マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

このプロトコルの全体的な目標は、樹状細胞またはDCを生成するための高効率、高収率の方法を開発することです。これは、樹状細胞またはDCの生体内表現型および機能的分岐を運命的に反映します。樹状細胞は、リンパ器官に大きな集団として存在します。したがって、フィルターリガンドを使用して、ドナー組織中のこれらの必須細胞の頻度を増やし、その分離を促進します。

この手法の主な利点は、市販の薬剤のみを使用した分析に適した数のすべてのDCサブセットの生成を排除できることです。90%コンフルエント培養物からB16メラノーマ細胞を発現するflt-3リガンドを採取するには、まず細胞をPBSで洗浄し、05%トリプシンと37°Cで培養物をインキュベートします。5分後、20ミリリットルの4°C完全dima培地でプロテアーゼ活性を急冷し、軽くタッピングして穏やかなピペッティングで接着細胞モデル層を剥離します。

遠心分離により細胞を採取し、カウントします。次いで、単一細胞懸濁液をPBS中の8細胞/ミリリットル濃度の1倍に再懸濁し、C57黒色6レシピエントマウスへの皮下注射を行う。腫瘍の直径が2〜10ミリリットルに達したら、腫瘍担持動物から脾臓を採取し、脾臓を新鮮なRPMI培地が入ったシャーレに入れます。

メスを使用して、組織を0.2平方センチメートルの小片に切断し、次に断片を10ミリリットルのコラゲナーゼとDnaseで摂氏37度でインキュベートします。30分後、部分的に消化された組織スラリーを70ミクロンの細胞ストレーナーに注ぎ、5ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、残りの組織断片をストレーナーのメッシュに押し込みます。10ミリリットルの新鮮な培地でフィルターをすすぎ、洗浄液を残りの単一細胞懸濁液とプールし、細胞をペレット

細胞ペレットを2ミリリットルの赤血球溶解バッファーに室温で10分間懸濁します。次に、細胞を10ミリリットルの新鮮なRPMI培地で洗浄し、FCブロックを含む細胞ソーティングバッファーに10倍で8細胞/リットルに再懸濁します。血漿サイトードDCを単離するには、血漿サイトードDC単離キットから300マイクロリットルのビオチン標識抗体カクテルと200マイクロリットルの脾臓単細胞懸濁液を完全に混合します。

細胞を氷水浴に15分間入れ、3分ごとに軽くたたきます。次に、12ミリリットルの細胞選別緩衝液で細胞を洗浄し、ペレットを500マイクロリットルの新鮮な選別緩衝液に再懸濁します。次に、細胞を300マイクロリットルの抗ビオチン抗体標識ビーズで氷水でさらに15分間インキュベートし、定期的にタッピングします。

新鮮なソーティングバッファーで細胞を洗浄した後、パレットを2ミリリットルの細胞ソーティングバッファーに再懸濁し、適切なサイズの磁気カラムを対応する磁石にロードします。5ミリリットルの新鮮な4°C細胞ソーティングバッファーでカラムを平衡化します。カラムの上部からすべてのバッファーが排出されたら、カラムヘッドの表面の中央にセルを慎重に追加し、フロースルーを収集します。

次に、10ミリリットルの新鮮な摂氏4度の選別バッファーでカラムを洗浄し、フロースルーを同じチューブに回収します。第2の磁気カラムを通過させた後、純度94%を超える血漿サイトード樹状細胞集団が期待できます。CD8aplha+およびCD8alpha-DCを単離するには、残りの脾臓細胞懸濁液をCD8alpha+樹状細胞単離キットの100マイクロリットルのバイオション標識抗体カクテルと混合し、氷上で15分間、軽くたたいて軽くたたいます。

インキュベーションの終了時に、細胞を12ミリリットルの4°C細胞選別緩衝液で洗浄し、ペレットを150μLの新鮮な4°C細胞選別緩衝液に再懸濁します。次に、100 μLのCD8α+樹状細胞単離キット抗ビオチンビーズと細胞を混合します。氷上で15分間軽くたたいて、10ミリリットルの4°C細胞選別緩衝液で細胞を洗浄し、ペレットを1ミリリットルの新鮮な4°C選別緩衝液に再懸濁します。

インキュベーションの最後に、先ほど示したように、磁気ビーズ分離によって細胞を選別し、フロースルーと最初の洗浄を収集します。次に、細胞をスピンダウンし、ペレットを1ミリリットルの新鮮な4°C細胞選別バッファーに再懸濁します。次に、キットから200マイクロリットルの抗CD8aplha標識磁気ビーズで細胞を標識し、細胞を新しいカラムに通して、CD8α樹状細胞のフロースルーを収集します。

CD8alpha+DCを回収するには、カラムを15ミリリットルのコニカルチューブに移し、5ミリリットルの新鮮な4°Cの細胞選別バッファーをカラムに注入します。細胞を2番目のカラムに通した後、96%を超えるCD8α+樹状細胞集団が期待できます。CD8α細胞を単離するには、CD8αフロースルー細胞懸濁液を回転させます。

次に、100マイクロリットルの抗CD11 c磁気ビーズで細胞を標識し、磁気ビーズ陽性細胞集団を採取して、ちょうど示したように、97%を超えるCD8α-樹状細胞サブセット集団を得る。最後に、トリパンブルーの排除により、生細胞の数を決定します。腫瘍が触知可能になると、B16 flt-3リガンド腫瘍担体マウスは、脾臓樹状細胞サブセットの拡大と相関する脾臓細胞性の劇的な増加を一貫して示します。

興味深いことに、これらの動物の従来のDCでは絶対細胞数の15倍から20倍の増加が観察されますが、血漿サイトードDCサブセットでは約4倍の増加しか観察されません。異なる樹状細胞サブセットは、B220、CD11b、CD11c、およびCD8αの発現に従って特徴付けられます。しかし、細胞集団は他のユニークなサブセットマーカーも示し、mPDCA1は血漿細胞腫DCでのみ発現し、DEC205はCD8alpa+DCで高発現し、CD11bおよび33D1はCD8α-DCで最も顕著に検出されます。

この方法を用いて、CD8alpa+DCは、CD結合分子による抗原の提示において最も効率的であることを実証しました。これは、不変NKT細胞として知られる特殊なT細胞集団です。DC絶縁の最も重要な特徴は、厳格な無菌性と抗ドキサン剤を含まない条件を維持することです。処置中、これらのT細胞は抗ドキサントに対して非常に反応性があります。

この手順を試みる際には、機械的な刺激を繰り返すと樹状突起細胞の成熟状態が変化する可能性があるため、細胞を優しく扱うことを覚えておくことが重要です。習得すると、この手法を使用して、単一の脾臓から多数の主要なDCサブセットを分離できます。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。