IgGおよびIgM自己抗体の同時検出のための二色抗原マイクロアレイの生成

この技術の全体的な目的は、マルチプレックス方式で自己抗体を迅速にスクリーニングすることです。この手法は、どの自己抗体が異なる疾患状態と相関しているかなど、自己免疫疾患の分野における重要な課題の特定に役立ちます。本技術の主な利点は、自己抗体を並列的にスクリーニングでき、必要となる血清量がわずか数µLであり、抗原量も数µgで済むことです。

抗原マイクロアレイを作成するために、まず抗原をPBSで希釈し、最終濃度を2 milligrams per milliliterに調整します。最大162種類の固有抗原を重複してプリントできるよう、9本のピンを用いてマイクロアレイヤーの設定を行います。抗原ライブラリには、陽性対照としてIgGおよびIgM抗原を含めてください。

陰性対照としてPBSのみを含めてください。プリントヘッドの設定に対応するグループごとに、各抗原を20 µLずつ384ウェルソースプレートに添加します。ソースプレートをアルミホイルで覆い、アレイをプリントするまで-80 °Cで凍結保存してください。

脱イオン水を入れた超音波洗浄機で1分間の洗浄を3回行い、ソリッドマイクロアレイピンを洗浄します。ピンをラックに置いて乾燥させます。その後、ピンをマイクロアレイプリントヘッドにセットします。

9本のピンを使用する場合は、3×3の構成にします。次に、プリントヘッドのピン数、プリントするスライド数、各スライド上のパッド数、および各抗原のレプリケートスポット数を設定し、マイクロアレイヤーのプリントランをプログラムします。さらに、異なる抗原グループの間でピンを水中で超音波洗浄するようにマイクロアレイヤーをプログラムします。

次に、ソースプレートを融解した後、100 ×gで1分間遠心分離します。ソースプレートをマイクロアレイヤーの指定の位置に配置し、最初にプリントする抗原グループを覆っているフォイル部分を取り除きます。未プリントのスライドをアレイヤー表面に配置し、プリントプログラムを実行します。アレイヤーの湿度を55〜60%に設定し、室温でスライドをプリントします。各抗原グループのすべてのスライドへのプリントが完了するたびに、マイクロアレイヤーを一時停止させてください。

蒸発を防ぐため、プリントしたばかりの抗原をアルミホイルで覆い、次にプリントする抗原群のホイルを取り除きます。その後、プリントプログラムを続行してください。すべての抗原のプリントが完了したら、ソースプレートを新しいアルミホイルで覆い、-80 °Cで冷凍保存します。

プリントしたスライドをスライドボックスに入れ、真空封印します。スライドは翌日、または最大1か月後まで使用可能です。インキュベーションチャンバーを用いて希釈した血清でマイクロアレイをプローブする場合、スライドをフレームにセットしてください。

次に、各アレイ表面にブロッキングバッファーを700 µL加えます。フレームの上に粘着フィルムを貼り、濡れたティッシュと共に密閉容器に移します。その後、スライドをロッカースタンドを用い、4 °Cで一晩インキュベートします。

翌日、血清サンプルをブロッキングバッファーで100倍に希釈します。次に、アレイからブロッキング溶液を吸引し、各アレイ表面に500 µLの希釈済みサンプルを添加します。続いて、アレイを粘着フィルムで覆い、4 °Cで1時間、ロッキングしながらインキュベートします。

次に、アレイから血清サンプルを吸引し、リンスバッファーをスライド上に注いで素早く振り切る操作を4回繰り返し、アレイ表面を洗浄します。700 microlitersのブロッキングバッファーを用いて各アレイ表面を洗浄し、室温で10分間ロッキングしながらインキュベートします。その後、各スライド表面に500 microlitersの希釈した二次抗体を加え、粘着フィルムで封止します。

スライドを4 °Cで45分間、ロッキングしながらインキュベートします。インキュベーション後、スライドから二次抗体混合液を吸引し、先に示した通りに4回すすぎます。その後、700 µLのブロッキング希釈バッファーを用いて、10分間ずつ3回スライドを洗浄します。

スライドをフレームから取り出し、金属製スライドラックにセットしてPBSに浸します。室温で20分間、オービタルシェーカーを用いてインキュベートします。その後、スライドラックを脱イオン水の入った容器に15秒間浸します。

次に、ラックを新しい水を入れた容器に入れ、さらに15秒間インキュベートします。スライドを乾燥させるには、スライドラックを遠心分離機のELISAプレートアダプターにセットし、室温、220 ×gで5分間遠心分離します。スキャニングを行うまで、スライドを遮光ボックスに入れて保管してください。

スライドをスキャンするには、SI 3およびSI 5の蛍光信号を検出可能なマイクロアレイスキャナーを使用します。二次抗体のみでプローブ処理した全抗原ライブラリースライドをプレスキャンし、最適な倍率チューブ（PMT設定）を決定してください。ハードウェアボタンを押し、SI 3チャネルのヒトIgGフィーチャーとSI 5チャネルのヒトIgMフィーチャーの背景減算後中央蛍光強度（MFIB）が同程度（通常は40,000）になるようにPMT値を設定します。

次に、スキャンボタンを押して、2つのチャンネルで実験用スライドをスキャンします。各スキャンの後、両チャンネルのスライド画像を保存してください。ファイルボタンを使用して、解析するスライドをマイクロアレイソフトウェアに読み込みます。

次に、「ファイル」ボタンを使用して、アレイのレイアウトとアレイ機能の識別情報が含まれている遺伝子アレイリスト（GALファイル）を読み込みます。アレイ機能がテンプレートと可能な限り密接に一致するように、スキャン画像の上にアレイテンプレートを配置します。「アライン」ボタンを押して、すべてのブロックにある機能をテンプレートに合わせて調整します。

その後、ソフトウェアを用いて各抗原の背景除去後MFIを算出します。最後に、ファイルボタンを使用して結果をテキストファイルとして書き出し、テキストプロトコルに従ってデータを解析します。陽性および陰性コントロールスライドを示すこの図において、陰性スライドは二次抗体のみでプローブされており、陽性コントロールスライドは全身性エリマトーデス患者の血清でプローブされています。

ここに示すように、riboPに対して既知の反応性を持つ陽性コントロール血清は、一本鎖DNAに対するIgM抗体およびriboPに対するIgG抗体を有することが示されています。IgMではすべての血清希釈において線形反応が観察され、IgGではバックグラウンドを差し引いたMFIが約30,000まで線形反応が観察されました。本実験では、IgGに対するIgM抗体であるリウマチ因子が確認されている、クリオグロブリン血症性血管炎患者のヒト血清を用いてアレイをプローブします。

患者血清中のIgMがアレイ上の固定化IgGに結合するため、IgGのスポットは黄緑色になります。二次抗体のみを用いた場合、アレイにスポットされたIgGに対してIgMの反応は見られません。ここでは、アレイにスポットされたマウスIgMとIgGが、それぞれIgMおよびIgGに対する抗マウス二次抗体によってのみ検出される様子を示しています。

この図は、マイクロアレイ解析ソフトウェアを用いて、スキャンしたアレイ画像上にテンプレートグリッドをアライメントした様子を示しています。アライメント後、アレイの各フィーチャーを解析し、バックグラウンドを差し引いた中央値蛍光強度を得ることができます。習熟すれば、適切に行うことで抗原マイクロアレイのプロービングは4時間で完了します。

この手順に続き、抗原マイクロアレイから得られた結果を検証するために、ELISAなどの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、抗原マイクロアレイのプリント方法、血清による抗原マイクロアレイのプローブ方法、およびスキャナーによる抗原マイクロアレイのスキャン方法について十分に理解できたはずです。ヒト血清の取り扱いは危険を伴う可能性があるため、この手順を実施する際は標準予防策を講じることを忘れないでください。