IgGおよびIgM自己抗体の同時検出のための二色抗原マイクロアレイの生成
2016年9月15日
ここでは、ヒトとマウスの血清IgGとIgMの自己抗体を同時に検出するために使用できるカスタマイズ可能な抗原マイクロアレイを生成する方法について説明します。これらのアレイにより、目的の抗原やエピトープに対する抗体をハイスループットかつ定量的に検出することができます。
この技術の全体的な目標は、マルチプレックス方式で自己抗体を迅速にスクリーニングすることです。この方法は、どの自己抗体がさまざまな疾患状態と相関しているかなど、自己免疫の分野における重要な問題を特定するのに役立ちます。この技術の主な利点は、自己抗体を並行してスクリーニングできること、必要な血清はマイクロリットルのみ、抗原はマイクログラムのみであることです。
抗原マイクロアレイを作製するには、まずPBS中の抗原を最終濃度2ミリグラム/ミリリットルに希釈します。9ピンのマイクロアレイ構成をセットアップして、最大162個のユニークな抗原を二重に印刷します。IgG抗原およびIgM抗原を抗原ライブラリーにポジティブコントロールとして含めます。
PBSをネガティブコントロールとしてのみ含めます。各抗原を20マイクロリットルを384ウェルソースプレートに、プリントヘッドのセットアップを反映したグループで追加します。ホイルを使用してソースプレートを覆い、アレイを印刷する準備ができるまでプレートを摂氏マイナス80度で凍結します。
固体マイクロアレイピンを脱イオン水を入れた超音波浴中でそれぞれ1分間3回インキュベートして洗浄します。ピンをラックに入れて乾かします。次に、マイクロアレイプリントヘッドにピンを配置します。
9 ピンの場合は、3 x 3 の構成を使用します。次に、プリントヘッドのピン数、印刷するスライドの数、各スライドのパッドの数、および各抗原の複製スポットの数を設定して、印刷実行用のマイクロアレイをプログラムします。さらに、マイクロアレイヤーをプログラムして、異なる抗原群間の水中のピンを超音波処理します。
次に、ソースプレートを解凍した後、100倍Gで1分間遠心分離し、マイクロアレイ内の所定の場所にソースプレートを置き、次に印刷する抗原の最初のグループを覆っているホイルの部分を取り除きます。印刷されていないスライドをアレイアーの表面に並べ、印刷プログラムを実行します。アレイの湿度を55〜60%に設定して、室温でスライドを印刷します抗原の各グループがすべてのスライドに印刷された後、マイクロアレイアーを一時停止します。
印刷したばかりの抗原を箔で覆って蒸発を防ぎ、次に印刷する抗原のグループを明らかにします。その後、印刷プログラムを続行します。すべての抗原が印刷されたら、ソースプレートを新しいホイルで覆い、摂氏マイナス80度で凍結します。
印刷したスライドをスライドボックスにセットし、真空シールします。スライドは翌日から1ヶ月後までご利用いただけます。インキュベーションチャンバーを使用して希釈した血清を含むマイクロアレイをプローブするには、スライドをフレームに入れます。
次に、各アレイ表面に 700 マイクロリットルのブロッキング バッファーを追加します。接着フィルムをフレームに置き、濡れたティッシュと一緒に密閉容器に移します。次に、スライドを摂氏4度のロッカーで一晩インキュベートします。
翌日、血清サンプルをブロッキングバッファーで1〜100に希釈します。次に、アレイからブロッキング溶液を吸引し、希釈したサンプル500マイクロリットルを各アレイ表面に加えます。次に、アレイを接着フィルムで覆い、摂氏4度で1時間揺さぶってインキュベートします。
次に、アレイから血清サンプルを吸引し、リンスバッファーを使用して、バッファーをスライドに注ぎ、すばやくはじき取ることにより、アレイ表面を 4 回すすぎます。700 マイクロリットルのブロッキングバッファーを使用して各アレイ表面を洗浄し、室温で 10 分間ロッキングしながらインキュベートします。次に、希釈した二次抗体を500μLずつ各スライド面に添加し、粘着フィルムで覆います。
スライドを摂氏4度でインキュベートし、45分間揺さぶります。インキュベーション後、スライドから二次抗体混合物を吸引し、先ほど示したように4回すすぎます。次に、スライドを700マイクロリットルのブロッキング希釈バッファーで、それぞれ10分間、3回洗浄します。
スライドをフレームから取り外し、金属製のスライドラックに入れてPBSに浸します。室温で20分間オービタル振盪しながらインキュベートします。スライドラックを脱イオン水の容器に15秒間置きます。
次に、ラックを新しい水の容器に入れ、さらに15秒間インキュベートします。スライドを乾燥させるには、スライドラックを遠心分離機のELISAプレートアダプターに置き、Gの220倍、室温で5分間回転させます。スキャンの準備ができるまで、スライドを軽く密閉されたボックスに入れます。
スライドをスキャンするには、SI 3およびSI 5の蛍光シグナルを検出できるマイクロアレイスキャナーを使用します。最適なマルチプライヤチューブ(PMT設定)を決定するには、二次抗体のみでプローブした全抗原ライブラリースライドをプレスキャンします。SI 3チャンネル上のヒトIgG特徴とSI 5チャンネル上のヒトIGM特徴が、蛍光強度からバックグラウンドを差し引いたもの、またはMFIBを差し引いた中央値(通常は40, 000)を持つように、ハードウェアボタンを押して使用するPMT値を設定します。
次に、スキャンボタンを押して、2つのチャンネルで実験スライドをスキャンします。各スキャンの後、スライド画像を両方のチャネルに保存します。ファイルボタンを使用して、解析するスライドをマイクロアレイソフトウェアにロードします。
次に、ファイルボタンを使用して、遺伝子配列リスト、または配列のレイアウトを持つGALファイルを、配列機能のIDとともに読み込みます。配列テンプレートをスキャンした画像の上に配置して、配列の特徴がテンプレートにできるだけ一致するようにします。整列ボタンを押すと、すべてのブロックのフィーチャがテンプレートに整列されます。
次に、ソフトウェアは、各抗原のMFIからバックグラウンドを差し引いたものを計算します。最後に、ファイルボタンを使用して結果をテキストファイルとしてエクスポートし、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。この図では、ポジティブコントロールスライドとネガティブコントロールスライドを示しており、ネガティブスライドは二次抗体のみでプローブされ、ポジティブコントロールスライドは全身性エリテマトーデス患者の血清でプローブされています。
ここに示すように、陽性対照血清は、riboPに対する反応性が知られているため、一本鎖DNAに対するIgM抗体とriboPに対するIgG抗体を有することが示されています。線形応答は、すべての血清希釈液にわたるIgM、およびMFIマイナスバックグラウンド約30,000までのIgGで観察されました。この実験では、IgGに対するIgM抗体であるリウマチ因子が記録されているクリオグロブリン血症性血管炎患者のヒト血清でアレイをプローブします。
IgGの特徴は、患者の血清中のIgMがアレイ上の固定化されたIgGに結合するため、黄緑色です。二次抗体のみを使用すると、アレイ上に発見されたIgGに対するIgM反応性は見られません。ここに示されているのは、アレイ上にスポットされたマウスIgMおよびIgGは、それぞれIgMおよびIgGに対する抗マウス二次抗体でのみ検出されます。
この図は、マイクロアレイ解析ソフトウェアを使用した、スキャンされたアレイ画像上のテンプレートグリッドのアライメントを示しています。アライメントが完了したら、アレイの特徴を解析して、各特徴の蛍光強度の中央値からバックグラウンドを差し引いた値を取得できます。一度習得すれば、抗原マイクロアレイのプロービングは、適切に行えば4時間で行うことができます。
この手順に続いて、抗原マイクロアレイから得られた結果を検証するために、ELISAなどの他の手法を実行することができます。このビデオを見れば、抗原マイクロアレイの印刷方法、血清による抗原マイクロアレイのプローブ方法、スキャナーによる抗原マイクロアレイのスキャン方法についてよく理解できるはずです。人間の血清を扱うことは危険な場合があり、この手順を実行する際には普遍的な予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
この記事では、ヒトとマウスの血清IgGおよびIgM自己抗体を同時に検出できるカスタマイズ可能な抗原マイクロアレイを生成する方法について説明しています。この技術は、様々な抗原やエピトープに対する抗体の高スループットかつ定量的な検出を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 自己免疫
- 免疫学
- 高スループットスクリーニング
背景
- 自己抗体は自己免疫疾患において重要な役割を果たします。
- 特定の自己抗体を特定することで、異なる疾患状態と相関させることができます。
- 従来の方法は、スループットと感度に制限がある場合があります。
- この方法では、複数の自己抗体を同時に分析することができます。
研究の目的
- 自己抗体の迅速なスクリーニング技術を開発すること。
- 自己抗体と疾患状態の相関関係を特定すること。
- マイクロアレイを用いた抗体検出の効率を向上させること。
使用した方法
- PBSによる抗原の2 mg/mLの濃度への希釈。
- 抗原印刷用の9本のピンを備えたマイクロアレイヤのセットアップ。
- IgGとIgM抗原を陽性対照として含めること。
- マイクロリットルの血清のみを使用して自己抗体をスクリーニングすること。
主要な結果
- 自己抗体検出のための抗原マイクロアレイの成功的な生成。
- スクリーニングにおける高スループット能力の実証。
- 様々な抗原に対する抗体の定量評価。
- 自己免疫疾患に関連する主要な自己抗体を特定する可能性。
結論
- 開発された方法は、自己抗体のスクリーニング能力を向上させます。
- 自己免疫に関するさらなる研究のためのプラットフォームを提供します。
- この技術は、自己免疫疾患の診断ツールの改善につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables multiplexed detection of IgG and IgM autoantibodies using minimal sample volumes, supporting early-stage target validation in autoimmune disease research. By providing quantitative, parallel readouts of autoantibody reactivity, it enhances predictive confidence in biomarker discovery and reduces reliance on low-throughput ELISA workflows. The two-color detection system improves assay efficiency and data consistency for immunoprofiling applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by profiling autoantibody reactivity against multiple antigens in parallel.
- Operational Value: Reduces sample consumption to microliters of serum, preserving limited clinical specimens for downstream analysis.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through simultaneous detection of IgG and IgM isotypes, clarifying immune complex formation mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible microarray slides with duplicate antigen spots for reliable signal quantification.
- Operational Value: Facilitates assay scalability through robotic printing of up to 162 antigens per slide, enabling high-content screening campaigns.
- Scientific Value: Produces quantitative MFI minus background readouts that allow comparison of autoantibody titers across sample sets.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables cross-species applicability with validated detection of both human and murine autoantibodies, supporting translational model consistency.
- Operational Value: Allows long-term storage of printed slides (up to one month), facilitating batch-to-batch assay reproducibility in preclinical studies.
- Scientific Value: Provides a platform for identifying autoantibody signatures linked to disease states, informing patient stratification strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, offering a reusable platform for immunoprofiling prior to functional assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling rapid screening of autoantibody reactivity patterns associated with disease phenotypes.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation and dual-isotype detection, ensuring consistent reagent performance.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence readouts (MFI minus background) that enable statistical comparison of antigen-specific responses.
- Translational Research: Connects discovery-phase autoantibody profiling to preclinical validation through cross-reactive detection in human and mouse systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a customizable microarray platform where antigen libraries can be rapidly reconfigured for new target panels without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false negatives through multiplexed, parallel detection.
- Operational Value: Enhances reproducibility via standardized printing, blocking, and washing steps that minimize technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early immunological risk assessment in autoimmune target programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on autoantibody prevalence and isotype distribution across sample cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microarray printing, serum handling, and fluorescence scanning instrumentation.
- Dependent on access to a robotic microarrayer with sonication capability and a dual-channel fluorescent scanner.
- Necessitates standardization of serum dilution, blocking buffer composition, and incubation conditions across users.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different antigen sources or species-specific secondary antibodies.
- Limited by the need for optimized PMT settings to balance IgG (SI three) and IgM (SI five) channel signals for accurate quantification.
