チックに誘導シグナルを研究するために、候補因子浸しビーズと組み合わせることで不浸透性の障壁の応用

この外科的介入の目的は、シグナル伝達分子が内側組織から側板中胚葉の細胞に拡散するのを防ぎ、それが遺伝子発現に及ぼす影響を研究することにより、ニワトリ胚の四肢誘導のメカニズムを解明することです。この方法は、四肢芽の開始を制御するための誘導信号は何かなど、発生生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の利点は、ニワトリの胚が外科的操作にアクセス可能であり、非常に堅牢であること、さらに、操作されていない対側制御肢の芽が非常に有用な内部制御として機能することです。

スーザン・ワイルドが手順を実演します。まず、厚さ0.013mmのアルミホイルを1cm四方にカットし、70%エタノールで拭き取って殺菌します。次に、正方形を6cmの滅菌プラスチックペトリ皿に置きます。

静電気の付着を防ぐために、蓋を捨てて、同じホイルから皿用の新しい蓋を作ります。次に、1.6倍に設定された双眼顕微鏡でステージの目盛の上にシャーレを置きます。15枚刃の小さなメスを使用して、長さ2mmのホイルの幅1.3mmのストリップを切り取ります。

ナンバー4ウォッチメーカーの鉗子の2組を使用してホイルストリップを分離します。次に、ホイルバリアの中央で直角に曲げて、ヒンジに似せます。ペトリ皿の中央に障壁を並べ、片側が皿に対して平らになり、もう一方が皿から上を向くようにし、手術日までに20以上の障壁を準備します。

ホイルの蓋を皿の上に置き、バリアを邪魔されない場所に保管します。卵を横にして、AA型の強力な鉗子をしっかりとつかみ、空いている手で卵を保持しながら、空気嚢を含む卵の鈍い端を制御された刺す動作で突き刺します。内殻の膜が壊れていることを確認してください。

次に、卵を両手で持ち、横軸に沿って180度回転させます。次に、約5cm四方の透明なテープを取り、これを卵の最上部に密着させて、卵子を開いたときに卵殻が胚に崩れるのを防ぎます。湾曲したハサミを使用して、卵の最上部の中央にある殻とそれに関連する内部細胞膜をそっと突破します。

ハサミの1枚の刃で非常に小さな穴を開けて、空気が卵子の上の卵に入ることができるようにします。ハサミを使って、シェルの穴を直径約1cmの円に拡大します。この卵サイズの殻を卵から取り出します。

卵の穴を約5cm四方の透明なテープで覆います。テープを押して穴の縁にのみ貼り付け、残りのテープを空けておきます。その後、フリーテープをつかむと、卵のシールを簡単に解除できます。

インキュベーターからステージ15の胚を取り出し、3.2倍以上の倍率に設定された双眼顕微鏡の下で卵子レストに卵を置きます。次に、クリアテープの上層をはがします。スチール製のマイクロナイフを使用して、胚の右側にある体節26-32に隣接するビテリン膜と側方配置中胚葉を切開します。

一方の端に5番のマイクロ鉗子が付いたバリアを拾い上げ、バリアをひねって自由端を切開部に挿入します。できるだけ早く、卵を透明なテープで密封し、インキュベーターに戻します。ビーズをバリアと併せて挿入する場合は、まず、添付のテキストプロトコルに記載されているように、レチノイン酸に浸したビーズを準備します。

次に、ビーズと5番マイクロ鉗子のペアを取り、切開の遠位側にある外側配置中胚葉の切断面に挿入します。次に、ビードの近位にある切開部にバリアを挿入します。卵を密封し、すぐにインキュベーターに戻します。

ビードまたはビーズをバリアなしで挿入する場合は、長い切開を行わないでください。代わりに、ビテリン膜を通って、ビーズを配置する位置で側板中胚葉に小さな切開を行います。次に、ビーズと5番のマイクロ鉗子を取り、側板中胚葉の穴に挿入します。

鉗子の閉じた端でもう少し押し込みます。インキュベーターから窓付きのステージ10の胚を取り出し、必要に応じて3.2倍以上の倍率に設定された双眼顕微鏡で卵子を安置します。次に、鋼製のマイクロナイフを使用して、体節に沿って胚の尾側端の原始縞の外側に、体節の長さ約6本の長さのビテリン膜と側板中胚葉を切開します。

次に、ペトリ皿から突き出ている端で5番のマイクロ鉗子のペアでバリアを持ち上げ、手をひねってバリアの自由端を切開部に挿入します。できるだけ早く、卵を透明なテープで密封し、インキュベーターに戻します。ビードをバリアなしで挿入する場合は、ビテリン膜を介して、ビードを配置する位置で側板中胚葉に小さな切開を行います。

次に、ビーズと5番のマイクロ鉗子のペアを取り、側板中胚葉の穴に挿入します。最後に、鉗子の閉じた端でもう少し押し込みます。ここに示されているのは、ステージ15の胚における体節26-32の推定脚レベルでのバリア位置です。

この障壁により、Fhf10 と Fhf8 の両方の発現が手術側の脚芽領域に存在せず、手術されていない左側に存在することになります。しかし、Tbx4の発現は、手術側のステージ19とステージ23の両方で観察されます。これは、Tbx4の発現だけでは、lpmから後肢の伸長を開始するのに十分ではないことを意味します。

レチノ酸に浸したビーズをステージ15でバリアの遠位に配置すると、Tbx4、Fgf10、およびFgf8はすべて、左側のコントロール側にあるため、操作側で発現します。したがって、正常な発育では、四肢芽の成長を開始する前に、体節からのレチノイン酸が不可欠です。このビデオを見た後、不透過性バリアと候補に浸した因子ビーズを使用して、誘導性シグナルがニワトリ胚の四肢芽の開始をどのように制御するかを研究する方法を十分に理解しているはずです。