の検出のためのより高感度で特異的な発色性寒天培地の開発

本手順の全体的な目的は、従来の培地と比較して、新型の発色培地によるVibrio parahaemolyticusの検出および分離能における感度と特異度を評価することです。この手法は、食品中および採取環境におけるVibrio属種の有病率はどの程度かといった、食品および環境微生物学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。本手順の主な利点は、食品マトリックスが存在する場合を含め、多くの細菌分離株を使用できることです。

細菌を培養する前に、すべての寒天培地をオートクレーブで滅菌します。その後、ウォーターバスを用いて寒天を45〜50°Cまで冷却します。寒天の準備が整ったら、空のペトリ皿を5〜6枚ずつ積み重ねて配置します。

次に、スタックの下から順に、溶融したアガーを各プレートの約半分まで注ぎ、注いだ後に蓋を閉めます。アガーを室温で少なくとも12時間放置し、凝固させます。微生物株の培養準備として、アガーが準備できたら、滅菌済みの白金線を使い、適切な非選択アガープレートに培養物を移し、独立したコロニーを観察できるパターンで細菌を画線します。

すべてのコロニーの平板塗布が完了したら、培養物を35〜37°Cで最大48時間、倒立状態で培養します。ただし、Campylobacter属については、微好気環境を形成するためにガスパックを入れた密閉容器内で培養してください。培養終了時にコロニーの形態を観察します。純粋培養であれば、同様のコロニー形態を示すコロニーが得られるはずです。

選択培地および分画培地で目的のコロニーを増殖させるため、少数の単離コロニーを5 mLの適切なブイヨン培地に移し、35～37 °Cで16～24時間再培養します。翌日、 overnight培養した菌液をループ1杯分、少なくとも1枚のチオスルファート・クエン酸・胆汁酸・スクロース（TCBS）寒天培地と、少なくとも1枚の発色寒天培地に画線し、35～37 °Cで最大96時間培養します。培養終了後、プレート上の菌密度と単離コロニーのサイズを確認して菌株の全体的な増殖を判定し、必要に応じて環境光またはUV光の下でコロニーの色を記録し、その他の重要なコロニー特性をメモします。

回収率アッセイを行うため、2%の塩化ナトリウムを添加したトリプチカソイブロス（TSBS）5 mLにVibrio parahaemolyticusの若齢培養物を接種し、チューブを35～37 °Cで16～24時間培養します。翌日、 overnight培養物をボルテックスで撹拌し、PBSを用いて細菌の1×10⁻¹から1×10⁻⁷までの希釈系列を調製します。1×10⁻⁴から1×10⁻⁷の希釈液を用いて、各希釈液100 µLを、個別のクロモジェニック培地、TCBS培地、および2%塩化ナトリウム添加トリプチカソイ寒天培地（TSAS）に均一に塗抹します。

すべてのプレートを35〜37°Cで最大96時間インキュベートします。その後、コロニー数をカウントし、コロニー数が多すぎて計測不能なプレート、または25個未満のコロニーしか含まれないプレートは除外します。競合アッセイを行うには、TCBSで期待されるターコイズ色のコロニーを形成し、発色寒天培地でシアン色のコロニーを形成するV.Parahaemolyticus株と、非V.

どちらの培地でも増殖しない、または異なるコロニー色を示すParahaemolytius種。TSAS寒天培地から単離したV.ParahaemolyticusおよびV.Metschnikoviiのコロニーを数個、5 mLのTSBS培地に移し、35～37°Cで16～24時間培養する。Brain Heart Infusion（BHI）寒天培地から単離したShigella sonneiのコロニーを数個、5 mLのBHIブイヨン培地に移し、35～37°Cで16～24時間培養する。

翌日、各菌株について段階希釈を行い、希釈液を非選択培地のアガールプレートに播種して、 overnight培養液の1 mLあたりのコロニー形成単位（CFU）を測定します。次に、overnight培養液と希釈チューブを用いて、V. Parahaemolyticus菌株とV. Parahaemolyticus以外の菌種の異なる容量を混合し、この細菌混合液 100 µLを、それぞれ発色培地、TCBS培地、およびTSAS培地のアガールプレートに塗布します。

35～37°Cで最大96時間培養した後、クロモジェニックプレートおよびTCBSプレートにおける増殖と形態の違いに基づいてコロニー数を計数します。選択培地および分画培地における細菌の増殖に対する牡蠣ホモジネートの影響を評価するため、まず、身と液汁を含む少なくとも12個の軟体動物貝類から、少なくとも50 gの牡蠣の身を量り取ります。次に、牡蠣組織に等量のPBSを加え、混合物を高速で90秒間攪拌します。

次に、希釈したカキのホモジネート100 gを400 gのPBSに加え、混合物を高速で1分間撹拌します。その後、ホモジネートをオートクレーブで滅菌します。冷却後、一晩培養したV.Parahaemolyticusおよび非V.属の各菌液を100 µLずつ加えます。

牡蠣のスラリーにParahaemolyticus培養液を添加し、ホモジナイザーを用いて細菌細胞を牡蠣ホモジネートと混合します。実演に従い、スパイクした牡蠣ホモジネートをPBSで10⁻¹から10⁻³まで段階希釈し、各希釈液100 µLを個別のクロモジェニックプレート、TCBSプレート、およびTSASプレートに塗布します。35〜37 °Cで96時間培養後、クロモジェニック寒天培地およびTCBS寒天培地上の実際のコロニー数と、一晩培養した菌液に対して行った標準平板計数法から導き出された期待コロニー数を比較します。

本研究で使用した菌株の増殖およびコロニー形態を決定するため、細菌を選択培地および分画培地で培養しました。TCBSは、ターコイズ色の V.Parahaemolyticus や黄色の V.Cholerae を含む一部の Vibrio 属菌の単離に用いられる一般的な培地です。食品や環境試料から臨床的に重要な Vibrio 属菌を選択するために発色培地を使用すると、シアン色の V.Parahaemolyticus およびマゼンタ色の V.Cholerae が生成されます。

カキホモジネート存在下で発色寒天培地で増殖させた V.Parahaemolyticus のコロニー数は、非選択培地上のコロニー数と同程度に観察されました。これは、食品マトリックスが存在する場合でも、発色培地の検出限界が非選択培地と同程度であることを示唆しています。また、V.Parahaemolyticus の増殖および回収は、非 V. Parahaemolyticus 種の存在によって影響を受けませんでした。環境試料には、特に増菌操作後に多種の Vibrio 属菌が高密度に含まれているため、これは分立・選択培地にとって不可欠な特性です。

さらに、熱不安定性ヘモリジンPCRによるTCBS培地と発色寒天培地の比較では、発色寒天培地の方が感度および特異度が高く、V.Parahaemolyticusの検出および同定において、この分化選択培地が全体的に優れた性能を持つことが示されました。習熟すれば、適切に実施することで、約50株の検査および培養期間を含む全工程を30日以内に完了させることができます。本手順を実施する際は、すべての培養物に入念にラベルを貼り、常に無菌操作を用いることが重要です。

この手順に従い、コロニーPCRなどの他の手法を用いて、「この特定の分離株は毒性遺伝子を保有しているか」といった追加の疑問を検討することが可能です。この技術の開発により、食品安全および公衆衛生分野の研究者が、貝類や河口域環境におけるVibrio種の検出を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、標準平板計数法の実施方法、および培地の感度、特異度、検出限界の評価方法について十分に理解できるはずです。

病原体や高温の培地を取り扱うことは極めて危険であるため、本手順の実施中は、保護服の着用、開放創の保護、バイオハザード廃棄物の分別などの予防措置を常に講じる必要があることに留意してください。