単一細胞付着性細胞培養のタイムラプス蛍光顕微鏡による蛋白質分解率の定量化

この蛍光イメージングアプローチの全体的な目標は、SNAPタグを使用して、単一生細胞における目的タンパク質の半減期を決定することです。細胞タンパク質は、合成速度と分解速度が各タンパク質に特異的であり、生理学的調節の対象となるため、広範囲に回転します。しかし、タンパク質の半減期を決定するために最も一般的に使用される方法は、シラミ細胞の集団平均に限定されるか、タンパク質合成阻害剤の使用を必要とします。

このビデオでは、SNAPタグと蛍光タイムラプス顕微鏡を組み合わせて、生細胞内のタンパク質の半減期を測定する方法を示します。この方法の利点は、単一細胞の分解能を達成し、したがって、培養細胞集団における半減期の不均一性の推定値を提供することです。ここで紹介する実験手順は、SNAPタグに融合した目的のタンパク質を発現する、任意のタイプの接着培養細胞に適用できます。

これは、内因性タンパク質のタグ付けによって、またはタグ付けされたタンパク質の過剰発現を使用することによって達成できます。SNAPタグは、DNA修復酵素であるO6-アルキルグアニン-DNAアルキルトランスフェラーゼの変異型であり、ベンジルグアニンと特異的に反応し、分子プローブに結合することができます。したがって、任意のSNAPタグ融合タンパク質は、蛍光細胞透過性色素で不可逆的に標識することができます。

残留色素が洗い流されると、標識されたタンパク質集団は指数関数的に崩壊し、対応するタンパク質の半減期を推測できます。このビデオでは、ゼラチンでコーティングされた皿の上で古典的に成長するとタイトなコロニーを形成する胚性幹細胞を使用しています。単分子膜の細胞として増殖させ、蛍光イメージング実験のための単一細胞分解能を達成するために、細胞膜に発現する細胞の付着によって媒介される細胞と細胞の相互作用を減少させる、Inc接着コーティングプレート上で培養しました。

PBSでマイクロリットルあたり5ナノグラムに付着する組換えインクを希釈し、イメージングに適した96バルブプレートにバルブあたり付着する希釈インク30マイクロリットルを追加します。リコンビナントインクの付着は非常に壊れやすいため、大規模なピペット使用は避けてください。37度で1時間半インキュベートします。

付着液を吸引し、100マイクロリットルのPBSで1回洗浄し、最大200マイクロリットルの寄生済みESL培地を追加します。目的のタンパク質をSNAPタグに融合させたESLラインを使用します。細胞を5mlのPBSで洗浄します。

次に、2 mlのTripsonを加え、37度で4分間インキュベートします。4 mLのESL培地を加え、再懸濁し、1000 Tで4分間スピンダウンします。上清を吸引し、新鮮な培地に再懸濁し、細胞を数えます。

被覆されたイメージングプレートを接着するインクに平方センチメートルあたり30、000個の細胞を座らせます。細胞座位の24時間後にSNAP色素の染色を行ってください。ELS培地中の細胞色素を、事前に決定した最適濃度に希釈します。

ピペットを使用して培地を吸引し、希釈したSNAP染料を50マイクロリットル慎重に加えます。37度で30分間インキュベートします。染料を吸引し、200マイクロリットルのプレワームPBSで3回洗浄します。

200マイクロリットルのESL培地を加え、37°Cで15分間インキュベートします。洗浄手順はピペットで優しく行い、自動吸引器は細胞が簡単に剥がれやすいため使用しないでください。同じ洗浄手順をさらに2回繰り返してから、200マイクロリットルのイメージングメディウムを追加します。

フェノールレッドフリーメディウムを使用して、蛍光の背景を減らします。温度とCO2を制御できる顕微鏡を使用し、使用前に温度を37度、CO2を5%に設定し、1〜2時間平衡させます。

プレートを顕微鏡にセットし、イメージングに適したスポットを選定します。明視野画像は、コーティングされた皿を単層に付着させたESLを示しています。対物レンズを選択し、このサイズのESLには20倍の対物レンズが適しています。

記録する蛍光チャネルの照明設定を選択します。レーザー出力と露出を調整して、映画の途中で減少するので、強い信号を得ることができます。タイムラプス実験の取得パラメータを選択します。

半減期が2時間から20時間のタンパク質の場合、12時間から24時間、時間間隔は15分です。イメージング実験を開始します。FIJIソフトウェアを使用して、ムービーの処理と分析を行います。

取得した画像をスタックとして収集し、変形させます。背景の減算FIJI機能を使用して、スタック内のすべての画像から背景を削除します。関心のあるセルを選択し、FIJIツールバーを使用してその周囲に関心領域を描画し、ROIマネージャーに関心領域を追加します。

次のフレームに進み、前のアクションを繰り返します。ムービーのコース全体で目的のセルを追跡し、追跡された各セルのROIセットを保存します。[メジャー] をクリックして、ROI の平均強度と面積の値を取得します。

ローカル背景を推定するには、各時間枠で対象セルの近くに対象地域を追加します。最後に、[メジャー] をクリックして、平均背景強度の値を取得します。まず、セルROIの平均強度に対して得られた値とその面積を掛けて、セルの平均強度を計算します。

次に、バックグラウンドROIの平均強度に細胞ROIの面積を掛けることにより、セルの積分バックグラウンド値の計算に進みます。最後に、細胞の積分強度のバックグラウンド補正値を得るためには、積分細胞強度値から積分バックグラウンド強度値を差し引きます。細胞集団の平均半減期を取得するには、得られた値を各細胞の最初のフレームの強度値に正規化します。

これにより、各細胞は、その絶対蛍光強度とは無関係に、平均半減期値に同じ重みで寄与することが保証されます。細胞分裂後、両方の娘細胞を別々に追跡し、バックグラウンド減算後のそれらの積分強度を合計して、細胞分裂中のタンパク質希釈を考慮します。両方の娘セルの ROI セットを保存します。

タンパク質の半減期を推定するには、MATLAB のカーブ フィッティング ツールを使用します。タンパク質の崩壊は指数関数的に従い、F(x)は特定の時点での蛍光強度、a"初期強度、b"は崩壊速度です。この動画は、フィットから崩壊率b"の値を取得した後、2の対数をbで割ることで半減期を計算できます」この動画は、ドキシサイクリンが使用できないopt fourのSNAPタグ融合細胞株におけるSNAP色素蛍光の崩壊を示しています。

観察される蛍光シグナルは、使用する細胞株、対応する目的タンパク質の発現レベル、および使用する色素の特性によって異なります。タンパク質崩壊実験では、適切なSNAP色素濃度を使用することが重要です。濃度は、タイムラプスの最初に明るい蛍光信号を生成するのに十分なほど高くする必要があります。

ただし、染料濃度が高すぎると、洗濯後も培地に染料が残る可能性があります。遊離色素は、その後、映画の過程で新しく生成されたSNAPタグ分子に結合する可能性があり、それが崩壊曲線を歪める可能性があります。したがって、さまざまな希釈液を試験してSNAP色素の濃度を最適化することが重要です。

この図は、ドキシサイクリン不使用細胞株で試験した8つの異なる濃度の蛍光SNAP色素の崩壊曲線を示しています。生細胞イメージングに関する製造元の指示書に従って、3マイクロモルの初期色素濃度を選択し、1.4ナノモルの濃度に達するまで1〜3の段階希釈を行いました。2 つの最高濃度ではシグナルは減少しませんが、観測された減衰は低濃度では指数関数的な曲線をたどります。

この例では、12ナノモルの最適な濃度が選択されましたが、この濃度により、洗浄後に培地に残る色素の量が最小限に抑えられますが、蛍光シグナルは明確な減衰曲線を観察するのに十分な明るさです。記載されているプロトコルは、SNAPタグに融合した任意の所与のタンパク質の細胞間変動および半減期の推定値を提供する。この図は、単一細胞の崩壊と、3つの異なるドキシサイクリン使用不可能なSNAPタグ融合細胞株の集団平均を示しています。

Nanog」と「Oct4」は、平均半減期が2.9時間から4.8時間と、かなり短命です。一方、Srsf11"は寿命が長く、平均半減期は25.3時間です。箱ひげ図は、3つのタンパク質の半減期の分布を示しています。

SNAPタグを蛍光タイムラプス顕微鏡と組み合わせて使用することで、目的のタンパク質の半減期を決定できることを示しました。シングルセル崩壊測定は、細胞集団における半減期の不均一性の推定値を提供しますが、タンパク質の半減期を決定するために他の方法を使用する場合は省略されます。SNAPタグを使用してタンパク質の崩壊をモニターする際の最も重要なステップの1つは、洗浄後に培地や細胞内に未結合の色素が残らないようにすることです。

そうしないと、実験の後半で新しく生成されたSNAPタグ分子に結合し、それによって崩壊曲線が損なわれる可能性があります。これは、一方では、説明されているすべての洗浄ステップを慎重に実行することによって達成されます。一方、SNAP染料の濃度は、良好な信号対雑音比を得ることができる範囲に保ちながら、できるだけ低く保つ必要があります。

SNAP色素濃度は、細胞株と使用する色素の種類に応じて、各実験で最適化する必要があります。SNAPタグが候補タンパク質の半減期を変化させる可能性はあるが、候補タンパク質試験の決定された半減期は公表値と密接に一致するため、そのような影響の証拠は見られない。SNAPタグがタンパク質分解に及ぼす影響をさらに排除するための1つの選択肢は、シクロヘキシミドでタンパク質合成をブロックし、固有のタンパク質を認識する抗体を使用して、異なる時点でトイレブロットを行うことです。

また、SNAPタグ候補タンパク質の崩壊をタグなしの先住民バージョンと直接比較します。