インフルエンザ抗原マイクロアレイを用いたウイルスサブタイプにわたる血清抗体の幅を測定

インフルエンザ抗原マイクロアレイは、わずか1マイクロリットルの小さな血液サンプル容量から300以上のインフルエンザ株に対して複数の抗体アイソタイプを同時に測定することを可能にする。マイクロアレイは、インフルエンザ株の抗原景観全体にわたってインフルエンザ抗体の幅のハイスループット測定を容易にします。インフルエンザ抗体を以前よりも詳細に特徴付ければ、特定の人がインフルエンザ感染を発症する理由を判断するのに役立ちます。

この抗原マイクロアレイ技術は、当研究室の35種類の病原体に適用されており、60,000個の抗原標的に対する抗体の測定と、世界中の感染症症例および健康なコントロールから採取された50,000個の血清検体から抗体を測定することができます。このテクニックを対面ワークショップで教えた結果、その技術を視覚的に実証できることは、その理解とパフォーマンスにとって非常に重要であることがわかりました。この手順のデモンストレーションは、アル・ジャシンスカスとラファエル・デ・アシス、私たちの研究室のプロジェクト科学者になります。

マイクロアレイプリンタを使用して抗原を印刷するには、384ウェルソースプレートからサンプルチャンネルに抗原を吸引し、直接接触およびキャピラリー作用を介して16パッドニトロセルロースコーティングガラススライドに抗原を堆積させることができる、少量マイクロアレイスポッティングピンを備えたプリンタを選択します。印刷ソフトウェアで、プレート数テキストボックスに使用するサンプルプレートの数を入力し、分析に使用するプレートタイプを選択します。ピン構成を選択し、原点オフセットをスライドの原点と、スライド上で印刷ピンが印刷を開始する位置との間の距離に設定します。

配列の設計タブで、配列のサイズと形状を定義し、印刷ピンがサンプルをピックアップして分配する方法のパラメータを選択します。ピンクリーニングとブロッティングプロトコルを設定し、サンプルブロックをスライドに印刷する順序を定義します。アレイソフトウェアは、各マイクロアレイ内の抗原の配置を記述する、アコードされたグリッドインデックスファイルを構築します。

目的のプロトコルで印刷ソフトウェアをプログラミングした後、印刷の実行を開始します。完了したら、プローブされていないマイクロアレイスライドを、デシケータキャビネットの防光ボックスに室温で置きます。マイクロアレイ上の抗体のセラをプローブするには、クリップを使用してマイクロアレイスライドパッド側をプローブチャンバーに取り付け、チャンバーをフレームに配置します。

スライドは簡単に壊れ、水分補給後の漏れを確認するため、スライドを組み立てる際には注意してください。必要に応じて、スライドを分解して再組み立てして、リークを修正します。1ウェルあたり100マイクロリットルの濾過ブロッキングバッファーでスライドを水分補給し、サンプルあたり100マイクロリットルのブロッキングバッファーで1〜100比でセラを希釈します。

次に、水分補給されたマイクロアレイスライドと希釈セラを室温で30分間、軌道シェーカーで毎分100〜250回転にインキュベートします。インキュベーションの最後に、二次回収フラスコで真空ラインに接続されたピペットチップを使用して、パッドに触れることなく各チャンバーの隅からブロッキングバッファを慎重に吸引し、パッドを乾燥させることなくすぐに希釈したセラをパッドに加えます。その後、湿ったペーパータオルを入れたトレイに覆われたフレームを入れて湿度を維持し、揺れるシェーカーの上で摂氏4度で一晩フレームをインキュベートします。

量子ドット共役二次抗体標識の場合、ちょうど実証したようにセラを慎重に吸引し、軌道シェーカーでそれぞれ5分間、1ウェルあたり100マイクロリットルの新鮮なTTBSバッファーの3回のスリーチでスライドをすすきます。次いで、スライドを量子ドット共役二次抗体の混合物でインキュベートし、その後、プロトコルに記載されているように3回洗浄し、ちょうど実証したように同じ技術を使用する。最後の洗浄後、慎重にチャンバーからスライドを取り出し、濾過された二重蒸留水でスライドをそっと洗い流し、各スライドを50ミリリットルのチューブに入れます。

その後、遠心分離によりスライドを乾燥する。マイクロアレイスライドの画像を取得するには、まずポータブルイメージャーをオンにし、イメージ化するスライドを慎重に撮像チャンバーのスライドホルダーに下向きに配置します。イメージング ソフトウェアを開き、[イメージの構成] タブで、適切なスライド構成を選択します。

画像制御タブで、適切な蛍光チャネルを選択し、セラの反応性に応じて露出と取得時間を調整します。次に、[キャプチャ] をクリックして、画像の取得を開始します。取得の終了時に、受託者マーカーの配向グリッドを使用して、配列のスポットを検出します。

スポットの強度を測定するには、ファイル情報パネルで gal ファイルをアップロードし、解析出力ファイルを保存するフォルダーを解析オプションセクションで指定します。イメージコントロールタブで、取得した画像の 1 つを開いて、数値化して[自動]を選択します。アレイ解析セクションで、ソフトウェアの指示に従って受託者テンプレートを作成します。

[バッチ分析] をクリックして、定量化する画像を含むフォルダーを選択し、作成した受託者テンプレートを選択します。ソフトウェアは、各画像を分析し、スポット強度を定量化します。次に、生データを分析して、抗原間および血清検体間の抗体結合を比較します。

本研究では、使用された二次抗体は、800ナノメートルで放射する量子ドットに結合したヤギ反ヒトIgGと、IgGおよびIgA抗体の多重検出のために585ナノメートルで放出される量子ドットに結合したヤギ反ヒトIgAであった。結果のヒートマップでは、高い表現を持つ臨床的に関連するサブタイプのみが、より高い数値の残りのサブタイプすべてを示すプラス記号でスペースを節約するためにラベル付けされました。血清IgAおよびIgGは、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ分子形態およびサブタイプによってグループ化された。

臨床サブタイプに対するヘマグルチニン・ヘッド群抗体の高特異性を実証し、ヘマグルチニン全体およびヘマグルチニン抗体を三共に含めたヘマグルチニン抗体全体の高い交差反応性を示す。マイクロアレイ上で測定されたインフルエンザ抗体応答は、ヘマグルチネーション阻害およびマイクロ中和アッセイを含む従来の技術によって確認することができる。この技術は、インフルエンザヘッド群に対する抗体のサブタイプ特異性と、インフルエンザ感受性に対するIgAおよびIgG抗体の相対的重要性に関する洞察を生み出した。

材料のどれも非常に危険ではありませんが、すべての人間の血清サンプルは、機関のバイオセーフティプロトコルに従って処理する必要があります。