けてください。次に、電源でオン・オフを切り替え可能な新しいリミットストップを振り子の底部に配置します。振り子の背面にある元々のリミットストップは、振り子の動作の妨げになる可能性があるため取り除き、衝突速度の向上および柔軟な試料への貫通深さを深められるようにします。ソレノイドの電源を入れ、10 voltsに設定します。次に、「Experiment」メニューに移動し、「Impact and Adjust Impulse Displacement」を選択します。ソフトウェアの指示に従って、振り子のスイング距離をキャリブレーションします。インパクト圧痕のセットアップが完全に完了したら、培地を吸引し、脳切片を乾燥させます。次に、シアノアクリレート系接着剤を薄く塗り、スライスした脳をアルミニウム製サンプルポストに固定します。その後、リキッドセルをサンプルポストの2番目のOリングにスライドさせて被せ、リキッドセルに5 mLの二酸化炭素非依存性培地を満たして、組織を完全に浸します。レバーアームの先端がバスの上に適切に位置するまで、バスをX方向の負の方向に移動させます。次に、チップが完全にバスに浸かり、サンプルの正面に位置するまで正のZ方向に移動させます。「Sample Stage Control」ウィンドウを使用して慎重に接触させ、その後、ステージをサンプル表面から約30 µm後退させます。「Experiment」メニューから「Impact」をクリックし、インパクト実験を設定します。スイング距離のキャリブレーションに基づき、結果として得られる衝突速度に直接関係する特定のインパルス荷重を選択します。その後、予定されていた実験を実施してください。振り子が戻り、試料表面が測定面に向かって移動し続けた時点で、下限リミットスイッチをオフにします。プローブの時間経過に伴う変位がソフトウェアによって記録されます。直径25 millimeterの測定プローブにサンドペーパーを取り付けます。次に、サーマルシステムを取り付け、プローブを装着します。最後に、もう一枚のサンドペーパーを、上部プレートに合わせて底部プレートに取り付けます。製造元の指示に従ってレオメーターを校正してください。まず、プローブの力をゼロ点調整します。次に、プローブと底面プレートを接触させます。その後、プローブの慣性を測定します。最後に、モーターの調整を行います。その後、測定プレートをゆっくりと下げます。プレートが組織から1mm以内に近づいたら、プレートが組織の上端表面に完全に接触し、測定された垂直抗力が目的の値になるまで、0.1mm刻みで下げます。処置中の水分を維持するため、サンプルの端に少量の培地をピペッティングして滴下します。サーマルフードを下げます。次に、[File]、[New]の順にクリックし、[Gel]タブの下で[Frequency Sweep]を選択します。その後、[window measurement one frequency sweep]をクリックし、[oscillation]ボックスをダブルクリックします。周波数範囲、ひずみ、およびポイント数を入力します。最後に［OK］を選択し、［Start］をクリックして周波数スイープを開始します。以下は、クリープコンプライアンスおよび応力緩和試験における、代表的な圧入量および荷重の時間応答です。これらのデータとシステムの幾何学的形状を用いることで、脳の異なる領域におけるクリープコンプライアンスおよび力緩和弾性率を算出できます。衝撃インデンテーションは、空間的および時間的に集中した高速度荷重下における組織の機械的特性を測定します。得られた衝撃応答パラメータを異なる衝撃速度で定量化することにより、組織の速度依存性特性を研究することが可能になります。レオロジーでは、貯蔵弾性率と損失弾性率を用いて、バルク組織の周波数依存的な粘弾性特性を測定します。低周波数域では、貯蔵弾性率が損失弾性率よりもほぼ1桁大きいため、脳組織の挙動は弾性的特性が支配的であることが示されます。本手順を行う際は、組織を十分に水和させるか、適切な構造を維持するための液体に浸漬しておくことが重要です。これらの実証された技術の開発により、材料研究者が脳の機械的応答を模倣できる合成ゲルの設計および最適化を行う道が開かれました。このビデオを視聴することで、原子間力顕微鏡を用いたインデンテーション、衝撃インデンテーション、およびレオロジーを用いて、組織の粘弾性機械的特性をどのように評価するかについて深く理解できるはずです。収集したデータを解釈する際は、変形した組織の体積が構造的に均質であり、弾性的に等方性であるという基本的仮定を忘れないでください。これは必ずしもすべての生物学的組織に当てはまるわけではありません。生物学的組織の力学に関する問いがより明確になれば、関心のある適切な長さスケールまたは時間スケールでその問いに答えるために、これらの力学実験の中から1つまたは複数を選択することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

細胞外マトリックスの剛性が強く、接着細胞の複数の動作に影響を与えます。マトリックスの剛性は、組織全体に空間的に変化し、様々な疾患状態の修正を受ける。ここでは、原子間力顕微鏡のmicroindentationを使用して、通常と線維化マウスの肺組織における剛性の空間的な変動を特徴付けるための方法を開発する。...

原子間力顕微鏡を用いた肺組織のマイクロメカニカル特性

出典:Canovic, E. P., et al.原子間力顕微鏡、衝撃インデンテーション、およびレオメトリーを使用した脳組織のマルチスケールの機械的特性の特性評価。J. Vis. Exp.

原子間力顕微鏡を用いたマウス脳組織の機械的特性の評価

出典:Canovic, E. P., et al., Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry.J. Vis.

マウス脳組織の機械的特性を評価するためのインパクトインデンテーション

出典: Canovic, E. P., et al.原子間力顕微鏡、衝撃インデンテーション、およびレオメトリーを使用した脳組織のマルチスケールの機械的特性の特性評価。J. Vis.

レオメトリーを用いたマウス脳組織の粘弾性特性の測定

本論文では、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、microindentationにより、生きた細胞の機械的性質を特徴づけるためのプロトコルを示しています。...

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

この実験プロトコルは、原子間力顕微鏡がどのようにして真のナノメートルスケールでの硬さを測定し、単一の原子塑性イベントを検出するために使用できるかを説明しています。...

計装AFMインデンテーションによる定量硬度測定

ここでは、細胞や組織に対してナノ・マイクロインデントツールとして動作する原子力顕微鏡(AFM)を紹介する。器械はサンプルの3D表面の地形および細胞壁ヤングの係数およびターゴール圧力を含む機械特性の同時獲得を可能にする。...

原子間力顕微鏡を用いて植物細胞と植物組織の機械的特性とターゴール圧を測定

このプロトコルは、ヒドロゲルや細胞を含むソフトマテリアルナノインデンテーション実験のための完全なワークフローを提供します。まず、力分光法データを取得するための実験手順が詳述されています。次に、そのようなデータの分析は、GitHubから無料でダウンロードできる新しく開発されたオープンソースのPythonソフトウェアを通じて詳細に説明されます。...

ソフトマターナノインデンテーションの実験・データ解析ワークフロー

原子間力顕微鏡と偏光顕微鏡を組み合わせた肝臓のこわばり測定

原子間力顕微鏡(AFM)プローブチップが試料表面に与える接触面積と力を定量化することで、ナノスケールの機械的特性測定が可能になります。弾性率やその他のナノ機械的特性を測定するために、柔らかいサンプルと硬いサンプルの空気または流体にAFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを実装するためのベストプラクティスについて説明します。...

原子間力顕微鏡カンチレバーを用いたナノインデンテーション:空気および流体中のナノスケールでの機械的特性測定

このプロトコルは、マウス肺組織の凍結切片を調製する方法、原子間力顕微鏡の力マップ実験を行う方法、およびデータを分析してネイティブマウス肺基底膜のヤング率を決定する方法を視覚化します。...

原子間力顕微鏡から得られたフォースマップからのネイティブマウス肺基底膜のヤング率の抽出

学ぶ脳組織のマルチスケール粘弾性特性評価法。原子間力顕微鏡、インパクトインデント、レオロジーを用いて、単細胞から全脳までの力学的性質を測定し、神経疾患や外傷モデリングに活用します。

原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

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