タンパク質の品質管理システムを学びます D。 discoideumの温度制御された生細胞イメージングを用い

このイメージング技術の全体的な目標は、Dictyostelium discoideum細胞における熱ストレスによる細胞摂動を観察することです。この手法は、アメーバDictyostelium discoideumの熱ストレス応答とタンパク質品質管理のメカニズムを理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞のファイルイメージングに適用される温度を厳密かつ正確に制御できることです。

手順を開始するには、テキストプロトコルに詳述されているようにDictyostelium細胞を調製します。イメージングの前日に、細胞を低蛍光培地から10, 000細胞/ミリリットルに分割します。イメージングする前に、LFMの組織プレートから細胞を採取し、十分な数の細胞をガラス底皿に移します。

細胞を20分間沈降させてから、使用済みの培地を新しい培地と慎重に交換し、未沈降の細胞を取り除きます。摂氏23度の非ストレス条件下で細胞を画像化し、最低6つの視野を獲得します。最大7マイクロメートルのZスタックを1〜0.25マイクロメートルのステップで取得し、細胞の全容積を捕捉します。

次に、参照明視野画像を取得して、細胞の総数を評価します。次に、冷却室の温度を30°Cに調整します。温度表示が目的の値に達したら、明視野チャネルに手動で焦点を合わせ直します。

タイムラプスを開始する前に、記録されたすべてのFOVを確認し、5〜10分の時間間隔で4時間の熱ストレスのタイムラプスを開始します。最初の 2 つのタイム ポイントの取得中にピント合わせが正しいことを確認します。熱ストレスが完了したら、温度を摂氏23度に戻します。

温度表示が調整され、手動でピントが合わなくなるのを待ちます。次に、回復フェーズのタイムラプスムービーを10〜20分間隔で8〜10時間録画します。最初のタイムポイントの取得中にピント合わせが正しいことを確認してください。

まず、Cell Counter プラグインがインストールされた画像処理パッケージを開きます。明視野画像スタックをロードするには、[ファイル]、[開く]の順にクリックします。次に、Cell Counter プラグインを開き、[初期化] をクリックして画像スタックを読み込みます。

カウンターの種類を選択するには、適切なボックスをクリックします。この後、セルの総数を数え、クリックしてマーカーを保存します マーカーを保存.マーカーを保存したら、蛍光画像ハイパースタックの最大投影をロードします。

Cell Counter プラグインを開き、「Load Markers」をクリックしてマーカーを読み込みます。次に、細胞質病巣のマーカータイプを選択し、細胞をカウントします。既存のマーカーは、個々の細胞の位置のガイダンスとして使用できます。

[Results] をクリックしてスライスごとのカウント数を取得し、さらに計算するためにカウントを別の場所に保存します。この研究では、GFPタグ付きポリグルタミンタンパク質Q103の分布がDictyostelium細胞で観察されました。通常の増殖条件下では、Q103-GFPは細胞質にびまん性に分布しています。

熱ストレス時には、Q103-GFPマーカーが合体して構造を点状にします。応力が解放され、通常の成長条件で成長すると、これらの構造は溶解します。Q103-GFPの再分布と熱ストレス誘発性細胞質病巣の形成は、画像解析を使用して定量化されます。

ここでは、熱ストレス応答の代表的な結果を見ることができます。細胞質Q103-GFP病巣を有する細胞の数は、熱ストレスが継続すると数が増加します。熱ストレス時には、タンパク質の品質管理システムが圧倒され、凝集しやすいタンパク質を可溶性状態に維持することができません。

熱ストレス後、細胞質病巣を有する細胞の数は減少し、凝集したタンパク質が溶解することを示唆しています。このビデオを見れば、アメーバのDictyostelium discoideumの熱ストレスによる摂動を監視する方法を十分に理解できるはずです。イメージング全体を通して、顕微鏡にハードウェアオートフォーカスがない場合は、焦点が適切に調整されていることを確認することを忘れないでください。

このプロトコールで示された温度制御は、熱ストレス応答の分野を超えて使用することができます。温度制御を使用した通常の生育条件下でのイメージングは、光毒性の影響を大幅に低減することができます。