IgGおよびIgM自己抗体の同時検出のための二色抗原マイクロアレイの生成

この技術の全体的な目標は、マルチプレックス方式で自己抗体を迅速にスクリーニングすることです。この方法は、どの自己抗体がさまざまな疾患状態と相関しているかなど、自己免疫の分野における重要な問題を特定するのに役立ちます。この技術の主な利点は、自己抗体を並行してスクリーニングできること、必要な血清はマイクロリットルのみ、抗原はマイクログラムのみであることです。

抗原マイクロアレイを作製するには、まずPBS中の抗原を最終濃度2ミリグラム/ミリリットルに希釈します。9ピンのマイクロアレイ構成をセットアップして、最大162個のユニークな抗原を二重に印刷します。IgG抗原およびIgM抗原を抗原ライブラリーにポジティブコントロールとして含めます。

PBSをネガティブコントロールとしてのみ含めます。各抗原を20マイクロリットルを384ウェルソースプレートに、プリントヘッドのセットアップを反映したグループで追加します。ホイルを使用してソースプレートを覆い、アレイを印刷する準備ができるまでプレートを摂氏マイナス80度で凍結します。

固体マイクロアレイピンを脱イオン水を入れた超音波浴中でそれぞれ1分間3回インキュベートして洗浄します。ピンをラックに入れて乾かします。次に、マイクロアレイプリントヘッドにピンを配置します。

9 ピンの場合は、3 x 3 の構成を使用します。次に、プリントヘッドのピン数、印刷するスライドの数、各スライドのパッドの数、および各抗原の複製スポットの数を設定して、印刷実行用のマイクロアレイをプログラムします。さらに、マイクロアレイヤーをプログラムして、異なる抗原群間の水中のピンを超音波処理します。

次に、ソースプレートを解凍した後、100倍Gで1分間遠心分離し、マイクロアレイ内の所定の場所にソースプレートを置き、次に印刷する抗原の最初のグループを覆っているホイルの部分を取り除きます。印刷されていないスライドをアレイアーの表面に並べ、印刷プログラムを実行します。アレイの湿度を55〜60%に設定して、室温でスライドを印刷します抗原の各グループがすべてのスライドに印刷された後、マイクロアレイアーを一時停止します。

印刷したばかりの抗原を箔で覆って蒸発を防ぎ、次に印刷する抗原のグループを明らかにします。その後、印刷プログラムを続行します。すべての抗原が印刷されたら、ソースプレートを新しいホイルで覆い、摂氏マイナス80度で凍結します。

印刷したスライドをスライドボックスにセットし、真空シールします。スライドは翌日から1ヶ月後までご利用いただけます。インキュベーションチャンバーを使用して希釈した血清を含むマイクロアレイをプローブするには、スライドをフレームに入れます。

次に、各アレイ表面に 700 マイクロリットルのブロッキング バッファーを追加します。接着フィルムをフレームに置き、濡れたティッシュと一緒に密閉容器に移します。次に、スライドを摂氏4度のロッカーで一晩インキュベートします。

翌日、血清サンプルをブロッキングバッファーで1〜100に希釈します。次に、アレイからブロッキング溶液を吸引し、希釈したサンプル500マイクロリットルを各アレイ表面に加えます。次に、アレイを接着フィルムで覆い、摂氏4度で1時間揺さぶってインキュベートします。

次に、アレイから血清サンプルを吸引し、リンスバッファーを使用して、バッファーをスライドに注ぎ、すばやくはじき取ることにより、アレイ表面を 4 回すすぎます。700 マイクロリットルのブロッキングバッファーを使用して各アレイ表面を洗浄し、室温で 10 分間ロッキングしながらインキュベートします。次に、希釈した二次抗体を500μLずつ各スライド面に添加し、粘着フィルムで覆います。

スライドを摂氏4度でインキュベートし、45分間揺さぶります。インキュベーション後、スライドから二次抗体混合物を吸引し、先ほど示したように4回すすぎます。次に、スライドを700マイクロリットルのブロッキング希釈バッファーで、それぞれ10分間、3回洗浄します。

スライドをフレームから取り外し、金属製のスライドラックに入れてPBSに浸します。室温で20分間オービタル振盪しながらインキュベートします。スライドラックを脱イオン水の容器に15秒間置きます。

次に、ラックを新しい水の容器に入れ、さらに15秒間インキュベートします。スライドを乾燥させるには、スライドラックを遠心分離機のELISAプレートアダプターに置き、Gの220倍、室温で5分間回転させます。スキャンの準備ができるまで、スライドを軽く密閉されたボックスに入れます。

スライドをスキャンするには、SI 3およびSI 5の蛍光シグナルを検出できるマイクロアレイスキャナーを使用します。最適なマルチプライヤチューブ(PMT設定)を決定するには、二次抗体のみでプローブした全抗原ライブラリースライドをプレスキャンします。SI 3チャンネル上のヒトIgG特徴とSI 5チャンネル上のヒトIGM特徴が、蛍光強度からバックグラウンドを差し引いたもの、またはMFIBを差し引いた中央値(通常は40, 000)を持つように、ハードウェアボタンを押して使用するPMT値を設定します。

次に、スキャンボタンを押して、2つのチャンネルで実験スライドをスキャンします。各スキャンの後、スライド画像を両方のチャネルに保存します。ファイルボタンを使用して、解析するスライドをマイクロアレイソフトウェアにロードします。

次に、ファイルボタンを使用して、遺伝子配列リスト、または配列のレイアウトを持つGALファイルを、配列機能のIDとともに読み込みます。配列テンプレートをスキャンした画像の上に配置して、配列の特徴がテンプレートにできるだけ一致するようにします。整列ボタンを押すと、すべてのブロックのフィーチャがテンプレートに整列されます。

次に、ソフトウェアは、各抗原のMFIからバックグラウンドを差し引いたものを計算します。最後に、ファイルボタンを使用して結果をテキストファイルとしてエクスポートし、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。この図では、ポジティブコントロールスライドとネガティブコントロールスライドを示しており、ネガティブスライドは二次抗体のみでプローブされ、ポジティブコントロールスライドは全身性エリテマトーデス患者の血清でプローブされています。

ここに示すように、陽性対照血清は、riboPに対する反応性が知られているため、一本鎖DNAに対するIgM抗体とriboPに対するIgG抗体を有することが示されています。線形応答は、すべての血清希釈液にわたるIgM、およびMFIマイナスバックグラウンド約30,000までのIgGで観察されました。この実験では、IgGに対するIgM抗体であるリウマチ因子が記録されているクリオグロブリン血症性血管炎患者のヒト血清でアレイをプローブします。

IgGの特徴は、患者の血清中のIgMがアレイ上の固定化されたIgGに結合するため、黄緑色です。二次抗体のみを使用すると、アレイ上に発見されたIgGに対するIgM反応性は見られません。ここに示されているのは、アレイ上にスポットされたマウスIgMおよびIgGは、それぞれIgMおよびIgGに対する抗マウス二次抗体でのみ検出されます。

この図は、マイクロアレイ解析ソフトウェアを使用した、スキャンされたアレイ画像上のテンプレートグリッドのアライメントを示しています。アライメントが完了したら、アレイの特徴を解析して、各特徴の蛍光強度の中央値からバックグラウンドを差し引いた値を取得できます。一度習得すれば、抗原マイクロアレイのプロービングは、適切に行えば4時間で行うことができます。

この手順に続いて、抗原マイクロアレイから得られた結果を検証するために、ELISAなどの他の手法を実行することができます。このビデオを見れば、抗原マイクロアレイの印刷方法、血清による抗原マイクロアレイのプローブ方法、スキャナーによる抗原マイクロアレイのスキャン方法についてよく理解できるはずです。人間の血清を扱うことは危険な場合があり、この手順を実行する際には普遍的な予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。