原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

これらの機械的特性評価手法の全体的な目的は、異なる長さスケールおよび負荷速度における生体組織の粘弾性特性を測定することです。これらの手法は、バイオエンジニアリングにおける重要な疑問に答えるために利用できます。例えば、極めて高い負荷速度の下で脳がどのように変形するのか、あるいは多発性硬化症や自閉症などの疾患が脳組織の機械的特性にどのような影響を及ぼすのか、といった点です。

これらの手法の主な利点は、生体組織のような剛性が非常に低く含水率が非常に高い材料に対して、広範な負荷条件下での試験が可能であることです。また、単一細胞レベルから脳全体に至るまで、非常に幅広い材料体積での試験も可能です。これらの手法の意義は、外傷時の脳の反応のモデリングへと展開され、これは保護戦略を設計する上で重要となります。本法は脳の機械的特性に関する知見を提供できるだけでなく、心臓や肝臓などの他の柔軟な生体組織にも適用可能です。

柔軟な組織の機械的特性評価において、測定プローブと組織との間に適切な接触を確立することが極めて重要です。公称ばね定数 0.03 N/m の AFM プローブに、直径 20 µm のホウケイ酸ガラスビーズを慎重に装着し、プローブホルダーにセットします。ペトリ皿に固定した脳スライスを、37 °C に予熱した AFM ステージ搭載ヒーターの上に配置します。

次に、あらかじめ温めておいた培地を約2 mL加えます。続いて、脳切片を囲む培地の中にAFMプローブを降ろす際、表面張力でプローブが破損するのを防ぐため、プローブの先端に培地を1滴慎重に滴下します。その後、AFMヘッドをステージ上の正しい位置に戻し、培地に浸かるまでヘッドをゆっくりと降ろします。

光学顕微鏡を使用してステージを移動させ、関心領域を校正済みAFMプローブの直下に配置し、AFMプローブを降ろして組織表面に接触させます。クリープコンプライアンス試験を行うために、ソフトウェアの関数エディタで印加力関数を作成します。この関数は、5 nanonewtonの設定値まで0.1秒でランプアップし、それを20秒間保持した後、1秒で0 nanonewtonまでランプダウンするように構成します。

ソフトウェアは、荷重印加機能の実行中に、AFMプローブが組織に押し込まれた際の圧入データを記録します。クリープコンプライアンス試験の実行後、ソフトウェアで圧入関数を作成し、応力緩和試験を行います。組織への圧入時にAFMプローブが受ける荷重データをソフトウェアで収集しながら、この関数を実行してください。

衝撃圧子試験を開始するには、ピンセットを使用して球状プローブを振り子にスライドさせて装着します。次に、溶融石英サンプルポストをプレートに取り付け、プレートを並進ステージにねじ込んで固定します。水和した脳組織の動的衝撃実験を可能にするには、まずリキッドセルのキャリブレーションを行ってください。

ソフトウェアのキャリブレーションメニューに移動し、「Liquid Cell」を選択して、ソフトウェアの指示に従い溶融石英サンプルに接触させます。次に、インデンタータイプに「Normal」を選択し、インデンター荷重にはデフォルト値の0.05 millinewtonsを使用します。その後、「continue」をクリックして、垂直インデンター構成のキャリブレーションを実行します。

次に、サンプルステージを少なくとも5 mm戻し、レバーアームを取り付けます。インデンタータイプにLiquid Cellを選択し、新しい構成でリキッドセル校正を繰り返します。Continueをクリックして、リキッドセル校正係数を取得します。

次に、コンデンサ電極の間隔を広げます。コンデンサ電極の間隔を広げると、測定可能な最大深さが増加し、柔軟性の高い材料をテストする際に必要となります。レンチを使用して、コンデンサ電極の間隔を調整する3つのナットを、時計回りに少しずつ回してください。

時計回りに1回転させるごとに、メンテナンスメニューから「Bridge Box Adjustment」を選択し、良好なペンデュラムテストの結果を得てください。Approx. Depth Calibrationの値が70,000 nanometers per volt以上になるまで、ナットをゆっくりと調整し続けてください。

次に、電源でオン・オフを切り替え可能な新しいリミットストップを振り子の底部に配置します。振り子の背面にある元々のリミットストップは、振り子の動作の妨げになる可能性があるため取り除き、衝突速度の向上および柔軟な試料への貫通深さを深められるようにします。ソレノイドの電源を入れ、10 voltsに設定します。

次に、「Experiment」メニューに移動し、「Impact and Adjust Impulse Displacement」を選択します。ソフトウェアの指示に従って、振り子のスイング距離をキャリブレーションします。インパクト圧痕のセットアップが完全に完了したら、培地を吸引し、脳切片を乾燥させます。

次に、シアノアクリレート系接着剤を薄く塗り、スライスした脳をアルミニウム製サンプルポストに固定します。その後、リキッドセルをサンプルポストの2番目のOリングにスライドさせて被せ、リキッドセルに5 mLの二酸化炭素非依存性培地を満たして、組織を完全に浸します。レバーアームの先端がバスの上に適切に位置するまで、バスをX方向の負の方向に移動させます。

次に、チップが完全にバスに浸かり、サンプルの正面に位置するまで正のZ方向に移動させます。「Sample Stage Control」ウィンドウを使用して慎重に接触させ、その後、ステージをサンプル表面から約30 µm後退させます。「Experiment」メニューから「Impact」をクリックし、インパクト実験を設定します。

スイング距離のキャリブレーションに基づき、結果として得られる衝突速度に直接関係する特定のインパルス荷重を選択します。その後、予定されていた実験を実施してください。振り子が戻り、試料表面が測定面に向かって移動し続けた時点で、下限リミットスイッチをオフにします。

プローブの時間経過に伴う変位がソフトウェアによって記録されます。直径25 millimeterの測定プローブにサンドペーパーを取り付けます。次に、サーマルシステムを取り付け、プローブを装着します。

最後に、もう一枚のサンドペーパーを、上部プレートに合わせて底部プレートに取り付けます。製造元の指示に従ってレオメーターを校正してください。まず、プローブの力をゼロ点調整します。

次に、プローブと底面プレートを接触させます。その後、プローブの慣性を測定します。最後に、モーターの調整を行います。

その後、測定プレートをゆっくりと下げます。プレートが組織から1mm以内に近づいたら、プレートが組織の上端表面に完全に接触し、測定された垂直抗力が目的の値になるまで、0.1mm刻みで下げます。処置中の水分を維持するため、サンプルの端に少量の培地をピペッティングして滴下します。

サーマルフードを下げます。次に、[File]、[New]の順にクリックし、[Gel]タブの下で[Frequency Sweep]を選択します。その後、[window measurement one frequency sweep]をクリックし、[oscillation]ボックスをダブルクリックします。

周波数範囲、ひずみ、およびポイント数を入力します。最後に［OK］を選択し、［Start］をクリックして周波数スイープを開始します。以下は、クリープコンプライアンスおよび応力緩和試験における、代表的な圧入量および荷重の時間応答です。

これらのデータとシステムの幾何学的形状を用いることで、脳の異なる領域におけるクリープコンプライアンスおよび力緩和弾性率を算出できます。衝撃インデンテーションは、空間的および時間的に集中した高速度荷重下における組織の機械的特性を測定します。得られた衝撃応答パラメータを異なる衝撃速度で定量化することにより、組織の速度依存性特性を研究することが可能になります。

レオロジーでは、貯蔵弾性率と損失弾性率を用いて、バルク組織の周波数依存的な粘弾性特性を測定します。低周波数域では、貯蔵弾性率が損失弾性率よりもほぼ1桁大きいため、脳組織の挙動は弾性的特性が支配的であることが示されます。本手順を行う際は、組織を十分に水和させるか、適切な構造を維持するための液体に浸漬しておくことが重要です。

これらの実証された技術の開発により、材料研究者が脳の機械的応答を模倣できる合成ゲルの設計および最適化を行う道が開かれました。このビデオを視聴することで、原子間力顕微鏡を用いたインデンテーション、衝撃インデンテーション、およびレオロジーを用いて、組織の粘弾性機械的特性をどのように評価するかについて深く理解できるはずです。収集したデータを解釈する際は、変形した組織の体積が構造的に均質であり、弾性的に等方性であるという基本的仮定を忘れないでください。

これは必ずしもすべての生物学的組織に当てはまるわけではありません。生物学的組織の力学に関する問いがより明確になれば、関心のある適切な長さスケールまたは時間スケールでその問いに答えるために、これらの力学実験の中から1つまたは複数を選択することができます。