Name: チックに誘導シグナルを研究するために、候補因子浸しビーズと組み合わせることで不浸透性の障壁の応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶ チック胚における不浸透性バリアと候補因子浸しビーズを用いた外科的手法により、肢芽誘導におけるシグナル伝達のメカニズムを解明する方法。Tbx4、Fgf10、Fgf8の発現解析により発生生物学の理解を深める。

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この作業はMRC助成金のMC.PC_13052によって資金提供されました。

<ol><li>Murillo-Ferrol, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causal+study+of+the+earliest+differentiation+of+the+morphological+rudiments+of+the+extremities.+Experimental+analysis+on+bird+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anat+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos.</a> Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).</li>
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<li>Stephens, T. D., McNulty, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+metameric+pattern+in+the+development+of+the+chick+humerus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus.</a> J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).</li>
<li>Strecker, T. R., Stephens, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerves+do+not+play+a+trophic+role+in+limb+skeletal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Teratology%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis.</a> Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).</li>
<li>Riddle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).</li>
<li>Ng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limb+identity+gene+Tbx5+promotes+limb+initiation+by+interacting+with+Wnt2b+and+Fgf10%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10.</a> Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).</li>
<li>Takeuchi, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx5+and+Tbx4+trigger+limb+initiation+through+activation+of+the+Wnt%2FFgf+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade.</a> Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).</li>
<li>Lee, J., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+and+pattern+formation+in+the+developing+chick+wing%3A+SEM+and+quantitative+studies+of+early+effects+on+the+apical+ectodermal+ridge+and+bud+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth.</a> J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).</li>
<li>Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+application+to+chick+wing+buds+leads+to+a+dose-dependent+reorganization+of+the+apical+ectodermal+ridge+that+is+mediated+by+the+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme.</a> Devel. 106 (4), 691-705 (1989).</li>
<li>MacCabe, J. A., Parker, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+gradient+of+a+morphogenetic+substance+in+the+developing+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb.</a> Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).</li>
<li>Summerbell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zone+of+polarizing+activity%3A+evidence+for+a+role+in+normal+chick+limb+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis.</a> J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).</li>
<li>Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+reprogramme+pre-bud+mesenchyme+to+give+changes+in+limb+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern.</a> Devel. 100 (4), 723-733 (1987).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ニワトリ胚における四肢芽の形成を防ぐための不浸透性バリアの使用について説明します。この手法には、いくつかの重要な手順があります。予備実験の結果、 9、10 で使用されたヒンジ状のバリアは、まっすぐなバリアよりもはるかに胚内に所定の位置に留まることがわかりました。バリアの遠位平らな面は卵黄膜にくっつき、バリアを所定の位置に保持します(図2C')。プロトコルステップ1.6で説明されているように、アルミホイルからヒンジ形状のバリアを慎重に準備することは、操作の成功に不可欠です。2番目の重要なステップは、胚を手術する前に、ウィンドウ化と病期分類の後、卵子がインキュベーターから長時間放置されないようにすることです。私たちの経験では、胚は、手術が実施されたときに孵化温度またはそれに近い温度であれば、手術をよりよく生き残ります。したがって、良好な生存率を確保するために、できるだけ早く手術を実行し、卵を速やかに再密封する必要があります。多くの研究者は、卵子をインキュベーターに戻す前に、顕微手術後に胚に抗生物質を一滴加えます。液体の存在により、バリアが所定の位置にしっかりとくっつくのを防ぎました。抗生物質を追加すると、配置後にビーズが取り除かれる可能性もあります。したがって、感染を避けるために、抗生物質を使用しないこと、迅速な操作、および器具の清浄度を良くすることをお勧めします。手術のすべての段階の後に70%エタノールで器具を拭くことは、バリアまたはビーズの両方が鉗子に付着する原因となる可能性のあるビテリン膜との接触によって器具が粘着するのを防ぐために不可欠です(プロトコルステップ3.1.2.2を参照)。使用されるビーズの種類はどちらも、手術後にずれる可能性があります。翌日、バリアの位置を確認したところ、バリアを通してビーズが所定の位置に残っているかどうかを確認することはできませんでした。ビーズが脱落した場合、翼芽の成長は救出されませんでした(表1)。ビーズを埋め込むときにビーズで液体を移すことを避けることは、ビーズがLPMの切断面に付着しやすくなることを意味します(プロトコル2.3.2.3を参照)。最後に、胚が採取直後に固定されていることを確認することは、その後の遺伝子発現解析を良好に行うために重要です(プロトコルステップ4.2を参照)。
このプロトコルは、四肢芽の開始を防ぐためにバリアを使用した以前に発表された実験を変更し、バリアの特定の最適な幅を定義し、バリアとビーズ配置の組み合わせとそれに続く遺伝子発現分析を導入します。安価ですべての研究室で容易に入手できる従来のアルミホイルを使用すると、以前にタンタルホイルを使用していたものと同等の結果が得られることがわかりました。in situ ハイブリダイゼーションを実行するときは、ホイルを胚に残すことができますが(図2C')、ホイルの鋭いエッジが胚に損傷を与えるのを防ぐために、複数の胚が処理されている場合は、通常、ホイルを除去します。パイロット研究では、脚領域のバリアの幅が特に重要であることが実証されました。当初、試されたバリアは短すぎて、脚の芽の成長は防止されませんでした。1.2〜1.3 mmは、脚のつぼみの成長を完全にブロックするバリアの最適な幅です。芽の成長を防ぐために正確に配置できる最も狭い翼の障壁は、最高の生存率をもたらします。これは0.5〜0.7mmまで狭くすることができます。ただし、少し幅の広い障壁は、配置の精度が少し低いため、翼芽の成長を完全にブロックする可能性が高くなります(0.7〜1 mmを使用しました)。切開を行う際の血管の回避は、翼芽レベルのバリアにとって重要です。半透性バリアは、ニワトリの手足の芽を二分するために以前に使用されてきました。MacCabe and Parker, 1976 および Summerbell, 1979 はどちらも、それぞれ 0.45 μm と 0.8 μm の孔径のフィルターを使用しました 16、17。 彼らは、拡散性信号がフィルターの細孔を通過でき、半透性バリアを使用して得られた結果は、バリアが存在しない四肢芽と不浸透性タンタル箔バリアのある四肢芽の中間にあることを報告しました。このプロトコルは、さまざまな細孔サイズの半透膜バリアを使用して、サイズに基づいて候補信号を区別したり、信号拡散のダイナミクスを変更したりするように適応できます。
このプロトコルには、主にモデル生物自体に関連するさまざまな制限があります。このような技術は、四肢の発達におけるさらなる問題や、脊椎動物の胚形成に関するその他の問題を調査するために使用できます。但し書きは、問題の臓器/領域は、ニワトリの胚が介入にアクセスできるときに発達している必要があるということです。バリアを配置する必要がある領域に大きな血管が存在するため、ステージ 13 または 14 以降のバリアの配置は技術的に困難になります。バリアの配置中に大きな血管が切断されると、胚の死亡を引き起こす可能性があります。転写因子 Tbx5 と Tbx4 がLPMで最初に誘導される時期の調査は、後にそれぞれ翼または脚の芽の反対側に終わるバリアを配置できる最も初期の段階によって制限されました。原腸陥入に近い初期段階で Tbx 遺伝子誘導をブロックしようとすることは啓発的かもしれません。推定翼領域にバリアを正常に配置できた最も早いのは、ステージ 8 と脚領域のステージ 10 でした。このプロトコルは、その後の急速な成長がバリアを置き換え、結果がバリアの初期位置にのみ関連するため、おそらく四肢芽段階を超えた遺伝子発現の研究には適していません。
この文脈でニワトリ胚の限界を関連付けると、他の脊椎動物モデル生物に対するその利点はたくさんあります。ひよこ胚は、脊椎動物の胚へのこのタイプの物理的介入に非常に適した動物モデルです。胚は比較的大きく、卵の殻から簡単にアクセスできます。胚に戻ってさらなる実験(例えば、 ビーズ 18 またはバリアの除去)を行うか、単にテープウィンドウを取り外すことで進行状況を確認することができます。ライブイメージングやタイムラプスイメージングを含めることができます。初期段階の胚での手術に特に適した鶏卵をウィンドウする方法について説明します。四肢研究の場合、各生物学的複製の理想的な内部対照として機能する、すべての実験に対側対照肢があることは非常に重要であり、役立つ。
手足の成長を防ぐために不浸透性バリアを使用することと、シグナル伝達分子に浸したビーズの組み合わせは、これまで報告されていません。このような介入後の mRNA 発現の分析も新規です。これらの技術により、四肢特異的転写因子Tbx5およびTbx4がLPMで誘導される時期という難しい問題を分析し、その後、四肢芽の開始前に、LPMにおけるこれらのTbx遺伝子の存在は、Fgf10転写の活性化と四肢芽の成長の開始に十分ではないことを示すことができました。図2G、2D、 および2Eは、これらの調査結果をよく示しています。図2Gのステージ10でのバリアの挿入後のTbx4発現の欠如は、Tbx4の誘導後のステージ15でのバリア挿入後の2Dおよび2Eでの存在とはまったく対照的です。RAに浸したビーズの移植は、バリア挿入後の四肢芽開始の救助を促進したため、四肢芽の成長が始まる前に、体節からのRAがLPMに不可欠であることを示しています。このような技術は、四肢の発達におけるさらなる問題だけでなく、脊椎動物の胚形成に関する他の問題も解決するために使用できます。脳、目、体幹の領域が適している可能性があります。

クラシック胎生学者は伝統的に胚発生を制御するメカニズムを調べるために物理的技術を採用します。 1960年代と1970年代に研究者らは、胚形成の間、誘導信号の重要性を実証するために、発生中の胚の組織の間に挿入された不透過性の障壁を使用する技術を開発しました。私たちの関心は肢芽の伸長の前にどのようなイベント脊椎動物の四肢の開発に、特にあります。例えば、バリアの挿入は、対、無操作側に正常に進行させながら、ニワトリ胚の片側に発生肢芽の成長を防止することができます。これらの障壁が変化するために使用される材料。例えば、マイカ板1とタンタル箔2。これらの障壁は、効果的に、近軸中胚葉から形成された体節から、から肢芽の形態、側板中胚葉（LPM）を分離します。外科的移植する技術は、その密接な関係のウィットを実証します肢芽の開始はLPM 3 4で発生することがある場合は時間体節が不可欠です。 80年代と90年代に発達生物学者は、発生過程の制御に不可欠である拡散性シグナル伝達分子を発見しました。これらのシグナル伝達分子に浸したビーズは、胚の特定の領域に移植し、胚発生に変化を生み出すことができます。ニワトリ胚に注入し、数字5の鏡像複製を生成することができる場合、例えば、イオン交換ビーズによって取り込まレチノイン酸（RA）は、24時間にわたって放出されます。 FGFタンパク質を含有するヘパリンアクリルビーズは、肢のLPM 6から肢芽の伸長を開始することができます。 さらに最近では、マウスや魚の遺伝学は、（7件）新たな時代に、脊椎動物の四肢開始の研究をとっています。肢芽の開始に先立って体節でRAの存在は、LPによって必要不可欠拡散信号であることを十分な証拠がありますMは、四肢の出芽を開始します。私たちは、肢芽開始の頃LPMにおける遺伝子発現に対する障壁注入の効果を分析するためにニワトリ胚のアクセシビリティと実験的な堅牢性を悪用したかったです。本手法の新規適応はバリアによってブロックされた外因的に供給候補内因性因子に対する障壁にバリアをビーズの配置、横方向と軸方向の組織からの遮断信号を組み合わせることです。次のプロトコルは、肢芽の誘導および開始のメカニズムを引き出すために開発されたものです。 肢芽の開始を研究することは、早期段階の胚を使用することを意味します。最初の皮下注射針で気嚢を通してアルブミンの一部を除去することにより、多くの研究者ウィンドウの鶏の卵。卵黄の上に位置する胚は、その後、卵の下位に位置します。これは、エレクトロポレーションのようないくつかの技術のために有利であるが、胚の外科的処置が所望される場合に不利であることができます。我々は可能な限り卵の開口部に近いが利点であるとして、胚を持つ見つけます。 質問は、脊椎動物の肢芽の誘導と開始を制御する信号についてのままであり、以下のプロトコルは、それらに対処するのに適しています。私たちは、早い段階12 8より段階でニワトリ肢芽の伸長を防止するための障壁を挿入するためのプロトコルを開発する最初のものです。これらのプロトコルの修正版もアクセス可能な誘導組織が誘導されている原基に隣接している誘導性手がかりの起源とタイミング上の他の質問に対処するために使用することができました。胚の領域は、関連する発達段階でのアクセスが設けられて、その後、バリアは2つの組織の間に配置することができ、開発における必然的な変化を研究しました。例としては、脳の発達、軸延長や、肝臓や腎臓の誘導のような可能性の臓器の開発に見ることができます。

<table><tbody><tr><td>デュモン No. 5 時計職人用鉗子、x2</td><td>ファイン サイエンス ツール&nbsp; www.finescience.de</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>デュモン No. 4 時計職人用鉗子、x2</td><td>ファイン サイエンス ツール&nbsp; www.finescience.de</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>デュモン ストロング 鉗子、AA 型</td><td>ファイン サイエンス ツール&nbsp; www.finescience.de</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>長さ 2.5 cm の刃付き湾曲ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;www.finescience.de</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>鈍い端湾曲した鉗子、約0.5&nbsp;cm長い</td><td>ファインサイエンスツール www.finescience.de</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>スチールピン、幅0.2mm</td>ファイン<td>サイエンスツール&nbsp; www.finescience.de</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>砥石、正方形</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp; www.finescience.de</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp; www.finescience.de</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>クリアテープ、50 mm x 66&nbsp;m</td><td>www.5staroffice.com</td><td>295985</td><td></td></tr><tr><td>FGF4タンパク質</td><td></td><td></td><td>クリフ・タビンからの贈り物。</td></tr><tr><td>オールトランスレチノイン酸</td><td>シグマ www.sigmaaldrich.com</td><td>R2625-50MG</td><td>光から保護することを忘れないでください。</td></tr><tr><td>BMS 493</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>B6688-5MG</td><td></td></tr><tr><td>メス刃 No. 15</td><td>www.swann-morton.com</td><td>cat no. 0105</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Blue, アフィニティークロマトグラフィーゲル</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>153-7301</td><td>タンパク質送達用ビーズ.</td></tr><tr><td>AG1-X2 イオン交換樹脂</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>140-1251</td><td>RAまたはBMS 493を送達するためのビーズ。</td></tr><tr><td>卵用インキュベーター</td><td>Memmert www.hce-uk.com</td><td>LAB128</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>P6148-1KG</td><td>有害、刺激性、腐食性。完全な防護服を着用して、ヒュームフードでパウダーを取り扱います。</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シグマ</td><td>www.sigmaaldrich.com 32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース</td><td>Gibco</td><td>www.thermofisher.com 41965-039</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Fisher Scientific webshop.fishersci.com</td><td>D/4121/PB08</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>双眼顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ www.leica-microsystems.com</td><td>MZ6</td><td>が M60</td></tr><tr><td>チキンエッグ</td>に置き換えられました <td>ヘンリー・スチュワート &Co Ltd sales@medeggs.com</td><td></td><td>ブラウンエッグ</td></tr></tbody></table>

チックに誘導シグナルを研究するために、候補因子浸しビーズと組み合わせることで不浸透性の障壁の応用

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

ニワトリ胚は、直接的な方法で発達質問を分析するために使用することができる優れた脊椎動物のモデルを提供します。外科的介入後のアクセシビリティと堅牢性が重要な実験的な強みです。マイカ板は、ニワトリ肢芽開始1を防止するために使用される最初の障壁でした。翼の芽や脚の芽の誘導およびまたは開始に不透過性障壁としてアルミ箔を使用するプロトコルが記載されています。我々は、バリアによってブロックされた外因的に供給候補内因性因子への障壁にビーズ配置横でこの技術を兼ね備えています。結果は、その後の遺伝子発現のインサイチュハイブリダイゼーションを用いて分析します。私たちの主な焦点は、誘導にレチノイン酸シグナル伝達およびニワトリ胚の前部と後肢の後に開始の役割にあります。私たちは、BMS 493（レチノイン酸受容体（RAR）の逆アゴニスト）は、バーの効果を模倣するために側板中胚葉（LPM）に移植されたビーズを浸し使用しますRIERは体節（レチノイン酸（RA）のソース）と肢芽が成長するからLPMの間に配置されました。これらのプロトコルの修正版は、誘導手がかりの起源とタイミング上の他の質問に対処するために使用することができました。ニワトリ胚の領域は、関連する発達段階でのアクセスが提供される、バリアは2つの組織の間に配置することができ、開発における必然的な変化を研究しました。例としては、肝臓や腎臓の誘導として、脳の発達、軸延長にと臓器の開発に見ることができます。

上記の詳細なプロトコールは、西本らに用いられる方法を説明します。 、2015年論文は、ニワトリ胚の前部と後肢の両方で肢芽の誘導と開始を研究しています。前肢芽の伸長を防ぐために、不浸透性の障壁を挿入し、次の結果は、以前に1、2、9しかし脚芽開始1を防ぐ障壁を記述する唯一の研究がなされている公開されています。西本らから後肢のデータ。 2015年は、バリア挿入、次のmRNA発現の研究​​の代表的な結果として、ここで提示されています。 LPMでTbx4の発現は、後肢伸長を開始するのに十分なされていません。 図2BおよびC（ 表2）は、ステージ15（ 図2A）でそのバリア挿入が（プロトコル3.2を参照）の両方FGF10につながる表示しますそして、FGF8の発現が運営右側に（括弧で表記）脚芽領域に不在です。無操作左側と比較してください。しかし、Tbx4発現が操作側（ 図2DおよびE）にステージ19とステージ23の双方で観測されます。我々は、単独でTbx4発現がLPMから後肢伸長を開始するのに十分ではないと結論付けます。ニワトリにおける他の研究は、TBX遺伝子発現が前肢芽形成12,13を開始するのに十分であることを示唆しています。 図2Cは、「バリアが胚ポスト固定の脚部の領域に埋め込まれたどのように見えるかを説明するために含まれています。例障壁の大部分では前in situハイブリダイゼーション（プロトコル4.3） 中に除去しました。 体節からRAはFGF10誘導肢芽O前にLPMに不可欠ですutgrowth： 図3Aは、ステージ15（プロトコル3.2.1.3）に挿入障壁にRA浸漬ビーズ遠位の添加を示す概略図です。 （アスタリスクで示される）この操作肢芽の伸長、彼らがコントロール左側にあるように芽で表現されている操作右側とTbx4、FGF10とFGF8上で観察されるに続いて（ 図3B、CおよびD、 表2） 。したがって、LPMにRAの添加は障壁と肢芽開始進行の影響を克服します。私たちは、肢芽の伸長を開始する前に、体節からの正常な発達のRAにLPMに不可欠であると結論付けています。その結果後肢芽は、制御側のものよりも一般的に小さくなっています。これは、野生型の状況と同等でないというLPMにRAの用量に起因する可能性があります。 RAの用量が高すぎるとアピカル外胚葉リッジ（AER）を短縮することができ、小さな芽を生じます14、15。 LPMでのRA（体節から）は、通常の肢芽の開始のためにRAR、BMS 493の逆アゴニストを必要としていることを確認するために、使用されました。ビーズは、ステージ15で脚領域LPM（プロトコル3.2.1.4を参照）（ 図3E）に注入されます。 FGF10の発現が制御側（; 表3、 図3F）に比べて小さい後肢芽で、その結果、LPMでBMS 493ビーズの次のアプリケーションをダウンレギュレートされます。制御DMSOビーズは、これらの欠陥（; 表3、 図3Gおよび3H）を引き起こしません。 BMS 493適用後に観察された欠陥はバリア操作によって誘導されるものよりも穏やかです。 すなわち、FGF10 は依然として発現され、肢芽が形成されています。 BMS 493の効果は、ビーズの周りに局所的に制限され、AXIによって生成された全てのRAをアンタゴナイズすることができないかもしれないので、これは可能性がありますアル組織。 初期の軸方向の信号は後でTbx4エクスプレス LPMセルを指定します 。 LPMは将来の脚形成領域にTbx4を表現する能力を取得したとき私たちは、テストしました。バリアがその後脚芽の伸長を阻止することを挿入することができる最も早い段階では、我々はステージよりも前の段階で近軸中胚葉と推定される脚部との間に挿入12.障壁を障壁を挿入するためのプロトコルを開発する最初のものであるステージ10でありますステージ10でのLPMステージ10における軸方向の組織からの信号は以降の発現に必要であることを示唆し、脚形成LPM（ 図2F及び2G、 表2）のブロック脚芽形成とTbx4の発現（プロトコル3.4を参照してください）後肢LPMでTbx4。後でバリア挿入がTbx4の発現を可能にする図2DおよびEでこの結果を比較確立されます。さらに、我々は、この軸方向の信号はRARの逆アゴニストはTbx4の発現を減少させるかどうかを観察することによってRAかもしれないかどうかを試験しました。ステージ10（プロトコル3.4.1.3を参照）で後肢LPMに配置されたBMS 493ビーズをDMSOに浸したコントロールビーズがTbx4式（ 図2Jおよび2K）には影響しません一方、Tbx4式 （ 図2Hおよび2I）をダウンレギュレートします。一緒に、これらの結果は、軸組織からのRA信号を積極後肢LPM 7にTbx4を調節することにより、四肢誘導を調節するモデルをサポートしています。 術後死： 表1、表2、表 3は、術後、収穫前に死亡したニワトリ胚の数を含む実験結果の詳細を与えます。一部の死亡は、この種のマイクロサージェリーの後に予想されます。瀕死の数字は保つことができます<html>楽器が汚れていないことを確認することによって最小限に、卵の穴は、胚は、この最後の点の操作に連動して、最小限の時間のための粘着テープシールの保護なし左とされていることを、最小サイズ必要です可能な限り迅速に行われます。これらの操作はいずれも、非常に時間がかかりませんが、ビーズや障壁に関係する操作は、もう少し時間がかかります。これらの措置にもかかわらず、操作は最も初期の段階で行われ、翼の地域のものは死をもたらす可能性が高いです。死による失血につながる可能性四肢形成領域及びこれらの血管の偶発的な破裂の周りに大きな血管があります。我々卵がステージ8または9で開かれたことがわかり、その胚に操作されていない、多くの場合、翌日までに死んでしまいます。したがって、これらの問題に対する唯一の解決策は、実験の多数を行うことです。 D / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; 推定的レッグレベルでのバリアまたはビーズの挿入を次の 図2. マーカー遺伝子発現の変化。 （A）ステージ15胚における推定脚レベル（体節26-32）で示す概略図バリア位置（緑の線）。 （B - EおよびG）操作胚上WISH分析。脚部領域は（カッコ）に概説されています。 （B）FGF10発現を操作LPMには存在しないが、強い発現が左側芽において検出されます。 （C）FGF8発現にはAERがありません示唆し、運営側には存在しません。 （C &#39;）の障壁が取り除かれた前に、同じ胚。 （D）Tbx4は、制御芽と同じ吻側-尾側レベルでLPMで表現されています。 （E）Tbx4発現は肢の成長の欠如にもかかわらず、右脚領域に維持されます。 （F）段階の模式図<html>推定脚レベルでのバリア位置（緑の線）を示す10ニワトリ胚。 （G）Tbx4式が運営右LPM（ブラケット）には存在しません。 （H）推定脚レベルでBMS 493ビーズの位置（紫円）を示すステージ10ニワトリ胚の模式図。 （I）Tbx4式は、BMS 493（J）コントロールDMSOビーズ位置（灰色の円）を示すステージ10ニワトリ胚の模式図で処理した後の操作右側にダウンレギュレートされます。 （K）Tbx4はDMSOのみで処理した後の制御左側のと同様のレベルで操作右側に表現されています。この図7から変更されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> D / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; 図3. RA救助肢芽の不在は、バリア挿入によるレッグバド伸長する前にLPMに必須です。 （A）推定脚レベル（体節26-32）とRA-浸したビーズ（赤い円）でバリア位置（緑の線）を示す概略図。 （B - D）（アスタリスクで示す）RA救出脚芽伸長。 （B）Tbx4式は、非手術側に類似救出脚芽に存在しています。 （C）FGF10を救出戦で発現している非手術側に似て出芽します。 （D）FGF8は救出右脚芽のAERで表現されています。 BMS 493ビーズ（紫円）はステージ15の胚の推定脚LPMに入れたところ（E）の回路図を示します。 （F）FGF10の発現が運営右側にダウンレギュレートし、足の芽は、BMS 49以下の小さいです3治療。ビーズは、アスタリスクを付しています。 （E）から（G）同様の概略図、制御DMSOビーズ（灰色の円）の位置を示します。 （アスタリスクで示す）（H）DMSOビーズは、FGF10の発現や脚の芽の大きさに影響を与えませんでした。この図7から変更されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ステージバリア置か（+ビーズ）* </td><td> 番号操作 </td><td> 行方不明ウィング** </td><td> 現在ウィング** </td><td> 数の死者 </td></tr><tr><td>ステージ12-14 </td><td> 40 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 15 </td></tr><tr><td>ステージ8/9 </td><td> 65 </td><td> 23 </td><td> 0 </td><td> 42 </td></tr><tr><td>ステージ12-13（FGF4ビーズ） </td><td> 41 </td><td> 7（ビーズ不足しています） </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td>ステージ12-13（RAビーズ） </td><td> 75 </td><td> 9（ビーズ不足しています） </td><td> 32 </td><td> 34 </td></tr><tr><td>ステージ13（コントロールビーズ） </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="5">体節15-20と側板中胚葉との間に配置された* 0.7〜1ミリメートル箔障壁。 0.35 mg / mlでFGF4ビーズ。 0.05〜0.1 mg / mlでのRAビーズ。 </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSOコントロールビーズ。 </td></tr><tr><td colspan="5"> **ニワトリ胚の固定台21-23 </td></tr></tbody></table> 表1.ウィングレベルのバリアとビーズ実験の成果。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ステージバリア置か（+ビーズ）* </TD&gt; <td> 番号操作 </td><td> 行方不明の脚** </td><td> 脚存在** </td><td> 数の死者 </td></tr><tr><td>ステージ12-15 </td><td> 43 </td><td> 39 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td>ステージ10月11日</td><td> 23 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> 7 </td></tr><tr><td>ステージ15（FGF4ビーズ） </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td>ステージ15（RAビーズ） </td><td> 18 </td><td> 0 </td><td> 18 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5">体節26-32と側板中胚葉との間に配置された* 0.7〜1.3ミリメートル箔障壁。 0.35 mg / mlでFGF4ビーズ。 0.05〜0.1 mg / mlでのRAビーズ。 </td></tr><tr><td colspan="5"> **ニワトリ胚の固定台18-24 </td></tr></tbody></table> 表2脚レベル障壁とビーズ実験の成果。 <table borデア= &quot;1&quot;のfo：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;のfo：キープで-next.within-ページ= &quot;常に&quot;&gt; <tbody><tr><td> 番号操作 </td><td> 脚は小さな芽 </td><td> 脚は少し小さな芽 </td><td> 脚芽通常のサイズ </td><td> 数の死者 </td></tr><tr><td> BMS 493ビーズ* </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> 12 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> DMSOビーズ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 2-3ビーズを5mgに浸し/ミリリットルBMS 493は、脚のレベルで右のステージ14-15 LPMに入れました。 </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSOに浸し** 2-3ビーズだけでは足のレベルで右ステージ15 LPMに入れました。 </td></tr><tr><td colspan="5">ニワトリ胚は段階で固定17-19。 </td></tr></tbody></table> 表3脚レベルBMS 493ビーズ実験の成果。

>jove_content<手足の形成に必要なニワトリ胚の本体軸と脇腹の組織間の誘導イベントを阻止するために不透過性バリアを使用するプロトコルが説明されています。候補誘導性シグナルに浸したビーズは、バリア配置の影響を克服するために使用され、遺伝子発現の解析によりこれが確認されています。

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

この外科的介入の目的は、シグナル伝達分子が内側組織から側板中胚葉の細胞へ拡散するのを防ぎ、それが遺伝子発現に及ぼす影響を調べることで、ニワトリ胚における肢芽誘導のメカニズムを解明することです。この手法は、肢芽形成の開始を制御する誘導シグナルは何かという、発生生物学における重要な疑問への答えを得るのに役立ちます。本手法の利点は、ニワトリ胚が外科的操作に適しており非常に堅牢であることに加え、操作を行っていない対側の対照肢芽が非常に有用な内部コントロールとして機能することです。Susan Wildeが手順を実演します。まず、厚さ0.013 mmのアルミホイルを1 cm四方に切り、70% ethanolで拭いて滅菌します。次に、その正方形のピースを6 cmの滅菌済みプラスチック製ペトリ皿の上に置きます。静電気による付着を防ぐため、蓋を捨て、同じホイルからディッシュ用の新しい蓋を作成します。次に、倍率を1.6xに設定した生物顕微鏡のステージグラティキュール上にペトリディッシュを置きます。15番の小型メスを使用し、幅1.3 mm、長さ2 mmのホイルのストリップを切り出します。2本の4番時計用ピンセットを用いて、フォイルストリップを分離させます。次に、フォイルバリアの中央を直角に折り曲げ、ヒンジのような形状にします。ペトリ皿の中央にバリアを配置し、片側を皿に密着させ、もう一方を皿の外に向けて立てます。手術日までに20個以上のバリアを準備しておいてください。ディッシュにアルミホイルの蓋を被せ、バリヤーを振動や接触のない場所に保管します。卵を横にした状態で、タイプAAの強力鑷子（せつし）をしっかりと握り、空気に満ちた気室がある卵の鈍端を、もう一方の手で卵を固定しながら、制御された突き刺し動作で貫通させます。このとき、内殻膜が確実に破れていることを確認してください。次に、卵を両手で持ち、水平軸に沿って180度回転させます。続いて、約5 cm四方の透明なテープを切り、卵の最上部に密着して貼り付けます。これは、卵を開いた際に卵殻が胚の上に崩れ落ちるのを防ぐためです。カーブ付きのハサミを使用し、卵の最上部中央にある卵殻とそれに付随する内細胞膜を、慎重に切り開きます。ハサミの片方の刃で、胚の上に空気が入るように卵に非常に小さな穴を開けます。ハサミを使用して、殻の穴を直径約1 cmの円形に広げます。この大きさの殻の破片を卵から取り除きます。卵の穴を、約 5 cm 四方の透明なテープで覆います。テープを穴の縁だけに貼り付け、残りの部分は浮かせておきます。これにより、浮かせておいたテープを掴むことで、簡単に卵の封印を解除できるようになります。インキュベーターからステージ15の胚を取り出し、倍率3.2倍以上に設定した実体顕微鏡下の卵置き台に卵を置きます。次に、上の透明テープを剥がします。鋼製マイクロナイフを用いて、胚の右側にある体節26-32に隣接する卵膜および側板中胚葉を切開します。5番のマイクロ鉗子でバリアの一端をつかみ、バリアをひねりながら、自由端を切開部に挿入します。速やかに、卵を透明テープで密封し、インキュベーターに戻します。バリアと併せてビーズを挿入する場合は、まず、付随するテキストプロトコルに従って、レチノイン酸を浸漬させたビーズを準備しておきます。次に、ビーズと5番のマイクロピンセットを用いて、切開部位の遠位側にある側板中胚葉の切断面にビーズを挿入します。その後、ビーズの近位側の切開部にバリアを挿入します。卵を封鎖し、速やかにインキュベーターに戻します。バリアなしでビーズを挿入する場合は、長い切開は行わないでください。代わりに、ビーズを配置する位置で卵黄膜を貫通して側板中胚葉まで小さな切開を入れてください。その後、ビーズを5番マイクロピンセットで掴み、側板中胚葉の切開孔に挿入します。ピンセットの閉じ端を用いて、さらに少し深く押し込みます。インキュベーターからウィンドウステージ10の胚を取り出し、3.2倍以上の倍率に設定した実体顕微鏡下の卵置きに卵を配置します。次に、鋼製マイクロナイフを用いて、胚の尾側にある原条の外側で、体節と平行に、体節約6個分の長さにわたって、卵黄膜と側板中胚葉を切開します。次に、5番のマイクロピンセットを用いて、ペトリ皿から突き出している端からバリアを掴み、手をひねってバリアの自由端を切開部に挿入します。速やかに透明テープで卵を密閉し、インキュベーターに戻します。バリアを用いずにビーズを挿入する場合は、ビーズを配置する位置の卵黄膜を貫通し、側板中胚葉まで小さな切開を加えます。次に、ビーズと5番のマイクロピンセットを用意し、側板中胚葉の穴に挿入します。最後に、ピンセットの閉じた先端でさらに少し押し込みます。ここでは、ステージ15の胚における、体節26-32の肢原基レベルでのバリアの位置を示しています。この障壁により、処置を行った側の肢芽領域ではFhf10およびFhf8の発現が消失し、処置を行っていない左側ではこれらの発現が見られました。しかしながら、処置を行った側においても、ステージ19とステージ23の両方でTbx4の発現が観察されました。このことは、Tbx4の発現だけでは、lpmから後肢の伸展を開始させるのに十分ではないことを示唆しています。ステージ15において、レチノイン酸を浸漬させたビーズをバリアの遠位側に配置すると、Tbx4、Fgf10、およびFgf8は、左側のコントロール側と同様に、処置側でもすべて発現します。したがって、正常な発生過程において、肢芽の成長が開始される前には、体節からのレチノイン酸が不可欠であることがわかります。このビデオを視聴することで、不透過性バリアと候補因子を浸漬させたビーズを用いて、ニワトリ胚の肢芽開始を誘導シグナルがどのように制御しているかを研究する方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

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