チックに誘導シグナルを研究するために、候補因子浸しビーズと組み合わせることで不浸透性の障壁の応用

この外科的介入の目的は、シグナル伝達分子が内側組織から側板中胚葉の細胞へ拡散するのを防ぎ、それが遺伝子発現に及ぼす影響を調べることで、ニワトリ胚における肢芽誘導のメカニズムを解明することです。この手法は、肢芽形成の開始を制御する誘導シグナルは何かという、発生生物学における重要な疑問への答えを得るのに役立ちます。本手法の利点は、ニワトリ胚が外科的操作に適しており非常に堅牢であることに加え、操作を行っていない対側の対照肢芽が非常に有用な内部コントロールとして機能することです。

Susan Wildeが手順を実演します。まず、厚さ0.013 mmのアルミホイルを1 cm四方に切り、70% ethanolで拭いて滅菌します。次に、その正方形のピースを6 cmの滅菌済みプラスチック製ペトリ皿の上に置きます。

静電気による付着を防ぐため、蓋を捨て、同じホイルからディッシュ用の新しい蓋を作成します。次に、倍率を1.6xに設定した生物顕微鏡のステージグラティキュール上にペトリディッシュを置きます。15番の小型メスを使用し、幅1.3 mm、長さ2 mmのホイルのストリップを切り出します。

2本の4番時計用ピンセットを用いて、フォイルストリップを分離させます。次に、フォイルバリアの中央を直角に折り曲げ、ヒンジのような形状にします。ペトリ皿の中央にバリアを配置し、片側を皿に密着させ、もう一方を皿の外に向けて立てます。手術日までに20個以上のバリアを準備しておいてください。

ディッシュにアルミホイルの蓋を被せ、バリヤーを振動や接触のない場所に保管します。卵を横にした状態で、タイプAAの強力鑷子（せつし）をしっかりと握り、空気に満ちた気室がある卵の鈍端を、もう一方の手で卵を固定しながら、制御された突き刺し動作で貫通させます。このとき、内殻膜が確実に破れていることを確認してください。

次に、卵を両手で持ち、水平軸に沿って180度回転させます。続いて、約5 cm四方の透明なテープを切り、卵の最上部に密着して貼り付けます。これは、卵を開いた際に卵殻が胚の上に崩れ落ちるのを防ぐためです。カーブ付きのハサミを使用し、卵の最上部中央にある卵殻とそれに付随する内細胞膜を、慎重に切り開きます。

ハサミの片方の刃で、胚の上に空気が入るように卵に非常に小さな穴を開けます。ハサミを使用して、殻の穴を直径約1 cmの円形に広げます。この大きさの殻の破片を卵から取り除きます。

卵の穴を、約 5 cm 四方の透明なテープで覆います。テープを穴の縁だけに貼り付け、残りの部分は浮かせておきます。これにより、浮かせておいたテープを掴むことで、簡単に卵の封印を解除できるようになります。

インキュベーターからステージ15の胚を取り出し、倍率3.2倍以上に設定した実体顕微鏡下の卵置き台に卵を置きます。次に、上の透明テープを剥がします。鋼製マイクロナイフを用いて、胚の右側にある体節26-32に隣接する卵膜および側板中胚葉を切開します。

5番のマイクロ鉗子でバリアの一端をつかみ、バリアをひねりながら、自由端を切開部に挿入します。速やかに、卵を透明テープで密封し、インキュベーターに戻します。バリアと併せてビーズを挿入する場合は、まず、付随するテキストプロトコルに従って、レチノイン酸を浸漬させたビーズを準備しておきます。

次に、ビーズと5番のマイクロピンセットを用いて、切開部位の遠位側にある側板中胚葉の切断面にビーズを挿入します。その後、ビーズの近位側の切開部にバリアを挿入します。卵を封鎖し、速やかにインキュベーターに戻します。

バリアなしでビーズを挿入する場合は、長い切開は行わないでください。代わりに、ビーズを配置する位置で卵黄膜を貫通して側板中胚葉まで小さな切開を入れてください。その後、ビーズを5番マイクロピンセットで掴み、側板中胚葉の切開孔に挿入します。

ピンセットの閉じ端を用いて、さらに少し深く押し込みます。インキュベーターからウィンドウステージ10の胚を取り出し、3.2倍以上の倍率に設定した実体顕微鏡下の卵置きに卵を配置します。次に、鋼製マイクロナイフを用いて、胚の尾側にある原条の外側で、体節と平行に、体節約6個分の長さにわたって、卵黄膜と側板中胚葉を切開します。

次に、5番のマイクロピンセットを用いて、ペトリ皿から突き出している端からバリアを掴み、手をひねってバリアの自由端を切開部に挿入します。速やかに透明テープで卵を密閉し、インキュベーターに戻します。バリアを用いずにビーズを挿入する場合は、ビーズを配置する位置の卵黄膜を貫通し、側板中胚葉まで小さな切開を加えます。

次に、ビーズと5番のマイクロピンセットを用意し、側板中胚葉の穴に挿入します。最後に、ピンセットの閉じた先端でさらに少し押し込みます。ここでは、ステージ15の胚における、体節26-32の肢原基レベルでのバリアの位置を示しています。

この障壁により、処置を行った側の肢芽領域ではFhf10およびFhf8の発現が消失し、処置を行っていない左側ではこれらの発現が見られました。しかしながら、処置を行った側においても、ステージ19とステージ23の両方でTbx4の発現が観察されました。このことは、Tbx4の発現だけでは、lpmから後肢の伸展を開始させるのに十分ではないことを示唆しています。

ステージ15において、レチノイン酸を浸漬させたビーズをバリアの遠位側に配置すると、Tbx4、Fgf10、およびFgf8は、左側のコントロール側と同様に、処置側でもすべて発現します。したがって、正常な発生過程において、肢芽の成長が開始される前には、体節からのレチノイン酸が不可欠であることがわかります。このビデオを視聴することで、不透過性バリアと候補因子を浸漬させたビーズを用いて、ニワトリ胚の肢芽開始を誘導シグナルがどのように制御しているかを研究する方法について、十分に理解できるはずです。