ヒト多能性幹細胞の懸濁液ベースの心臓分化のためのマイクロウェル中の凝集体サイズの最適化

まず、シングルセルヒト多能性幹細胞(HPSC 懸濁液)を 200 g で 5 分間遠心分離します。遠心分離後、洗浄培地を吸引し、細胞を凝集培地に1.2倍10の密度で再懸濁し、10個あたり6番目の細胞にします。次に、調製したマイクロウェルプレート上の各ウェルに1ミリリットルの細胞懸濁液を播種し、細胞を均等に分配します。

多数のウェルを播種するには、定期的に細胞懸濁液をボルテックスして沈降を防ぎます。播種後、プレートを200倍gで5分間遠心分離します。スピン後、プレートを顕微鏡で観察し、細胞が各マイクロウェルの底部にスピンしたことを確認します。

次に、プレートを摂氏37度で5%C-O 2、5%O 2の低酸素インキュベーターで24時間インキュベートします。凝集の翌日、顕微鏡で凝集体を検査します。遠心分離直後の凝集体と比較すると、エッジが滑らかで無傷に見えるはずです。

マイクロウェルプレートを水平に保持し、P-1000マイクロピペッターの先端を培地の表面に置き、ウェルの端に当てて上清を取り除きます。次に、マイクロウェルの底にある凝集体を乱さないように注意しながら、培地をゆっくりと取り出します。培地レベルをテクスチャード加工されたマイクロウェル表面から約1〜2ミリメートルに下げた後、プレートをゆっくりと傾け、残りの培地をウェルからゆっくりと吸引します。

ピペットの先端をウェルの内側の端に保持し、培地をウェルの内壁に非常にゆっくりと分注することにより、新たに調製したステージ1誘導培地を1ミリリットル追加します。プレートを低酸素条件下で3日間インキュベーターに戻します。4日目に、5ミリリットルの血清ピペットを使用して、マイクロウェルプレートの各ウェルから凝集体を回収します。

15ミリリットルの円錐形チューブに最大10ウェルの骨材懸濁液を収集します。凝集体を低酸素インキュベーターで15分間沈殿させます。凝集体が落ち着いたら、上清を慎重に吸引し、凝集体を予熱した洗浄媒体10ミリリットルに再懸濁して、残留誘導性サイトカインを除去します。

凝集体を50倍gで2分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、ペレット化した凝集体を予熱したステージ2誘導媒体に再懸濁します。骨材懸濁液を24ウェルの超低アタッチメントプレートに1ウェルあたり1ミリリットルで移します。

顕微鏡下で凝集体を均一なタイトセルクラスターとして観察します。6日目まで低酸素条件下でインキュベートします。6日目は、以前と同様に、15ミリリットルのコニカルチューブあたり最大10ミリリットルの骨材をプールします。

凝集体が沈降した後、上清を吸引し、予熱したステージ3誘導媒体に凝集体を再懸濁します。5ミリリットルの血清ピペットを使用して、凝集体をウェルあたり1ミリリットルの24ウェル超低アタッチメントプレートに再分配します。培養の10日目に完全な培地変更を行います。

12日目に、残りの培養期間について、細胞を20%酸素および5%二酸化炭素の正常酸素培養条件に移します。12日間の分化後(これは心臓導入ステージ3の中期の6日間に相当)、強力な凝集体全体の収縮が観察されました。17日目には、ヒストグラムの塗りつぶされた部分で示されているように、フローサイトメトリーにより、74.8%の細胞が心筋トロポニンTに陽性です。

また、二次抗体のみで染色された細胞も示されており、ヒストグラムの未充填部分で示されています。この手順を試みるときは、4日目に凝集体をよく洗浄して、微量のサイトカイン、特に内胚葉の分化を促進するアクチビンAを除去することが重要です。この手順に続いて、凝集体内の誘導性細胞タイプの冷却培養などの他の方法を実行して、隣接する胚組織からのパラクリンシグナル伝達がヒト多能性幹細胞の心系譜への分化にどのように影響するかなどの他の質問に答えることができます。