原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

これらの機械的特性評価技術の全体的な目標は、さまざまな長さスケールと負荷速度で生体組織の粘弾性特性を測定することです。これらの方法は、生物工学における重要な質問に答えるために使用できます。例えば、非常に高い負荷率で脳がどのように変形するか、多発性硬化症や自閉症などの病気が脳組織の機械的特性にどのように影響するかなどです。

これらの技術の主な利点は、生体組織のように、剛性が非常に低く、水和性が非常に高い材料の場合、幅広い負荷条件でテストでき、また、単一細胞のレベルから脳全体のレベルまで、幅広い材料量でテストできることです。これらの技術の意味は、損傷時の脳の応答のモデル化にまで及び、これは工学的な保護戦略にとって重要です。この方法は、脳の機械的特性に関する洞察を得ることができますが、心臓や肝臓などの他の適合生体組織にも適用できます。

適合組織の機械的特性評価では、測定プローブと組織との間に適切な接触を確立することが重要です。公称ばね定数が0.03ニュートン/メートルのAFMプローブと直径20マイクロメートルのホウケイ酸ビーズをプローブホルダーに慎重にロードします。シャーレにセットされたブレインスライスを、摂氏37度に予熱したAFMステージマウントヒーターに置きます。

次に、約2ミリリットルの予熱した培地を追加します。次に、AFMプローブに培地を慎重に滴下して、脳スライスを囲む培地に下げたときに表面張力による破損から保護します。次に、AFMヘッドをステージ上に再配置し、ヘッドが媒体に沈むまでヘッドを下げ始めます。

光学顕微鏡を使用して、対象領域がキャリブレーションされたAFMプローブの下に来るようにステージを動かし、次にAFMプローブを下げて組織の表面に接触させます。クリープコンプライアンス実験を行うには、ソフトウェアの関数エディタで印加力関数を構築します。この機能は、5ナノニュートンの設定値まで0.1秒のランプで20秒間保持され、その後、ゼロナノニュートンまで1秒のランプダウンで構成されます。

このソフトウェアは、力関数が加えられている間に、AFMプローブの組織へのくぼみに関するデータを記録します。クリープコンプライアンス実験を実行した後、ソフトウェアでインデンテーション関数を適用して力緩和実験を行います。この機能を実行しながら、ソフトウェアがAFMプローブが組織にインデントするときに受ける力に関するデータを収集します。

衝撃インデンテーションテストを開始するには、ピンセットを使用して球形プローブを振り子にスライドさせて一致させます。次に、溶融石英サンプルポストをプレートに取り付け、プレートを並進ステージにねじ込みます。水和した脳組織に対する動的衝撃実験を可能にするには、まず液体細胞のキャリブレーションを行います。

ソフトウェアのキャリブレーションメニューに移動し、リキッドセルを選択し、ソフトウェアの指示に従って融合石英サンプルに接触させます。次に、[圧子タイプ]で[標準]を選択し、[圧子負荷]にデフォルト値の0.05ミリニュートンを使用します。次に、[続行]をクリックして、通常の圧子構成のキャリブレーションを実行します。

次に、サンプルステージを少なくとも5ミリメートル戻し、レバーアームを取り付けます。新しい構成で液体セルのキャリブレーションを繰り返し、圧子タイプとして[液体セル]を選択します。[続行]をクリックして、液体セルのキャリブレーション係数を取得します。

次に、コンデンサプレートの間隔を広げます。コンデンサプレートの間隔を大きくすると、コンプライアンスの高い材料の試験に必要な最大測定可能な深さが増加します。レンチで、コンデンサプレートの間隔を制御する3つのナットを時計回りに少しずつ回します。

時計回りに完全に回転するたびに、[メンテナンス]メニューの[ブリッジボックス調整]を選択し、適切な振り子テストを取得します。およそ 深さの口径測定 ボルトあたり70、000ナノメートルまたはそれ以上の値を読み取るまでナットをゆっくり調節し続けます。

次に、振り子の下部に新しいリミットストップを配置し、電源を介してオンとオフを切り替えることができるようにします。振り子の後ろにある元のリミットストップを引っ込めて、振り子の動きの潜在的な障害物を取り除き、より速い衝撃速度と準拠したサンプルへのより高い浸透深さを可能にします。ソレノイドの電源をオンにし、10ボルトに設定します。

次に、[Experiment] メニューに移動し、[Impact] と [Adjust Impulse Displacement] を選択します。ソフトウェアの指示に従って、振り子のスイング距離を調整します。インパクトインデントのセットアップが完全に完了したら、メディウムを吸引し、ブレインスライスを乾燥させます。

次に、シアノアクリレート接着剤の薄層を使用して、スライスした脳をアルミニウムサンプルポストに固定します。次に、液体セルをサンプルポストの2番目のOリングの上にスライドさせ、液体セルに5ミリリットルの二酸化炭素に依存しない培地を充填して、組織を完全に浸します。レバーアームの先端がバスの上に適切に配置されるまで、バスをマイナスのX方向に動かします。

次に、先端がバスに完全に浸され、サンプルの前に来るまで、正のZ方向に移動します。「Sample Stage Control」ウィンドウを使用して、慎重に接触させてから、ステージをサンプル表面から約 30 マイクロメートル離します。[実験] メニューで [影響] をクリックし、影響実験を設定します。

スイング距離のキャリブレーションに基づいて、結果として得られる衝撃速度に直接関連する特定のインパルス荷重を選択します。次に、スケジュールされたテストを実行します。振り子が後ろに振れ、サンプル表面が測定平面に移動し続ける場合は、下限スイッチをオフにします。

時間の関数としてのプローブの変位は、ソフトウェアによって記録されます。直径25mmの測定プローブにサンドペーパーを貼り付けます。次に、サーマルシステムを取り付け、プローブを取り付けます。

最後に、もう一枚サンドペーパーを天板に合わせて底板に取り付けます。メーカーの指示に従ってレオメータを校正します。まず、プローブにかかる力をゼロにします。

次に、プローブと底板の間の接触を確立します。次に、プローブの慣性を測定します。最後に、モーターの調整を行います。

次に、測定プレートをゆっくりと下げます。プレートが組織の1ミリメートル以内にある場合、プレートが組織の上面に完全に接触し、測定された垂直抗力が目的の値になるまで、プレートを0.1ミリメートル刻みで下げます。サンプルの端に少量の培地をパイプで送り出し、手順中の水分補給を維持します。

サーマルフードを下げます。次に、[File]、[New] の順にクリックし、[Gel] タブで [Frequency Sweep] を選択します。次に、ウィンドウ測定1周波数スイープをクリックし、振動ボックスをダブルクリックします。

周波数範囲、ひずみ、およびポイント数を入力します。最後に、[OK]を選択し、[開始]をクリックして周波数スイープを開始します。以下は、クリープコンプライアンス実験と力緩和実験の両方について、代表的なインデンテーションと力対時間応答です。

これらのデータとシステムの形状を使用して、脳のさまざまな領域についてクリープコンプライアンスと力緩和弾性率を計算できます。衝撃インデンテーションは、空間的および時間的に集中した負荷の高率で組織の機械的特性を測定します。結果として得られる衝撃応答パラメータは、さまざまな衝撃速度で定量化できるため、組織の速度依存性の特性を研究する手段が得られます。

レオロジーは、バルク組織の周波数依存性粘弾性特性を、貯蔵弾性率と損失弾性率の観点から測定します。蓄積弾性率は、低周波での損失弾性率よりもほぼ一桁大きく、弾性特性が脳組織の振る舞いを支配していることを示しています。この手順を試みるときは、組織を十分に水分補給するか、組織が適切な構造を維持するのに役立つ液体に浸すことが重要です。

これらの実証された技術の開発により、材料研究者は、脳の機械的応答を模倣できる最適化された合成ゲルを設計する道が開かれました。このビデオを見れば、原子間力顕微鏡でインデンテーション、インパクトインデンテーション、レオロジーを使用して組織の粘弾性力学特性を特徴付ける方法について十分に理解できるはずです。収集されたデータを解釈するときは、組織の変形した体積が構造的に均質で弾性的に等方的であるという基本的な仮定を覚えておいてください。

これは必ずしもすべての生体組織に当てはまるわけではありません。生体組織の力学に関する疑問がより明確になるにつれて、これらの力学実験を1つ以上選択して、関心のある適切な長さスケールまたは時間スケールで質問に答えることができます。