の検出のためのより高感度で特異的な発色性寒天培地の開発腸炎ビブリオその他ビブリオ種

この手順の全体的な目標は、従来の培地と比較して、腸炎ビブリオを検出して単離する能力について、新しい発色培地の感度と特異性を評価することです。この方法は、食品および収穫環境におけるビブリオ種の有病率はどれくらいかなど、食品および環境微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。私たちの手順の主な利点は、食品マトリックスの存在下を含め、多くの細菌分離物を使用できることです。

細菌を培養する前に、すべての寒天培地をオートクレーブします。次に、寒天を水浴で摂氏45〜50度に冷却します。寒天の準備ができたら、空のペトリプレートを5〜6枚のプレートの積み重ねに配置します。

次に、スタックの一番下から始めて、溶かした寒天を各プレートに約半分いっぱいになるまで注ぎ、注いだ後に蓋を交換します。寒天を室温で少なくとも12時間固める。微生物株の培養物をセットアップするには、寒天の準備ができたら、滅菌接種ループを使用して培養物を適切な非選択的寒天プレートに移し、単離されたコロニーの観察を可能にするパターンで細菌をストリーキングします。

すべてのコロニーがプレーティングされたら、カンピロバクター種を除いて、培養物を逆さまにして摂氏35〜37度で最大48時間インキュベートします。ただし、カンピロバクター種は、ガスパウチが入った密閉蓋の瓶でインキュベートして微好気性環境を作り出す必要があります。インキュベーションの終わりにコロニーの形態を観察します。純粋な培養物は、同様のコロニー形態を示すコロニーを生み出すはずです。

選択的培地および分画培地で目的のコロニーを成長させるには、いくつかの単離コロニーを5ミリリットルの適切なブロスに移し、培養物を摂氏35〜37度で16〜24時間再インキュベートします。翌日、少なくとも1つのチオ硫酸-クエン酸塩-胆汁-塩-スクロース、またはTCBSの寒天プレートと少なくとも1つの発色性寒天プレートに、一晩の培養物をループ状に線で入れ、摂氏35〜37度で最大96時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、プレート上の培養密度と単離されたコロニーのサイズの両方を調べて、株の全体的な成長を決定し、必要に応じて周囲光またはUV光の下でのコロニーの色を記録し、コロニーの他の重要な特性に注意してください。

回収アッセイを行うには、腸炎ビブリオの若い培養物を5ミリリットルのトリプシン大豆ブロスに接種し、2パーセントの塩化ナトリウム(TSBS)を補給し、チューブを摂氏35〜37度で16〜24時間置きます。翌日、一晩培養物をボルテックスし、PBS中の細菌の1×10をネガティブに、1×10をネガティブに7希釈してセットアップする。1×10〜1〜4〜1×10〜マイナス7希釈を用いて、各希釈液100マイクロリットルを個々の発色性、TCBS、およびトリプシン性大豆寒天に2パーセント塩化ナトリウム寒天培地、またはTSASを添加

すべてのプレートを摂氏35〜37度で最大96時間インキュベートします。次に、コロニーを数え、数えるには数えられないほどの数のコロニーを持つプレートや、25未満のコロニーを含むプレートを無視します。競合アッセイを実施するには、TCBSで期待されるターコイズコロニーと発色寒天培地でシアンコロニーが得られるV.Parahaemolyticus株、および非Vを選択します。

Parahaemolytius種は、どちらの培地でも成長しないか、異なるコロニーの色を示します。TSAS農業からいくつかの分離されたV.ParahaemolyticusおよびV.Metschnikoviiコロニーを5ミリリットルのTSBSに移し、摂氏35〜37度で16〜24時間のインキュベーションを行います。Brain Heart Infusion(BHI)寒天からいくつかの分離された赤痢菌コロニーを5ミリリットルのBHIブロスに移し、摂氏35〜37度で16〜24時間。

翌日、各菌株に対して段階希釈を行い、希釈液を非選択的寒天プレートに播種して、一晩培養のミリリットルあたりのコロニー形成単位を決定します。次に、一晩培養と希釈チューブを使用して、異なる容量のV.Parahaemolyticus株と非V株を混合します。Parahaemolyticus種と細菌混合物の100マイクロリットルを個々の発色性、TCBS、およびTSAS寒天プレートに広げます。

摂氏35度から37度で最大96時間後、発色プレートとTCBSプレート上の成長と形態の違いに基づいてコロニーを数えます。選択培地および分画培地での細菌増殖に対するカキのホモジネートの影響を評価するには、まず、少なくとも12種類の軟体動物の貝殻魚(肉や酒を含む)から少なくとも50グラムのカキ肉を計量します。次に、等量のPBSをカキ組織に加え、混合物を高速で90秒間ブレンドします。

次に、希釈したカキのホモジネート100gをPBS400gに加え、1分間高速でブレンドします。次に、ホモジネートをオートクレーブします。冷却後、各一晩のV.Parahaemolyticusと非Vを100マイクロリットル追加します。

Parahaemolyticusをカキのスラリーに培養し、ホモジナイザーを使用して細菌細胞をカキのホモジネートと混合します。示されているように、PBS中のスパイクカキホモジネートの1倍から10倍をネガティブに1倍にし、各希釈の100マイクロリットルを個々の発色性、TCBS、およびTSASプレートに広げます。摂氏35度から37度で96時間後、発色性およびTCBS寒天の実際のコロニー数を、一晩の培養で実施された標準プレート数から推定される予想されるコロニー数と比較します。

この研究で使用した株の増殖とコロニー形態を決定するために、細菌を選択培地と分画培地で増殖させました。TCBSは、ターコイズブルーのV.Parahaemolyticusや黄色のV.Choleraeなど、一部のビブリオ種の単離に使用される従来の培地です。発色培地を使用して、食品および環境サンプルから臨床的に関連するビブリオ種を選択すると、シアンのV.ParahaemolyticusおよびマゼンタのV.Choleraeが生成されます。

カキのホモジネートの存在下で発色性寒天プレート上で増殖したV.Parahaemolyticusのコロニーは、非選択的培地上のコロニーと同数で観察され、食品マトリックスの存在下でも、発色培地の検出限界が非選択的培地の検出限界と類似していることを示唆しています。また、V.Parahaemolyticusの成長と回復は、非Vの存在によって影響を受けません。Para haemolyticus種は、環境サンプルが特に濃縮手順後にさまざまなビブリオ種を多数含んでいるため、差動および選択的培地の重要な属性です。

さらに、熱不安定性溶血性PCRによるTCBSと発色寒天の比較は、発色性寒天に対するより高い感度と特異性を明らかにし、V.Parahaemolyticusを検出および同定するためのこの差動および選択的培地の全体的な性能が優れていることを示しています。習得すると、適切に実行すれば、約50株の試験時間とインキュベーション時間を含む全手順を30日以内に完了することができます。この手順を試行する際には、すべての培養物に熱心にラベルを付け、常に無菌技術を使用することを忘れないでください。

この手順に続いて、コロニーPCRなどの他の方法を実行して、次のような追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、食品安全と公衆衛生の分野の研究者が、貝類や河口環境におけるビブリオ種の検出を調査する道を開きました。このビデオを見れば、標準プレートカウントの実施方法と、成長培地の感度、特異性、検出限界の評価方法について十分に理解できるはずです。

病原体や高温媒体を扱う作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、防護服の着用、開いた傷口を覆う、バイオハザード廃棄物の分別などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。