タンパク質の品質管理システムを学びます

このイメージング技術の全体的な目的は、Dictyostelium discoideum細胞における熱ストレス誘発性の細胞摂動を観察することです。この手法は、アメーバであるDictyostelium discoideumにおける熱ストレス応答およびタンパク質品質管理のメカニズムを理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞のイメージングに適用される温度を厳密かつ精密に制御できることです。

手順を開始するために、テキストプロトコルに従ってDictyostelium細胞を準備します。イメージングの前日に、細胞を低蛍光培地（LFM）を用いて1mLあたり10,000細胞に調整し、分割して培養します。イメージングの直前に、組織培養プレートからLFMを用いて細胞を回収し、十分な数の細胞をガラス底ディッシュに移します。

細胞を20分間静置した後、沈降しなかった細胞を除去するために、使用済みの培地を新鮮な培地に慎重に交換します。非ストレス条件下、23 °Cで細胞の画像を撮影し、少なくとも6つの視野を撮影します。細胞の全ボリュームを捉えるため、1～0.25 µmステップで最大7 µmのZスタック画像を撮影します。

次に、総細胞数を評価するために、リファレンスの明視野画像を取得します。続いて、冷却チャンバーの温度を30 °Cに調整します。温度表示が設定値に達した後、明視野チャンネルで手動で再フォーカスを行います。

タイムラプスを開始する前に、記録されたすべてのFOVを確認します。その後、時間間隔を5〜10分に設定し、4時間の熱ストレスに対するタイムラプスを開始します。最初の2つのタイムポイントの取得中に、フォーカスが正しく合っているかを確認してください。熱ストレスが完了した後、温度を23 degrees Celsiusまで下げます。

温度表示が安定するまで待ち、手動で再フォーカスします。その後、回復期において10～20分間隔で8～10時間、タイムラプス動画を記録します。最初のタイムポイントの取得中に、フォーカスが正しく合っているか確認してください。

まず、Cell Counterプラグインが搭載された画像処理パッケージを開きます。[File]をクリックし、[Open]を選択して明視野画像のスタックを読み込みます。次に、Cell Counterプラグインを開き、[Initialize]をクリックして画像スタックを読み込みます。

適切なボックスをクリックして、カウンターの種類を選択します。その後、全細胞数をカウントし、「Save Markers」をクリックしてマーカーを保存します。マーカーの保存が完了したら、蛍光画像のハイパースタックの最大投影図をロードしてください。

Cell Counterプラグインを開き、[Load Markers]をクリックしてマーカーを読み込みます。次に、細胞質フォーカスのマーカータイプを選択し、細胞数をカウントします。既存のマーカーを、個々の細胞の位置を確認するためのガイドとして利用できます。

「Results」をクリックしてスライスあたりのカウント数を取得し、そのカウント数を後で計算に使用するため別の場所に保存します。本研究では、Dictyostelium細胞におけるGFPタグ付きポリグルタミンタンパク質Q103の分布を観察しました。通常の増殖条件下では、Q103-GFPは細胞質に拡散して分布しています。

熱ストレス下では、Q103-GFPマーカーが凝集し、点状の構造を形成します。ストレスを解除し、通常の成長条件下で培養すると、これらの構造は消失します。Q103-GFPの再分布および熱ストレス誘発性の細胞質フォーカスの形成は、画像解析を用いて定量化されます。

熱ストレス応答の代表的な結果をここに示します。熱ストレスが継続するにつれて、細胞質にQ103-GFPフォーカスを持つ細胞数が増加します。熱ストレス下では、タンパク質品質管理システムが飽和するため、凝集しやすいタンパク質を可溶状態に維持することができなくなります。

熱ストレス後、細胞質にフォーカス（焦点）を形成した細胞数が減少することから、凝集したタンパク質が溶解することが示唆されます。このビデオを視聴することで、アメーバであるDictyostelium discoideumにおける熱ストレス誘発性の摂動をモニタリングする方法を十分に理解できるはずです。イメージングの間、顕微鏡にハードウェアオートフォーカス機能が備わっていない場合は、適切にピントが調整されていることを確認することが重要です。

本プロトコルで示した温度制御は、熱ストレス応答の分野以外でも活用可能です。温度制御を用いて通常の成長条件下でイメージングを行うことで、光毒性による影響を著しく軽減させることができます。