Name: マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶマウス脾臓からの樹状細胞サブセット単離法。Flt-3リガンドによるin vivo増殖と磁気ビーズ分離を用いて、プラスマサイト样DC、CD8α⁺DC、CD8α⁻DCを高純度に分離する技術です。免疫学研究に有用です。

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研究はアインシュタインがんセンター（NIH / NCI CA013330）とエイズ研究センター（NIH / NIAID AI51519）でサポートされているFACSコア設備を用いて実施したサイトメトリーこの作品は、SAPの流れにNIH / NIAIDの助成金AI45889によってサポートされていました。

動物実験は、制度的動物飼育と使用委員会（IACUC）から承認されたガイドラインに従って行われています。無菌性を必要とするすべての手順は、生物学的安全キャビネットの中で行われています。 マウスにおけるB16.Flt3L黒色腫の1移植<ol><li>培養物を37℃で10％CO 2で、完全DMEM培地中0.5×10 6細胞/ mlの密度でT25組織培養フラスコ中でFLT-3を発現するB16黒色腫細胞株。細胞は〜90％コンフルエンス（〜20時間）に到達するまでに成長。 </li><li>トリプシン消化することによって細胞を採取します。吸引し、細胞培養培地およびPBSで付着細胞を洗浄します。 0.05％トリプシンの5 mlを加え、37℃で5分間インキュベートします。プロテアーゼ消化をクエンチ冷20 mlのを完全DMEM培地ウシ胎児血清（FCS）を含有する（4℃）を加えます。軽く優しく上下にピペッティングし、続いてタップすることで細胞を持ち上げ。 </li><li> 300での遠心分離により細胞を回収4℃で10分間XG。血球計数器または自動化された細胞生存率カウンターを用いて細胞を数えます。 PBS中の10 8細胞/ mlの密度に再懸濁します。 </li><li> 100μlの細胞懸濁液（10 7細胞）で首の基部にMachholz ら 19によって記載されるように、皮下注射により腫瘍細胞と移植したマウス（C57BL / 6または他の組織適合性株）。 </li><li>臓器を採取するために動物を犠牲にする前に（12日 - - 直径10ミリメートル、通常7 2）腫瘍が触知可能または可視になるまで成長することを可能にします。 </li></ol>腫瘍を有するマウスからの脾臓単一細胞懸濁液の調製<ol><li>イソフルランの過剰摂取（&gt; 5％のイソフルランの流量を調整し、停止を呼吸した後、露光、少なくとも2分を続ける）でマウスを麻酔。安楽死のための制度ガイドラインに従って、頚椎脱臼によりFLT-3黒色腫腫瘍を有するマウスを生け贄に捧げます。 </li><li>ディ滅菌はさみ20の助けを借りて、無菌技術を使用して、70％エタノールと収穫脾臓で皮膚sinfect。 </li><li>バイオセーフティキャビネットへの輸送のための滅菌ペトリ皿に脾臓を置きます。無菌条件下で、ここからすべての手順を実行します。 </li><li>新鮮なペトリ皿に脾臓を移し、RPMI培地で洗浄します。メスを用いて、小さな（〜0.2センチメートル2）個に脾臓をカット。コラゲナーゼ/ DNase溶液10mlで37℃にて30分間インキュベートします。 </li><li> 70μmのセルストレーナーに脾臓組織の部分的に消化されたサスペンションを注ぎます。 5ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、ストレーナのメッシュを通して残りの組織片を圧縮します。 </li><li>新鮮な培地10mlのメッシュフィルターを洗浄し、フィルターを廃棄します。細胞をペレット化するために4℃で10分間300×gで懸濁液を遠心。 </li><li>上清を吸引し、RBC溶解緩衝液2ml中に細胞ペレットを再懸濁します。 RT fでインキュベートまたは10分。完全RPMI培地10mlを加えることによってRBC溶解緩衝液をクエンチしました。 </li><li> 4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。適切な体積の再懸濁は、Fcブロック抗体（2.4G2）20μg/ mlを含む細胞選別緩衝液（ 例えば、MACS）に10 8細胞/ mlの細胞密度を達成します。 </li></ol>脾臓単一細胞懸濁液からの形質のDC、CD8α 順位 DCおよびCD8αNegの DCの3精製注： 図1に示すように単一細胞懸濁液からの脾臓DCサブセットの単離は、多段階の手順ですべての予め冷却した緩衝液を用いてステップ4の温度を維持するために氷水浴実行- 8°Cを。プロトコルの次のセクション内のすべての試薬 ​​容量）が10 8細胞/ mlで脾臓細胞懸濁液200μlの初期入力するために計算されます。これは、スケールアップすることができますかダウン最初のステップ（3.1.1及び3.2.1）に比例して細胞懸濁液の体積（常に1×10 8細胞/ mlの濃度で）および他の試薬 ​​を変更することにより、ニーズに基づきます。それに応じて、すべての後のステップで試薬容量を調整します。 1×10 8 / mlの脾臓細胞懸濁液の100μlで始まる場合、たとえば、すべてのステップで半分に述べた試薬容量を使用します。 <ol><li> 形質DCの単離（PDC） <ol><li>脾臓細胞懸濁液の200μlに形質DCアイソレーションキットで提供ビオチン標識抗体カクテルを300μlを追加します。 </li><li>十分に混合し、15分間、氷水浴中でインキュベートします。浮遊細胞を維持するために、および抗体結合を最大化するためにチューブを3分毎にをタップします。 </li><li>バッファを選別12 mlのCellを加え、4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。未結合ビオチン化抗体を除去するために上清を吸引。 </li><li>細胞を再懸濁し細胞選別緩衝液500μlにペレット。抗ビオチン抗体結合ビーズを300μlを追加します。繰り返しステップ3.1.2と3.1.3。 </li><li>上清を捨て、細胞選別の緩衝液2ミリリットルに細胞ペレットを再懸濁します。 RTで予備冷却されたバッファを使用して、この時点から、すべての手順を実行します。 </li><li>磁気スタンドにLSカラムをソートする新鮮な磁気活性化細胞を置きます。バッファを細胞選別5mlでカラムを洗浄し、平衡化します。 </li><li>カラムベッドの表面の中央に静かにそれを適用し、カラムに細胞懸濁液をピペットで。フロースルーを収集します。 </li><li>セルソーティング緩衝液10mlでカラムを洗浄します。この流れを収集し、ステップ3.1.7からのフロースルーと結合。 pDCには（FT1）を介して、このカラム流量に富んでいます。 </li><li> 4°C、2ミリリットルのセルソーティングバッファで再懸濁で5分間、300×gで遠心分離することによってFT1から細胞をペレット化し、新鮮なLSカラムに通して細胞を渡します3.1.8 - 、手順3.1.6を繰り返すこと。 2つの連続する列の使用は、単離された細胞の強化された純度をもたらします。 </li><li>ペレットを4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞、および2ミリリットルの完全RPMIで再懸濁します。必要になるまで氷上に置きます。 </li></ol></li><li> CD8αPOSおよびCD8αNegの樹状細胞の単離 注：この手順の最初のステップは、B、pDCに、TおよびNK細胞の枯渇です。 <ol><li>全脾臓細胞懸濁液（ステップ2.8で得られた10 8細胞/ mlの1ミリリットル）で開始し、CD8α 順位 DCアイソレーションキットで提供ビオチン結合抗体カクテルの100μlを添加します。 </li><li>よく混ぜ、15分間、氷水浴中でインキュベートします。それらの標的細胞へのビオチン標識抗体の結合を最大化するために、穏やかに3分毎にチューブをタップします。 </li><li>バッファソートを12mlセルを追加し、4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。吸引し、スーパー未結合ビオチン化抗体を除去するための浮遊性の。 </li><li>セルソーティング緩衝液150μlとCD8α 順位 DC分離キットで提供される抗ビオチンビーズを100μlを加えます。よく混ぜ、15分間、氷水浴中でインキュベートします。 </li><li>バッファソート10mLの細胞を加え、4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。 </li><li>再懸濁し、1ミリリットルセルソーティングバッファ内のセルとステップ3.1.8を介して3.1.6の手順に従って、新鮮なLSカラム上を通過。 </li><li> 2（FT2）を介して、非標識の流れを収集し、カラムの保持物を捨てます。この標識されていない画分はCD8αPOSおよびCD8αNegの DCに濃縮されています。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで遠心分離することによってFT2で細胞をペレット化。 </li><li> 1ミリリットルセルソーティングバッファ内の細胞を再懸濁し、CD8α 順位 DC分離キットで提供される抗CD8α共役磁気ビーズを200μlを追加します。 </li><li>代表ステップ3.2.6を介して3.2.2を食べます。カラムのフロースルーはCD8αNegの樹状細胞について濃縮し、CD8α 順位のDCのために枯渇しています。これは、3（FT3）を通る流れをラベル付けされています。 </li><li> CD8α 順位 DCはカラムに保持溶出するために、磁石から列を削除し、セルソーティング緩衝液5mlを追加し、LSカラムを備えたプランジャーを使用して、列の行列をパージします。 </li><li> 4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。 1ミリリットルセルソーティングバッファ内の上清を吸引および再懸濁。純度を高めるために、手順を繰り返して、新鮮なLSカラムに通して再び溶出細胞を実行すると、フロースルーを廃棄し、3.2.11のように保持された細胞を収集除いて、3.1.8に3.1.6。 </li><li> FT3懸濁液からCD8αNegの DCを精製するために、4℃で5分間、300×gの遠心分離によってFT3をペレット化し、細胞選別緩衝液300μlで再懸濁。 </li><li>抗CD11cのMAGの100μLを加えます磁ビーズ。よく混ぜ、15分間、氷水浴中でインキュベートします。 </li><li> 4℃で5分間、300×gでの遠心分離によってバッファー、ペレット細胞を選別10mLの細胞を加えます。 </li><li>繰り返しは、3.1.8を介して3.1.5を繰り返します。 CD8αNegの DCは積極たCD11cビーズで選択され、カラムに結合されています。フロースルーを廃棄することができます。 </li><li>ステップ3.2.11で説明したように精製されたCD8αNegの DCを収集するために、カラムに保持された細胞を溶出させます。 </li></ol></li></ol>抗原およびセル転送4.パルシングのAPC <ol><li>生細胞と死細胞を区別するためにトリパンブルー排除21を使用して精製した後、生細胞を数えます。 </li><li>選択した抗原で細胞をインキュベートします。 100 nMの濃度13でアルファガラクトシルセラミド（αGalCerの）と呼ばれる糖脂質抗原の類似体を使用してください。一般的に、プレート10 6生細胞/ウェルの完全RPMI培地中の超低ATTACを使用して、hment U底96ウェルプレートは、細胞接着を最小限にします。 4時間- 1、37℃で5％CO 2雰囲気中で細胞をインキュベートします。 </li><li>静かに数回ピペッティングすることにより細胞を回収します。剪断力から細胞の損傷を最小限に抑えるために広い口径のピペットチップを使用してください。 PBSでウェルを洗浄し、細胞の収穫を最大化するために、これらの洗浄をプール。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで細胞をペレット化し、PBS中で所望の濃度に再懸濁します。一般的に、レシピエント動物あたり200μlの100万個の細胞を注入します。宿主動物への投与前に生存能力を最大化するために、細胞を氷上に保管してください。 </li><li>マウスに静脈内のいずれかの側尾無駄や眼窩後静脈叢19を介して細胞を注入します。 1mlシリンジに27 G針を使用し、マウス当たり0.1ミリリットルの最大容量を注入します。 </li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

樹状細胞は、T細胞応答のプライミングに関与する細胞を提示する主要なプロフェッショナル抗原であることが受け入れられています。彼らの主な機能は、T細胞に提示するための抗原を取り込み、処理することにより、組織微小環境を調査することです。特定のDCサブセットの機能を研究するために、これらは、それらの正常な表現型および機能を維持する方法を使用して、十分な数の単離する必要があります。ほとんどのプロトコルはナイーブマウスからの特定のDCサブセットの分離に依存しています。これらの細胞は稀であるので、単離手順は効率的ではない、細胞の低い数字が得られます。転送の研究で行われ、ほとんどの実験は動物あたり細胞の少なくともこの番号を使用しながら、100万CD8 posのDCを -例えば、1脾臓は約0.5が得られます。したがって、既存の方法の主な制限は、ドナーマウスの極めて多数の実質的なボリュームを使用することなく、十分な細胞数を単離することができないことです試薬の。我々の方法は、実質的に大幅に免疫精製工程の一連を使用して、3つのよく認識DCサブセットの非常に大きい数の精製を可能にする、DCを拡大するのFlt-3Lを分泌...

「大きな星状（ギリシャデンドロン ）細胞」は、リンパ系器官1に見られるような樹状細胞（DC）は、ほぼ40年前に発見されました。多くの研究は、DCが効果的にナイーブT細胞2を刺激することができる唯一の抗原提示細胞であることを示しています。これらの細胞の主要な機能は、抗原提示分子への取り込みおよび抗原の提示とその効率的な処理およびこれらのロードをです。マウスの脾臓において、DCは、形質従来のサブセットに分離することができます。形質DCはCD11cの低い発現とB220とのGr-1の高レベルによって特徴付けられます。彼らはまた、表面マーカーmPDCA1に対して陽性であると私は受容体9（TLR9）リガンドなどの通行料に応じて型インターフェロンを分泌します。従来のDCはCD11cのとMHCクラスII発現のために高いです。彼らはそのようなCD4、CD8α、DEC205、CDなどの表現型マーカーの表面発現に基づいて、三つの異なるサブセットに分割することができます11b及び（33D1抗体によって認識DCIR2、）樹状細胞阻害受容体2タンパク質3,4。 CD8α 順位のDCも、CDC1として知られているDEC205に陽性であるが、このようなCD11bおよび33D1などの骨髄性マーカーについて陰性です。また、CDC2呼ばCD8αNegの DCは、33D1、CD11bおよびCD4陽性であるが、DEC205を欠いています。ダブルネガティブサブセット（CD4およびCD8αの両方のための、すなわち 、負）は、比較的まれで、DEC205および33D1のために負です。これは、少なくとも特徴づけられたサブセットであり、CD8αNegの DCのあまり分化の形態であってもよいです。 様々なDCサブセットにおける表現型の違いはまた、in vivoでの機能を拡張します。 CD8αNegの DCは、高い食作用であり、主にCD4 T細胞3にMHCクラスIIを介して外因性抗原を提示すると考えられています。対照的に、CD8α 順位 DCは、MHCクラスIの可溶性タンパク質抗原の提示のために特化されメカニズムに交差提示と呼ばれます。交差提示の結果は、これらのDC 5の活性化状態に依存し、細胞傷害性T細胞（CTL）または制御性T細胞を6 2,7の開発の拡大につながることができます。感染アポトーシス細胞由来抗原の提示は、強力なCTL応答9を誘導するのに対し、主としてT細胞8の削 ​​除に抗DEC205抗体媒介送達の結果を用いて、CD8α 順位 DCに抗原の標的。 ペプチド抗原の認識に加えて、哺乳動物の免疫系は、脂質と糖脂質抗原を認識するように進化してきました。これらの抗原は、種々の哺乳動物における関連する複数の形で存在するMHCクラスI様細胞表面タンパク質であるCD1分子によって提示されます。マウスでは、CD1dのと呼ばれる高度に保存されたCD1分子の単一型は、糖脂質抗原10のプレゼンテーションを担当しています。メジャーな<html> CD1d /脂質複合体を認識するT細胞の集団は、インバリアントNKT細胞（iNKT細胞）と呼ばれます。これらの細胞は、多様11が制限されているTCRβ鎖と対になっている不変のTCRα鎖からなる半不変T細胞受容体（TCR）を発現します。増殖し、活性化されたエフェクターT細胞になるように分化する必要があり、従来のT細胞とは異なり、iNKT細胞は、エフェクター集団として存在し、糖脂質、投与12後に迅速に対応を開始します。生理学的に関連する脂質抗原提示細胞の同定は、研究の活発な領域であり、例えば、B細胞、マクロファージ及び樹状細胞などのいくつかの異なる細胞型は、この機能を実行するために提案されています。しかし、DCのCD8α 順位サブセットマウスiNKT細胞13およびCD8 T細胞の14の糖脂質媒介性クロスプライミングの取り込みおよび脂質抗原の提示を媒介する主要な細胞であることが実証されました。 別抗原提示細胞による抗原提示の効率を比較するためにove_content &quot;&gt;、直接的なアプローチは、ナイーブな宿主に抗原の等量でパルス精製APCの異なる種類を転送することである。このタイプの細胞移入実験は、多くの場合、免疫学的研究のために行われます。これらの細胞は、それらが全細胞15の2％未満を構成しているリンパ器官のような稀な集団が存在しかし、 エクスビボ抗原処理されたDCと転写研究を行うことは、困難である。ドナー動物におけるこれらの細胞の発達を強化することが必要です分離プロトコルの効率を増加させます。 それは、共通のpDC、CD8 POSおよびCD8 Negの DCサブセットの生成に必要とされるリンパ系および骨髄系共通前駆細胞、明示FMS関連受容体チロシンキナーゼ3（FLT-3）ことが知られています。 in vivoでのFlt-3リガンド（FLT-3L）投与、emigrat時に骨髄からのFlt-3を発現する前駆細胞のイオンは、末梢リンパ器官の増加播種およびそれらの成熟DCの子孫16の膨張を生じ、増加されます。 FLT-3の発現はB、TまたはNK細胞の分化経路へのコミットメントの間に失われます。したがって、最小限の変更は、FLT-3Lの投与の際に、これらの細胞で観察されます。 DC集団において同様の拡大はFLT-3L 17,18の持続的な全身レベルを提供するための簡単で経済的な方法を提供するマウスのFlt-3Lを、分泌B16メラノーマ細胞株の注入によって生成された腫瘍を有するマウスで観察されます。このアプローチを使用して、我々は大幅その後の実験のために単離することができ、これらの細胞の収量を増加させる、マウス脾臓中のすべての通常のDCサブセットの拡大を刺激するのFlt-3Lを分泌B16黒色腫細胞の移植に基づくプロトコルを開発しました。 14日間皮下イムを次の - 私たちは常に10内にいることを見つけます総脾臓細胞の60％ - FLT-3分泌腫瘍のプランテーションは、マウス40を構成するDCの著しい富化と脾腫発症します。これらの脾臓から、異なるDCサブセットは、サブセット特異的な表現型マーカーを用いる標準的な市販の細胞精製キットを用いて高純度で単離することができます。

<table><tbody><tr><td>0.05%トリプシン-EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>CDS019936-250MG</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ D&nbsp;</td><td>ロシュ・ダイアグノスティック</td>ス <td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (乾燥粉末)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>200プルーフエタノール&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>9-6705-004-220</td><td>70%エタノール</td></tr><tr><td>RBC溶解</td><td>バッファーSigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640培地とL-グルタミンの調製に使用&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン含有DMEM培地&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-グルタミン&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必須アミノ酸&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MEM 必須アミノ酸&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>11130-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 溶液&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー(乾燥粉末)&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T6146-5G&nbsp;</td><td>PBSで0.08%を調製</td></tr><tr><td>形質細胞様樹状細胞単離キット II, mouse</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD11c&nbsp;</td><td>ミルテニバイオテック</td><td>130-152-001</td><td></td></tr><tr><td>CD8&alpha;PosマウスDCアイソレーションキット&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-169</td><td></td></tr><tr><td>Fc-γ受容体遮断抗体(クローン2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c-FITC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553801</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD8&alpha;-PerCP&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>553036</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスB220-PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553090</td><td></td></tr><tr><td>1 mlシリンジ&nbsp;</td><td>BD</td><td>26048</td><td></td></tr><tr><td>23 G1針&nbsp;</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>100mmシャーレ&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>手術用器具&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>細胞ストレーナー(70 & micro;m)</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>大型ペトリプレート&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>真空ろ過システム(500 ml (0.22 & micro;m))コー</td><td>ニング431097</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSカラム&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>磁気スタンドMACSセパレーター&nbsp;</td><td>ミルテニーバイオテック</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>ワイドボア200&mu;l ピペットのヒント&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>111623</td><td></td></tr><tr><td>Corning 超低アタッチメント 96 ウェルプレート&nbsp;</td><td>Corning</td><td>CLS3474-24EA</td><td></td></tr><tr><td>6-8週齢の雌C57BL/6マウス&nbsp;</td><td>Jackson Research Laboratories, Jax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murine B16.Flt3L melanoma cell line</td><td></td><td></td><td>described by Mach et al., 2000</td></tr><tr><td>Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10&nbsp;mM) 5 ml HEPES バッファー (1 M) 5 ml L-グルタミン (200&nbsp;mM) 0.5 ml 2-メルカプトエタノール (5.5 x 10-2 M)</td><td></td><td></td><td>バイオセーフティキャビネット内のすべての成分を、必要に応じてDMEMまたはRPMI培地と混合します。フィルターは、0.22&microを通過して培地を滅菌します。M真空ろ過システム。</td></tr><tr><td><ストロング>コンプリートRPMIおよびDMEM培地</ストロング></td><td></td><td></td><td>50mlの熱不活化ウシ胎児用血清を無血清RPMIまたはDMEM培地に加え、完全な培地を得ます。</td></tr><tr><td>MACS緩衝液</td><td></td><td></td>2 <td>mLの0.5 M EDTAと10 mLの熱不活化ウシ胎児血清を500 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、Ca2+およびMg2+遊離、pH 7.2)および2&nbsp;&マイクロ;g/ml 2.4G2 (Fc-Block抗体)。</td></tr><tr><td>FACS染色バッファー</td><td></td><td></td><td>アジ化ナトリウムをMACSバッファーに0.05%(500 mLあたり0.25 g)に溶解して、FACS染色バッファー</td></tr><tr><td>10x Collagenase DおよびDNase 1ストック溶液 を得ます
Ca2+およびMg2+を含むPBS20 mlにコラゲナーゼD1 gとDNase 1ストック0.2 mL(1 mg/mL、100x)を溶解し1 mLあたり約1,000-2,000 Unitのコラゲナーゼ活性の溶液を得ます。</td><td></td><td></td><td>この10倍ストック溶液は、事前に調製し、-20°Cで保存することができます。数週間C。使用直前に、このうち1mlを9mlの無血清RPMIで希釈してください。</td></tr></tbody></table>

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

樹状細胞（DC）は、取得処理と、T細胞媒介性免疫を開始するための分子を抗原提示細胞に抗原を提示するために主に関与プロフェッショナル抗原提示細胞です。樹状細胞は、いくつかの表現型および機能的異種のサブセットに分離することができます。脾臓樹状細胞の三つの重要なサブセットは、CD8αPOSおよびCD8αNegの細胞形質です。形質のDCは、型の天然の生産Iインターフェロンと抗ウイルスT細胞免疫のために重要です。 CD8αNegの DCサブセットは、MHCクラスII抗原提示に特化されており、中央にCD4 T細胞のプライミングに関与しています。 CD8α 順位 DCは、外因性抗原とCD8 T細胞プライミングの交差提示を主に担います。 CD8α 順位 DCは、特殊なTセルへのCD1d分子による糖脂質抗原の提示で最も効率的であることが実証されています不変ナチュラルキラーT（iNKT細胞）細胞として知られているリットル人口。 FLT-3リガンドの投与は、最終的にマウスモデルにおける末梢リンパ器官における樹状細胞の増殖を生じる、骨髄由来の樹状細胞前駆体の遊走の頻度を増加させます。我々は、異なるDCサブセットのインビボでの能力を比較するため、細胞移入実験において使用するための機能的樹状細胞を大量に精製するために、このモデルを適応しています。

この手順の結果は、移植された黒色腫細胞によって発現されるマウスのFlt-3LによるDCサブセットの拡大に​​依存しています。 B16.Flt3L腫瘍は、C57BL / 6マウス由来し、拒絶反応のために設立さになるように、腫瘍の失敗を避けるために、その株のバックグラウンドを持つ動物に移植する必要があります。場合によっては、関心のある経路または受容体シグナル伝達の既知の欠陥を有するDCを導出するために遺伝的に改変されたマウスを使用することが望ましいです。腫瘍は、そのような動物では異なる反応速度で発症することが心に留めておくことは重要であるので、接種部位での外観と触診に基づいて腫瘍の成長を監視することが重要です。腫瘍が触診可能になると我々の経験では、マウスを保有B16.Flt3L腫瘍は一貫して、すべてのDCサブセット（ 図2A）の拡大と相関脾臓細胞充実性の顕著な増加を示しました。当社は通常、2〜3倍のincreasを参照してください。ナイーブ動物と比較しB16.Flt3Lメラノーマを有するマウスから得た全脾細胞の数の電子。 B細胞の絶対数の変化...

明確な樹状細胞サブセットは、リンパ器官に稀な集団として存在するため、免疫学的実験に十分な数と純度で単離することが困難です。ここでは、マウス脾臓樹状細胞の現在知られている主要なサブセットをすべて単離するための高効率、高収率の方法について説明します。

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

このプロトコルの全体的な目標は、樹状細胞またはDCを生成するための高効率、高収率の方法を開発することです。これは、樹状細胞またはDCの生体内表現型および機能的分岐を運命的に反映します。樹状細胞は、リンパ器官に大きな集団として存在します。したがって、フィルターリガンドを使用して、ドナー組織中のこれらの必須細胞の頻度を増やし、その分離を促進します。この手法の主な利点は、市販の薬剤のみを使用した分析に適した数のすべてのDCサブセットの生成を排除できることです。90%コンフルエント培養物からB16メラノーマ細胞を発現するflt-3リガンドを採取するには、まず細胞をPBSで洗浄し、05%トリプシンと37°Cで培養物をインキュベートします。5分後、20ミリリットルの4°C完全dima培地でプロテアーゼ活性を急冷し、軽くタッピングして穏やかなピペッティングで接着細胞モデル層を剥離します。遠心分離により細胞を採取し、カウントします。次いで、単一細胞懸濁液をPBS中の8細胞/ミリリットル濃度の1倍に再懸濁し、C57黒色6レシピエントマウスへの皮下注射を行う。腫瘍の直径が2〜10ミリリットルに達したら、腫瘍担持動物から脾臓を採取し、脾臓を新鮮なRPMI培地が入ったシャーレに入れます。メスを使用して、組織を0.2平方センチメートルの小片に切断し、次に断片を10ミリリットルのコラゲナーゼとDnaseで摂氏37度でインキュベートします。30分後、部分的に消化された組織スラリーを70ミクロンの細胞ストレーナーに注ぎ、5ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、残りの組織断片をストレーナーのメッシュに押し込みます。10ミリリットルの新鮮な培地でフィルターをすすぎ、洗浄液を残りの単一細胞懸濁液とプールし、細胞をペレット化します。細胞ペレットを2ミリリットルの赤血球溶解バッファーに室温で10分間懸濁します。次に、細胞を10ミリリットルの新鮮なRPMI培地で洗浄し、FCブロックを含む細胞ソーティングバッファーに10倍で8細胞/リットルに再懸濁します。血漿サイトードDCを単離するには、血漿サイトードDC単離キットから300マイクロリットルのビオチン標識抗体カクテルと200マイクロリットルの脾臓単細胞懸濁液を完全に混合します。細胞を氷水浴に15分間入れ、3分ごとに軽くたたきます。次に、12ミリリットルの細胞選別緩衝液で細胞を洗浄し、ペレットを500マイクロリットルの新鮮な選別緩衝液に再懸濁します。次に、細胞を300マイクロリットルの抗ビオチン抗体標識ビーズで氷水でさらに15分間インキュベートし、定期的にタッピングします。新鮮なソーティングバッファーで細胞を洗浄した後、パレットを2ミリリットルの細胞ソーティングバッファーに再懸濁し、適切なサイズの磁気カラムを対応する磁石にロードします。5ミリリットルの新鮮な4°C細胞ソーティングバッファーでカラムを平衡化します。カラムの上部からすべてのバッファーが排出されたら、カラムヘッドの表面の中央にセルを慎重に追加し、フロースルーを収集します。次に、10ミリリットルの新鮮な摂氏4度の選別バッファーでカラムを洗浄し、フロースルーを同じチューブに回収します。第2の磁気カラムを通過させた後、純度94%を超える血漿サイトード樹状細胞集団が期待できます。CD8aplha+およびCD8alpha-DCを単離するには、残りの脾臓細胞懸濁液をCD8alpha+樹状細胞単離キットの100マイクロリットルのバイオション標識抗体カクテルと混合し、氷上で15分間、軽くたたいて軽くたたいます。インキュベーションの終了時に、細胞を12ミリリットルの4°C細胞選別緩衝液で洗浄し、ペレットを150μLの新鮮な4°C細胞選別緩衝液に再懸濁します。次に、100 μLのCD8α+樹状細胞単離キット抗ビオチンビーズと細胞を混合します。氷上で15分間軽くたたいて、10ミリリットルの4°C細胞選別緩衝液で細胞を洗浄し、ペレットを1ミリリットルの新鮮な4°C選別緩衝液に再懸濁します。インキュベーションの最後に、先ほど示したように、磁気ビーズ分離によって細胞を選別し、フロースルーと最初の洗浄を収集します。次に、細胞をスピンダウンし、ペレットを1ミリリットルの新鮮な4°C細胞選別バッファーに再懸濁します。次に、キットから200マイクロリットルの抗CD8aplha標識磁気ビーズで細胞を標識し、細胞を新しいカラムに通して、CD8α樹状細胞のフロースルーを収集します。CD8alpha+DCを回収するには、カラムを15ミリリットルのコニカルチューブに移し、5ミリリットルの新鮮な4°Cの細胞選別バッファーをカラムに注入します。細胞を2番目のカラムに通した後、96%を超えるCD8α+樹状細胞集団が期待できます。CD8α細胞を単離するには、CD8αフロースルー細胞懸濁液を回転させます。次に、100マイクロリットルの抗CD11 c磁気ビーズで細胞を標識し、磁気ビーズ陽性細胞集団を採取して、ちょうど示したように、97%を超えるCD8α-樹状細胞サブセット集団を得る。最後に、トリパンブルーの排除により、生細胞の数を決定します。腫瘍が触知可能になると、B16 flt-3リガンド腫瘍担体マウスは、脾臓樹状細胞サブセットの拡大と相関する脾臓細胞性の劇的な増加を一貫して示します。興味深いことに、これらの動物の従来のDCでは絶対細胞数の15倍から20倍の増加が観察されますが、血漿サイトードDCサブセットでは約4倍の増加しか観察されません。異なる樹状細胞サブセットは、B220、CD11b、CD11c、およびCD8αの発現に従って特徴付けられます。しかし、細胞集団は他のユニークなサブセットマーカーも示し、mPDCA1は血漿細胞腫DCでのみ発現し、DEC205はCD8alpa+DCで高発現し、CD11bおよび33D1はCD8α-DCで最も顕著に検出されます。この方法を用いて、CD8alpa+DCは、CD結合分子による抗原の提示において最も効率的であることを実証しました。これは、不変NKT細胞として知られる特殊なT細胞集団です。DC絶縁の最も重要な特徴は、厳格な無菌性と抗ドキサン剤を含まない条件を維持することです。処置中、これらのT細胞は抗ドキサントに対して非常に反応性があります。この手順を試みる際には、機械的な刺激を繰り返すと樹状突起細胞の成熟状態が変化する可能性があるため、細胞を優しく扱うことを覚えておくことが重要です。習得すると、この手法を使用して、単一の脾臓から多数の主要なDCサブセットを分離できます。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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