Name: ヒト多能性幹細胞の懸濁液ベースの心臓分化のためのマイクロウェル中の凝集体サイズの最適化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 学ぶマイクロウェルを用いたヒト多能性幹細胞のサイズ制御凝集体形成法。遠心分離と低酸素培養で心筋分化の均一性を向上させ、心臓トロポニンT発現と収縮活性を確認する技術を習得できます。

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このプロトコルが開発された研究室のピーター・ザンドストラ博士、そしてこのプロセスが基づいた初期の方法を確立するための支援を提供してくれたマーク・ガリアルディ博士とゴードン・ケラー博士に感謝します。プロトコルの開発は、C.B.へのオンタリオ州科学技術大学院奨学金と、オンタリオ州心臓脳卒中財団からのピーター・ザンドストラへの助成金によって支援されました。

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</ol>

M.U.は、基礎となるマイクロウェル技術に金銭的利害関係を持っています。

多能性幹細胞の効率的な心臓分化は、高度に可変なプロセスであることが観察されています。それは、異なる細胞株は、特定の細胞型への分化能のために変化する傾向を示すことは驚くべきことではないが、心臓の分化効率がレプリケート間劇的に変動することが観察された同じ細胞株6を使用して実行されます。ここで説明するプロトコルは、直接の集約あたりの入力セルの数を制御することによって、この変動の一つの大きな源に対処しています。さらに実行の間のばらつきを低減するためには、単一細胞継代のために適合HPSC線が多能性マーカーの発現頻度（ 例えば 、あるOct4、Nanogのに対して、より一貫性の多能性集団におけるHPSCの拡大とメンテナンス結果のこの形として、使用することをお勧めしますTRA-1-60、 等 。）。 ここに書かれたようなプロトコルがoのために1,000細胞の凝集体サイズを指定しますHES-2胚性幹細胞株からptimal心臓誘導。異なる細胞株にこのプロトコルを適用するためには、初期の凝集体サイズ画面は細胞株特異的な最適な凝集体サイズを決定するために実行することが重要です。それがここで直接従うべき手順には影響しませんが、我々は、凝集体サイズと全体的な細胞密度の変化は酸素供給に影響を与えることが期待されている読者を思い出させます。これは、下流のアプリケーションでは、関連する考慮なることがあります。さらに、アポトーシス細胞死は、単一細胞にhPSCsの解離時の関心事です。したがって、ROCK阻害剤は、マイクロウェルで強制細胞凝集の間に存在していることを確実にするために重要です。最後に、分化の4日目に凝集体は十分に誘導2培地で再懸濁する前に、誘導1中に存在し、トレースアクチビンAを除去するために洗浄することが重要です。分化の4日後に、アクチビンAはメソを犠牲にして内胚葉分化を促進しますダーム誘導20。 この技術の主な用途は、効率的な心臓分化を促進集計サイズをスクリーニングすることです。しかし、現在の技術の限界の一つは、マイクロウェルプレートを使用して臨床的に関連するレベルまで心筋の生産をスケールするために挑戦していることです。心臓分化のスケールアップは、典型的には、撹拌懸濁バイオリアクター21内のバルク培養条件で行われます。マイクロシステムは、効率的な心臓の誘導のための凝集体の大きさの許容範囲を決定するために使用された後、そのため、スケールアップする次のステップは、所望の細胞の凝集体のサイズを生成することができるバイオリアクターインペラー速度を決定することです。 集合ベース心臓分化のための他の方法に対するこの技術の重要な違いの1つは、それが同様に凝集体における内因性シグナルの効果を調節するに直接調査を可能にすることです集計13でhPSCsと誘導性/抑制性の組織型の共培養。調査のこれらのタイプは、大規模な心臓の製造のプロセス開発を知らせることができます。

インビトロ細胞培養でモダリティの数で行うことができるが、典型的には二次元の接着条件またはより完全にインビボ系において要約三次元懸濁状態のいずれかで行われます。その結果、三次元組織構築物を生成するための強力な方法を開発するための研究の多くの分野における成長傾向があります。細胞型およびプロセスは支持細胞外マトリックス（ECM）表面との密着性の信号を必要とするシナリオでは、三次元培養は、細胞が上又はマトリックス1を支持する外因性で培養される足場構築物を介して有効にすることができます。支持マトリックスへの付着を必要としない細胞と処理は、主にまたは排他的に2,3（その後、独自の内因性行列を生成するために進むことができる）は、細胞の構成unscaffoldedシステムとして懸濁液中で実施することができます。ここでは、心臓分化oをするためのプロトコルを提示しますFヒト多能性幹細胞（hPSCs - 身体の任意の細胞型になることができる幹細胞、胚または他のソースからも）サイズ制御、均一、unscaffolded凝集体です。 懸濁凝集体としてhPSCsの分化は、ラン内および実行間の両方の凝集サイズの大きな変動に悩まされています。この変動は、細胞コロニーを機械的に分離することを含む一般的に、これらの凝集体を生成するために使用される方法の結果です。この変動性を低減するために、多くのアプローチは、凝集体あたりの細胞数、並びに凝集体直径及び均一性を制御するために使用されています。吊り5をドロップとしては、例えば、マイクロ遠心チューブ中の凝集体の形成4、または、微細は、その後、UまたはV底マルチウェルプレート7,8に懸濁液、または細胞の遠心分離に転送することができる2次元HPSCコロニー6を定義しました9。しかし、これらすべてのAPPRoachesは集計世代の彼らの低いスループットによって制限されています。まあベースのシステムでは、V底プレートシステムに同様のアプローチ、マイクロウェルのしかし小さいサイズを採用するだけでなく、単一の培養プレートから均一な凝集体の多数の生成を可能にする（このプロトコルで各400ミクロンの幅を有します）全体のV底プレート10から生成されるよりも（〜1200マイクロウェルを含む〜15.5ミリメートルの標準直径）。まあベースの凝集体形成は、外胚葉から11 hPSCsの分化、内胚葉12、中胚葉13および胚体外14運命を含む多くの設定で使用されてきました。間葉系幹細胞15からの軟骨形成;毒物学的スクリーニング16に対して均一な基質の生成;そして、メカノ17の調査。 HPSC由来cardiomの製造のための強固な製造プロトコルを開発する上での一つの大きな課題yocytesは、実行間の心臓分化効率の再現性の欠如となっています。我々は以前、この変動が自己複製hPSCsと内胚葉および神経分化6,18に関連した遺伝子を発現する分化する細胞の両方を含む開始HPSC集団に異質に帰することができることを実証しました。これらの分化する細胞によって分泌された信号は、心臓の誘導に影響を与えます。神経前駆細胞は、心臓の誘導を阻害しながら、具体的には、胚体外内胚葉は、心臓の誘導を促進します。 HPSC集約の際、集約分化中の細胞と未分化hPSCsは、骨材表面13上で開発胚体外胚葉細胞の層に囲まれているように整理します。凝集体サイズを制御することによって、我々は、未分化hPSCs（体積比表面積）に対する心臓誘導内胚葉細胞の比率を調節し、最大心臓誘導の13のために、この比を最適化することができます。

<table><tbody><tr><td>生物学的安全キャビネット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットエイド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット(5〜25 ml)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アスピレーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アスピレーターまたはパスツールピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mlおよび50mlコニカルチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒュームフード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro;mシリンジフィルター5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%CO2、5%O2、および湿度制御された細胞培養インキュベーター&nbsp;</td><td></td><td></td><td>低酸素(低酸素)インキュベーター</td></tr><tr><td>5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレートホルダーが取り付けられたスイングバケットローターを備えた低速遠心分離機&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2、P20、P200、P1000マイクロピペッターと関連ヒント&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4倍、10倍、20倍の位相対物レンズを備えた倒立顕微鏡&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超低アタッチメント(ULA)24ウェルプレート&nbsp;</td><td>Corning/Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量遠心チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>卓上型微量遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>滅菌超純蒸留水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 °C;C冷凍庫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>モノチオグリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>有毒;MTGの分注は、繰り返し開くことによる酸化を最小限に抑えるために強くお勧めします。アリコートは4°Cで保存できます。Cは最長3か月間、-20°C。長期保存にはCがおすすめです。</td></tr><tr><td>StemPro-34 ミディアム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10639-011</td><td>基礎心臓誘導培地;サプリメントは-20°Cで保存されます。Cと4°Cの基底培地。</td></tr><tr><td>トランスフェリン</td><td>ロシュ</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R&Dテクノロジー</td>ズ <td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&Dテクノロジー</td>ズ<td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R&Dテクノロジー</td>ズ<td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>アクティビンA</td><td>のR&D Technologies</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Reagents Direct</td><td>57-G89</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15561</td><td></td></tr><tr><td>塩酸&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>腐食性</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12660</td><td></td></tr><tr><td>100x ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>100x L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清交換</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12563</td><td>解離酵素</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 プレート</td><td>StemCell Technologies</td><td>27845</td><td>マイクロウェルプレート</td></tr><tr><td>Aggrewell リンス ソリューション</td><td>StemCell Technologies</td><td>7010</td><td>マイクロウェルリンス溶液</td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK阻害剤</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼII型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ハンクのバランスの取れた塩溶液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12483</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート (FACS染色用)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イントラプレップ透過化試薬</td><td>ベックマン・コールター</td><td>IM2389</td><td>キット 2つのパーツ付き: 固定液と透過化液;毒性</td></tr><tr><td>cTnT抗体</td><td>ネオマーカー&nbsp;</td><td>MS-295</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG APC抗体ThermoFisher</td><td>Molecular Probes</td><td>A865</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 丸底フローサイトメトリーチューブ</td><td>FACSマシン依存</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト多能性幹細胞の懸濁液ベースの心臓分化のためのマイクロウェル中の凝集体サイズの最適化

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）の心臓分化は、通常、浮遊細胞凝集体で行われます。 従来のhPSCの凝集体形成では、細胞コロニーをより小さな塊に解離させ、凝集のサイズ制御は、目的の凝集サイズが達成されるまで細胞懸濁液をピペッティングすることによって大まかに制御されます。 従来の凝集体を用いたhPSCの心臓分化の主な課題の1つは、培養の不均一性と空間的混乱が心筋細胞の収量にばらつきがあり、非効率であることです。 私たちと他の人々は以前に、ヒト胚性幹細胞(hESC)の凝集体サイズを調節して心臓誘導効率を最適化できることを報告しました。 私たちは、スケーラブルなマイクロウェルベースのアプローチを採用して、骨材形成の物理的パラメータ、特に骨材のサイズと形状を制御することで、この課題に対処しました。 ここで説明する方法は、定義されたhPSC数をマイクロウェルに強制的に凝集させ、その後、心臓導入を指示する条件でこれらの凝集体を培養することで構成されています。 このプロトコルは、使用するウェルのサイズと数に応じて容易にスケーリングできます。この方法により、心筋細胞の頻度が70%を超える培養アウトプットを一貫して達成することができます。

hPSCsのサイズ制御の凝集体を効果的にのみ細胞の濃度およびマイクロウェルの表面積に依存する、マイクロシステムを用いて形成することができます。短い遠心分離後、細胞（このプロトコルで千）の適切な番号が各マイクロウェル（ 図1A）にまとめられます。重要なことは、これらの細胞は、24時間以内に細胞内の接続を再確立し、もはや十分に埋めるべきではありませんが、滑らかなエッジ（ 図1B）とコンパクトな集合体として表示されます。これらの凝集体は、心臓の運命に向かってさらなる分化のための出発材料を提供します。細胞が密なクラスターを形成しない場合、これは、解離および再凝集次可能細胞死を示唆し、そして特定の細胞株のための単一細胞継代及びROCK阻害剤濃度の適合性を検討すべきです。マイクロウェルの次の3日間は、集計モルフォはほとんど変化を示していますでれっと、いくつかの成長は明らかですが。マイクロウェルから除去した場合、凝集体は、そのラウンド、密集した形態を維持し、互いに（ 図1C）と同様のサイズのものでなければなりません。 ULA 24ウェルプレートでの培養は、細胞増殖及び成長を可能にします。 8日目では、最初のアクチビンシグナリング、およびWnt阻害に暴露した後、凝集体は大きく、明るく、凝集体（ 図1D）として表示されるようになります。この期間中、かなりの細胞破片は、各ウェルの底に明らかであろうし、凝集体がメディアを削除する前に解決することを可能にすることによって除去されなければなりません。時折、多くの凝集体が互いに融合します。これらの「スーパー凝集体は「小さい凝集体および完全な分化を受ける可能性は低いと見られる形態学的変化を示さない傾向があるが、これは、十分に他の凝集体の分化を阻害しません。 大型化と組織化繊維状の領域の外観を持つ集合体に顕著な形態学的変化に= &quot;1&quot;&gt;続き分化結果-together.withinページを保つ：FO」jove_content」。日12で、収縮凝集を観察することができます。これらは常に大きな透明の細胞で構成され、多くの場合、骨材（ 図2）の外側に広範囲の細胞外マトリックスを含むことになります。集合全体の収縮が成功した分化を示し、一方、心臓マーカーの発現はまた、収縮していないようで凝集体で観察することができます。凝集体および免疫標識の解離に続いて、細胞の大部分は、フローサイトメトリーによる心筋マーカーのcTnT（ 図3）について陽性となります。このマーカーの発現は、細胞中で安定しておりとして後期分化の19日目のように、凝集体において観察されてもよいです。 1.JPG &quot;/&gt; 図1：HPSCのタイムラインは、心臓の運命に向かって分化した直後に集約した後、細胞はほぼ各マイクロウェル（A）を満たします。 1日後、凝集体が凝縮表示され、（B）を滑らかに。この形態は、凝集体がマイクロウェルから除去し、ウェルプレート（C）に播種した場合でも持続します。 8日目では、凝集体が拡大し始め、色（D）で明るく見えます。スケールバー：250μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig1large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig2.jpg" /> 図2：凝集体は、トップパネル（強制的な集合体全体の収縮が観察された、心臓誘導ステージ3培地中で6日後に分化の12日目により締約開始 ：リラックスエーション、中央のパネル：収縮）。下のパネルは、黒または白（矢じり）として表示される最も重要な違いは、上部と中央のパネルを引いから誘導されます。スケールバー：250μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig3.jpg" /> 図3：17日目差別hPSCsにおける心筋トロポニンTのための免疫標識 、細胞のほとんどは、フローサイトメトリー（充填されたヒストグラム）によって心筋トロポニンT陽性です。また、二次抗体単独（塗りつぶされていないヒストグラム）で染色した細胞が示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ヒト多能性のサスペンション集計ベースの心臓分化を開始する従来の方法は、細胞（hPSCs）は凝集体の大きさや形状に関して培養異質で悩まされている茎。ここでは、サイズ制御HPSCは心臓の促進条件下で培養された凝集体を生成するためにマイクロウェルを用いた心臓分化のための堅牢な方法を説明します。

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

まず、ヒト多能性幹細胞（HPSC）の単一細胞懸濁液を200 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、洗浄用培地を吸引し、細胞を1.2 × 10⁶ cells/mLの密度で凝集培地に再懸濁します。次に、準備したマイクロウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を1 mLずつ播種し、細胞を均一に分散させます。多数のウェルに播種する場合、細胞の沈降を防ぐため、細胞懸濁液を定期的にボルテックスします。播種後、プレートを 200 ×g で5分間遠心分離します。遠心後、顕微鏡下でプレートを観察し、各マイクロウェルの底に細胞が集まっていることを確認します。次に、プレートを5% CO₂、5% O₂の低酸素インキュベーター内で37°Cで24時間インキュベートします。凝集から1日後、顕微鏡下で凝集体を確認します。遠心直後の凝集状態と比較して、凝集体は滑らかなエッジを持ち、完全な形態を維持しているはずです。マイクロウェルプレートを水平に保持し、P-1000 マイクロピペットのチップを培養液の表面およびウェルの端に当てて、上清を除去します。次に、マイクロウェルの底にある凝集体を乱さないように注意しながら、ゆっくりと培地を除去します。培地レベルがテクスチャ加工されたマイクロウェル表面から約 1〜2 mm にまで下がったら、プレートをゆっくりと傾け、ウェルに残っている培地をゆっくりと吸引します。ピペットチップをウェルの内端に当て、ウェルの内壁に沿って非常にゆっくりと、調製直後の予熱済みステージ1誘導培地を1 mL添加します。プレートを低酸素状態のインキュベーターに戻し、3日間培養します。4日目に、5 mL セロロジカルピペットを用いて、マイクロウェルプレートの各ウェルから凝集塊を回収します。最大10ウェル分の凝集塊懸濁液を15 mLのコニカルチューブに回収します。低酸素インキュベーター内で15分間静置し、凝集塊を沈殿させます。凝集塊が沈殿した後、上清を慎重に吸引し、あらかじめ加温した10 mLの洗浄用培地で凝集塊を再懸濁して、残留している誘導性サイトカインを除去します。凝集塊を 50 ×g で 2 分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、ペレット化した凝集塊をあらかじめ温めておいたステージ2誘導培地で再懸濁します。凝集塊懸濁液を、1ウェルあたり 1 mL ずつ、24ウェルの超低接着プレートに移します。凝集塊を顕微鏡下で観察し、均一で密な細胞クラスターであることを確認します。6日目まで低酸素条件下で培養します。6日目に、前述と同様に、15 mLコニカルチューブあたり最大10 mLの凝集塊を回収します。凝集塊が沈殿した後、上清を吸引し、あらかじめ加温したステージ3誘導培地で凝集塊を再懸濁します。5 mLのセロロジカルピペットを用いて、凝集塊を24ウェル超低接着プレートに1ウェルあたり1 mLずつ分配します。培養10日目に、培地を完全に交換します。12日目に、残りの培養期間のため、細胞を20%酸素および5%二酸化炭素の常酸素培養条件下に移します。分化開始から12日後（心筋誘導ステージ3培地での培養6日後に相当）に、凝集塊全体にわたる強力な収縮が観察されました。17日目のフローサイトメトリーの結果、ヒストグラムの塗りつぶされた部分で示されるように、細胞の74.8%が心筋トロポニンT陽性でした。また、二次抗体のみで染色した細胞も示されており、ヒストグラムの塗りつぶされていない部分で表されています。この手順を行う際は、4日目に凝集塊を十分に洗浄し、微量のサイトカイン、特に心臓への誘導を妨げ内胚葉への分化を促進するactivin-Aを除去することが重要です。この手順の後には、凝集塊内の誘導細胞種の低温培養などの他の手法を実施することで、隣接する胚組織からのパラクリンシグナルがヒト多能性幹細胞の心系譜への分化にどのように影響するかといった、別の問いに対する検証を行うことができます。

aggregate-size-optimization-microwells-for-suspension-based-cardiac

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は差別化した別個の組織パターンに自己組織化するための固有の能力を持っています。これは、空間的な環境勾配の提示を必要とするが。我々はHPSC分化パターンを制御するための生化学的および機械的な勾配を生成するためのシンプルかつ堅牢な方法としてステンシル微細を提示します。...

分化運命の空間組織を探るためのヒト多能性幹細胞のステンシルマイクロパターニング

ここでは、高効率のシングルセルの単離と長期のクローン培養を可能にする新しいマイクロウェル設計コンセプトを利用したマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を分離および培養するためのプロトコルを紹介します。...

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

ここでは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)のための堅牢で高速かつスケーラブルな心筋細胞分化プロトコルを紹介します。この大規模な方法を使用して得られた心筋細胞は、ヒト心血管疾患のモデリング、ハイスループット薬物スクリーニング、および潜在的に臨床応用において効果的に使用するのに十分な細胞数を提供できます。...

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞の制御されたサイズ凝集体を産生し、単一使用バイオリアクターを使用して化学的に定義されたフィーダーフリー条件下で小脳オルガノイドの分化をさらに刺激する動的培養システムを記述する。...

ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

ここでは、分化前のヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、および内皮細胞からなる3D自己組織化心臓ミクロ組織アレイを生成するための使いやすい方法論について説明する。心臓ミクロ組織を生成するためにこのユーザーフレンドリーで低細胞を必要とする技術は、疾患モデリングおよび医薬品開発の初期段階に実装することができる。...

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

ここでは、高速モジュラーフォトメトリーシステムを用いた誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの作用電位の光学的獲得および特性評価について述べている。...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

このプロトコルの目的は、生体整血、コラーゲンベースのヒドロゲル、心臓組織工学、薬物スクリーニング、および疾患モデリングにおける応用のために、心臓線維芽細胞(CF)と共培養された幹細胞由来心筋細胞で構成される、高度に整列したヒト心臓組織の三次元(3D)微小流体モデルの開発を説明し、実証することである。...

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

ここでは、ハイスループットの多次元フォーマットで培養されたヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの心臓スフェロイド(CS)の生成と凍結保存のための一連のプロトコルを紹介します。この3次元モデルは、疾患モデリング、ハイスループットスクリーニングのための堅牢なプラットフォームとして機能し、凍結保存後もその機能を維持します。...

ヒト誘起多能性幹細胞由来心臓スフェロイドの作製、ハイスループットスクリーニング、バイオバンキング

オルガノイドは、疾患モデリングのための貴重なツールとなっています。細胞外マトリックス(ECM)は、オルガノイド生成中の細胞運命を導き、天然組織に似たシステムを使用することで、モデルの精度を向上させることができます。この研究では、動物由来のECMとゼノフリーのハイドロゲルにおける人工多能性幹細胞由来ヒト腸オルガノイドの生成を比較しています。...

ヒト幹細胞維持と腸管オルガノイド生成のための基底膜マトリックスの比較研究

このプロトコールは、ヒト多能性幹細胞を使用して血管オルガノイドを生成する方法を示します。...

ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製

学ぶマイクロウェルを用いたヒト多能性幹細胞のサイズ制御凝集体形成法。遠心分離と低酸素培養で心筋分化の均一性を向上させ、心臓トロポニンT発現と収縮活性を確認する技術を習得できます。

ヒト多能性幹細胞の懸濁液ベースの心臓分化のためのマイクロウェル中の凝集体サイズの最適化

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