ラット精巣挙筋の細動脈における無細胞層の可視化と定量化

この手順の全般的な目的は、生体内の細胞不含層（cell-free layer）の幅における時空間的な変動を定量化することです。この手法は、微小血行動態の分野における重要な疑問への回答に寄与し、微小循環におけるcell-philiaの役割をより深く理解するのに役立ちます。本手法の主な利点は、非常に時間がかかっていた従来の手動測定技術よりも、生体内のcell-philiaの幅を一貫性を持って、より簡便に定量化できる点にあります。

無細胞層幅の測定を開始する前に、無細胞層用のMatLabプリスクリプトファイルを実行します。次に、「ファイルを開く」をクリックして解析対象のビデオファイルを選択し、回転スライダーを調整して単一血管の壁を垂直に合わせます。必要に応じてズームスライダーを使用してズームレベルを調整してください。血管が適切な位置に配置されたら、「編集確定」をクリックし、「ROI設定」をクリックしてクロップし、関心領域を定義します。

整列された画像がポップアップウィンドウに表示されます。画像上の矩形領域を必要に応じて調整し、その領域をダブルクリックして関心領域（ROI）を確定させます。次に [Extract Images] をクリックすると、編集されたすべてのビデオフレームが連続したビットマップ画像として抽出され、選択したビデオファイルと同名のフォルダに保存されます。

細胞不含層（cell-free layer）の幅を測定するには、[Select Folder]をクリックし、画像が保存されているフォルダを選択します。最初の画像フレームがグレースケール画像パネルに表示され、同時に対応する輝度ヒストグラムが画像ヒストグラムパネルに表示されます。分析したい画像フレームをリストボックスから選択し、[Find Vessel Walls]をクリックして血管内壁を特定します。内壁は、2ピクセルにわたって光強度プロファイルのピークが暗から明へと移行する箇所として決定されます。

「median filter」にチェックを入れると、メディアンフィルタが画像に適用され、ごま塩ノイズが低減されます。「auto-contrast」にチェックを入れると、画像の輝度がデジタル調整され、コントラストが向上します。次に、リストボックスから閾値処理アルゴリズムを選択し、グレーレベルを2つのクラス（閾値より高いグレーレベルの白ピクセルと、閾値より低いグレーレベルの黒ピクセル）に分ける閾値を自動的に決定します。

細胞除去層幅の空間的変動を測定するには、ピクセル解像度ボックスにピクセル解像度を入力します。次に [Calculate] をクリックして細胞除去層幅の空間的変動を算出し、[Export. csv] をクリックして細胞除去層幅のデータを表形式でエクスポートします。

血管に沿った特定の解析ラインにおけるセルフリー層幅の時間的変動を測定するには、Temporal Variationをクリックし、フレームレート情報を入力してください。解析に使用する画像の開始フレームと最終フレームを、それぞれstart frameおよびlast frameボックスに入力します。解析ラインのスライドバーを調整して血管に沿った解析ラインの位置を選択し、グレースケール画像とバイナリ画像の両方に表示される解析ラインの位置を確認してください。

次に、「Calculate」をクリックして細胞不全層（cell-free layer）幅の経時的変化を算出し、「Export. csv」をクリックして細胞不全層幅のデータを表形式でエクスポートします。ここでは、ラットのクレマスター筋にある非分枝動脈を赤血球が流れる典型的な例を示しており、RBCコアと血管内壁の間に細胞不全層が観察されます。

これらの構成要素間の良好なコントラストは、無細胞層の幅の測定精度を確保するために不可欠です。画像解析の初期段階では、血管内壁の検出を行いました。血管に対して垂直な解析線に沿って光強度プロファイルを取得することで、2ピクセルの間で暗から明へと遷移するピーク位置を近似的に特定します。

続いて、画像しきい値処理アルゴリズムを用いてRBCコアの境界を検出し、CFL幅を算出します。細胞不含層（cell-free layer）内の赤血球は光透過率が異なるため、グレーレベルの差を2つのクラスに分類することができます。しかし、画像ヒストグラムにおける2つのピーク間の正確なしきい値の特定は、画質やコントラストの低さによって制限される場合があります。

赤血球とセルフリー層のコントラストを向上させるために、ブルーフィルターを使用することができます。これはこれらの画像においてより顕著であり、ブルーフィルターを用いることで赤血球コアの境界をより正確に特定できています。また、これらの画像でわかるように、しきい値設定アルゴリズムもセルフリー層の幅の測定に影響を与える可能性があり、異なるしきい値設定アルゴリズムによって赤血球コアの境界の特定結果が異なり、その結果、セルフリー層の幅にも差異が生じています。

生体内の細胞不含層（cell-free layer）の幅の測定は、画像の品質に非常に敏感です。したがって、手術を慎重に行い、適切な光学補助装置を使用して高品質な画像を取得してください。さらに、正確で一貫性のある細胞不含層幅の測定を確実にするためには、適切な画像しきい値処理アルゴリズムを選択することが不可欠です。