ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援しますクラミドモナス

この手順の全体的な目標は、ロボット工学と標準化されたアッセイを使用して、クラミドモナスの温度感受性致死突然変異の分離を合理化し、この生物の必須遺伝子と経路を決定することです。私たちは、真核生物の重要な細胞機能の保全と分岐の両方に興味を持っています。そして、私たちがそれを研究したいのは、これらのプロセスで重要な遺伝子を破壊する突然変異です。

それをうまく機能させるためには、ミュータントの本当に包括的なコレクションが必要であり、あなたが聞く方法は、そのようなコレクションを生成する私たちの方法です。私たちは植物界の代表として緑藻Chlamydomonas reinhardtiiで働いています。この技術の主な利点は、温度感受性の致死突然変異がすべての重要な経路で見つかる可能性が高いことです。

この手法には、予備知識や標的変異誘発は必要ありません。致死的な表現型からすぐに示唆された変異遺伝子の分子機能。これにより、細胞周期制御を超えた多様なシアラ経路を破壊する興味深い突然変異を選択することができます。

100ミリリットルのトリス-アセテート-リン酸、またはTAPで0.2〜0.5のOD 750までのクラミドモナス細胞を、摂氏25度の光の下で、100RPMで振とうしながらUV突然変異導入培養を行う。UV突然変異誘発は、テキストプロトコルに従って、2つの遺伝的背景で独立して行われます。顕微鏡下で各培養物のサンプルをチェックし、細胞が生存可能であり、汚染されていないことを確認します。

次に、培養物をOD 750の0.003に希釈し、ボトルをアルミホイルで包み、ひずみがモーダルで光に応答して方向に向かって泳ぐため、均一な密度を確保します。テキストプロトコルに従って懸濁液の密度を調整した後、液体ディスペンサーにフィットする小さなチューブカセットを取り付け、製造元の指示に従って滅菌のための一連の洗浄を行い、汚染を防ぎます。8本のシリンジ液体ディスペンサーカセットを使用して、2マイクロリットルの培養物をそれぞれ4滴ずつ乾燥した長方形のプレートに分注します。

プレートの端を軽くたたいて、すべての液滴が薄い液体シートに合流するようにし、すぐにプレートを覆って光にさらされないようにします。乾燥させたら、プレートを殺菌UVランプの下に置き、生存者の間でts変異体の最適な収量が得られるように経験的に決定された時間。次に、プレートを室温で8〜24時間暗所に移します。

次に、プレートを照明付きの摂氏21度のインキュベーターに入れます。コロニーが成長したがマージされなかった約10日後、ロボットコロニーピッキングのソースとして関連するスタックにプレートをロードします。次に、長方形のプレート上に384配列のコロニーを選び、摂氏21度で照明付きで約1週間成長させます。

レプリカめっきロボットを使用して、384アレイを1536アレイに凝縮し、プレートを摂氏21度のインキュベーターで約3日間成長させます。1536アレイをそれぞれ2つのプレートに複製し、1つを摂氏21度のインキュベーターに、もう1つを摂氏33度のインキュベーターに配置します。摂氏33度で24時間後、摂氏33度のインキュベーターからプレートを新しい予熱プレートのセットに複製し、摂氏33度のインキュベーターに入れます。

摂氏33度で3日間成長した後、摂氏21度で5日間成長した後、デジタルカメラを使用して、9つの位置合わせインジケーターでマークされたグリッドプレートを撮影します。次に、プレートを撮影し、摂氏21度のプレートを交互に並べ、対応する摂氏33度のプレートを交互に並べ、すべてのプレートを固定フレームに配置して正確な向きを維持します。ペアになった21、33プレートの画像をカスタムマットラボ画像解析ソフトウェアで処理し、背景を排除し、画像を1536アレイに分割します。

プログラムは、検出されたバイオマスを各位置の総ピクセル強度として決定します。ソフトウェアによって生成された選択したコロニーのリストを、単一コロニーピッキングロボットの命令ファイルとしてロードします。次に、ロボット工学の指示に従ってソースプレートとターゲットプレートを準備し、ロボットが選択したコロニーを配列に選択できるようにします。

ターゲットプレートを摂氏21度のインキュベーターに約5日間置き、ストックプレートを成長させます。2回目のバイオマス蓄積アッセイを実施し、テキストプロトコルに従って100枚のブロックプレートを複製した後、100枚のブロックプレートの新鮮なコピーを3つのコピーに複製します。ロボットに3枚目のプレートを設置し、コロニーをスポッティングした後、スクリーニングプレートの各スポットの領域をゼロ時間で顕微鏡写真撮影し、プレートを摂氏33度に置いてインキュベーションします。

摂氏33度のインキュベーターからスクリーニングプレートを取り出した後、さまざまな時点で、プレートホルダーとステージコントローラーが正確にキャリブレーションされていることを確認して、各時点で同じ細胞の画像を取得するために、顕微鏡写真をすばやく撮影します。顕微鏡画像を解析し、目的の基準に基づいて変異体を選択します。96配列の寒天プレートで最終選択セットを見つけ、各プレートに同じ交配タイプと薬剤耐性の変異体が含まれていることを確認します。

アレイ化されたコロニーを大量に、96ウェルマイクロプレート上の窒素フリー配偶子誘導培地に移します。プレートを光下で約5時間インキュベートして、配偶子形成を可能にします。配偶子形成のための窒素フリー配偶子誘導媒体を備えたチューブに代替抵抗カセットを抱く反対の嵌合タイプのクエリを一時停止します。

ターゲットプレートからのサンプルを、20マイクロリットルの嵌合混合物容量で混合します。ライトの下で約10分後、各ウェルから5マイクロリットルを2回見つけます。リンケージ試験用のTAPプレートに1回、補完試験用にTAPに5マイクロモルのパロと9マイクロモルのハイグロを1回取り付けます。

相補型試験プレートをインキュベートした後、ts表現型同定のためにプレートを2つのコピーに複製します。テキストプロトコルに従って、ts表現型のコロニーをテストします。クラミドモナスの単一細胞を照射した後、細胞を許容温度で10日間増殖させた後、ここに見られるように配列された形式で選択されます。

384 形式の結果のプレートは、1536 配列にマージされます。クラミドモナスts変異体を生成するために、3回のUV曝露時間を試験しました。経験的には、1.5分の曝露時間が最も多くのts変異体をもたらしました。

しかし、圧倒的には、1分間の曝露時間でほとんどの細胞周期候補が得られました。この実験では、2つのシーケンシャルts表現型アッセイを実施し、約3000 ts変異体を単離し、タイムラプス顕微鏡法によって表現型を特徴付けました。ここで見られるように、ダウンストリームパイプラインから再発性の高い遺伝子を取り除くために、新たに収集された候補に対して、2つ以上の対立遺伝子を持つすでに特徴付けられた遺伝子との相補および連鎖試験が行われました。

これらのコロニーは、クエリとの相補性を示さず、したがって、クエリされた遺伝子の新しいts対立遺伝子です。これらは通常、さらなる特性評価から除外されます。このテクニックを習得すると、高いスループットで行うことができます。

数千のts変異体をわずか2、3回の突然変異誘発ラウンドで単離することができます。ts変異体の単離後の重要なステップは、さらなる研究のためにサブセットを選択することであり、致死的な表現型の範囲を見ることは非常に興味深いことです。表現型は、分子機能へのヒントを提供し、さらなる研究のために変異体を優先するのに役立ちます。

突然変異体のゲノムには数百または数千の突然変異がある可能性があることに留意してください。通常、原因となるのは1つだけですが、ts表現型には2つの突然変異が必要な場合があり、これはテトラ解析によって決定できます。この手順に続いて、プールされた遺伝子の次世代シーケンシング分析によって原因となる突然変異を特定することができます 同定された遺伝子は、機能を示唆する突然変異を持っている場合もあれば、新しい未知の配列である場合もありますが、これは興味深く、エキサイティングです。

クラミドモナスは、植物界の細胞生物学を研究するための優れたモデルシステムです。あなたが聞いた手順は、比較的調査されていない重要なプロセスのためのこの生物の研究を開くはずであり、その結果がより広範な植物界にも関連することを願っています。