Name: 微生物光遺伝学アプリケーションのための自動照明、培養、およびサンプリングシステムの設計と実装 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学ぶ微生物光遺伝学のための自動連続培養システムの構築方法。Saccharomyces cerevisiaeを用いて照明応答をリアルタイムで計測し、動的遺伝子発現を数日間にわたって解析する技術を習得できます。

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私たちは便利な議論や編集のためのプロトコル、キーラン・スウィーニーをテストする際に支援するためのモリーラザルとベロニカ・デルガドに感謝して、原稿の重要な読書のためのテイラー・スコット、私のアン・adirekkun、およびステファニーゲラーだろう。ミーガンニコールMcClean氏、博士バローズウェルカム基金からの科学的なインターフェイスでのキャリア賞を保持しています。

<ol><li>Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+control+of+DNA+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Light-mediated control of DNA transcription in yeast.</a> Methods. 58 (4), 385-391 (2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+A+light-inducible+CRISPR-Cas9+system+for+control+of+endogenous+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).</li>
<li>Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-inducible+organelle-targeting+system+for+dynamically+activating+and+inactivating+signaling+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast.</a> Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).</li>
<li>Lee, S., Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+protein+inactivation+by+optogenetic+trapping+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells.</a> Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).</li>
<li>Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-induced+dimerization+of+a+bacterial+LOV-HTH+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein.</a> Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).</li>
<li>Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+LOV2+Domain-Based+Optogenetic+Tool+to+Control+Protein+Degradation+and+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function.</a> Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+the+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Description of the chemostat.</a> Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).</li>
<li>Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7, 973-975 (2010).</li>
<li>Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+characterization+methods+overcome+key+challenges+in+synthetic+and+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology.</a> Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).</li>
<li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast%3A+An+experimental+organism+for+21st+century+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast: An experimental organism for 21st century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li>
<li>Galanie, S., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+yeast-based+production+of+medicinal+protoberberine+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids.</a> Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).</li>
<li>Gerngross, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+production+of+human+therapeutic+proteins+in+yeasts+and+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi.</a> Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).</li>
<li>van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+fermentation+of+carbon+sources+in+biomass+hydrolysates+by+Saccharomyces+cerevisiae%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).</li>
<li>Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.jbmethods.org/jbm/article/view/36/0">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> Journal of biological methods. 1 (2), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/1438429/">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li>
<li>Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+homeostasis+in+batch+and+steady-state+culture+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).</li>
<li>Boer, V. M., Tai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisaie+to+preferred+and+nonpreferred+nitrogen+sources+in+glucose-limited+chemostat+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures.</a> FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).</li>
<li>Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+genotype+and+nutrition+on+survival+and+metabolism+of+starving+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).</li>
<li>Gresham, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enduring+utility+of+continuous+culturing+in+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution.</a> Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).</li>
<li>Liu, H., Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoexcited+CRY2+interacts+with+CIB1+to+regulate+transcription+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis.</a> Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).</li>
<li>McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+expression+perturbation+systems+with+rapid%2C+tunable%2C+single-gene+specificity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.</a> Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).</li>
<li>McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation-based+analysis+and+modeling+of+combinatorial+regulation+in+the+yeast+sulfur+assimilation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.</a> Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).</li>
<li>McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).</li>
<li>Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response%2C+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li>
<li>Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-limiting+intracellular+metabolites+in+yeast+growing+under+diverse+nutrient+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations.</a> Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).</li>
<li>Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.2050-0416.1967.tb03043.x/pdf">Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast.</a> Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).</li>
<li>Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+phosphate+scarcity+on+pharmaceutical+protein+production+in+S.+cerevisiae%3A+linking+transcriptomic+insights+to+phenotypic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses.</a> Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).</li>
<li>Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+Systems+of+Bacteria+such+as+Escherichia+coli+in+Response+to+Nutrient+Limitation+and+Environmental+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses.</a> Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).</li>
<li>Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+bacterial+gene+circuit+dynamics+with+optically+programmed+gene+expression+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals.</a> Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

私たちは心の中で柔軟にこの装置を設計しました。使用されるすべてのコードはフリーでオープンソースです。セグメント細胞へのデフォルトの画像解析処理が簡単で、すぐに実行されます。カスタム解析は、フィジーグラフィック・ユーザ・インタフェースを代表画像を解析BeanShellのスクリプトに入力を変換し、その後、スクリプトを呼び出すためのプラグインを設定する際に、ユーザ入力を記録することによって実現することができます。それが呼び出されると、このスクリプトは、バックグラウンドを差し引いた画像の最新のセットにファイルパスを含む「画像」と呼ばれる文字列配列を送信されます。実験が突然終了した場合、それらが失われないように、それらが収集される画像やデータが保存されます。青色LEDアレイは、我々の光遺伝学系を誘導するために選択されたが、それは、異なる色のLEDに置き換えることができます。それは簡単にPCB上の追加のMOSFETスイッチとリレースイッチ用のマイクロコントローラ上だけでなく、スルーホール利用可能な追加の入力ピンと出力ピンがあります。このシステムのために、より複雑な目的のために適合されます。例えば、LEDに電力を供給し、培養容器に縛り付け光センサーか...

光遺伝学システムは、遺伝子発現、1、2、3、4、5タンパク質の局在化、6タンパク質活性、6、7、8タンパク質結合、8、9、10、およびタンパク質分解を含む細胞プロセスの成長のリストを制御するために光を使用します。プログラムされた光刺激と制御された環境で細胞を培養するため、および生物学的に関連するタイムスケールの上にそれらの応答を測定するための11の方法は、細胞生物学、バイオテクノロジーの研究のためにこれらのツールの可能性を利用することが必要です。我々の方法は、AE、よく混合した一定の細胞増殖速度を維持するためにchemostasisを利用します評価、及びプログラムされた照明に曝される温度制御されたガラス製の培養容器12、13。倒立顕微鏡で培養排水中の我々の画像の個々の細胞は、プログラムされた照明への文化の応答を測定します。流出液の細胞培養の蛍光強度および細胞形態は、ユーザ入力なしに複数日にわたって測定することができるように培養、サンプリング、画像化、および画像解析は完全に自動化されています。 このプロトコルは、増殖する細胞培養及び顕微鏡精通ほとんどの研究室で実施することができ、使用される装置は、安価で容易に入手可能なコンポーネントで構成されています。透明な培養容器は、光の1μW/ cm 2の範囲では-10 mW / cm 2で発光可能な発光ダイオード（LED）のマトリックス上に配置されています。微生物を連続培養容器で増殖させます。 1蠕動ポンプがでメディアを追加するために使用されます希釈率は、他の顕微鏡に小さい速度で培養物を回収するために使用され、その差は、オーバーフロー出口を通って逃げます。加熱パッドは、温度を維持しています。空気が継続的に正の圧力を維持するだけでなく、ミックスと文化を通気するために培養容器内に圧送されます。空気ポンプを除き、これらのデバイスへの電力はまた、温度計と接続されたデスクトップコンピュータからの入力を受け取るマイクロコントローラによって調節されます。流出液の細胞培養物を倒立顕微鏡のステージ上のマイクロ流体デバイスに圧送されます。非蛍光及び蛍光画像を自動的に取得されます。画像中の細胞は、関心領域（ROI）のように各セルを検索し、各ROIの特性を測定するアルゴリズムを特徴とします。 このプロトコルの適用を実証するために、我々は、青色光responsiで操作サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞の変化する光強度に対する応答を測定し蛍光タンパク質の転写を制御する光遺伝学システムまし。このシステムにおいて遺伝子発現を制御するための複数の光遺伝学系はすでに14、15、16が存在するため、一般的パン酵母としても知られているS.セレビシエは 、選択されました。さらに、このモデル生物は、一般にシステム生物学17およびバイオテクノロジーアプリケーション18、19、20のための筐体としての研究のために使用されます。私たちの代表的な結果は、このプロトコルは、入力光強度を変化させると、蛍光レポーターの産生を測定することによって、複数日間の培養の転写を制御するために使用することができることを示しています。

<table><tbody><tr><td>広範なラボマニュアル</td><td>GitHub</td><td>NA</td> 定期的に<td>更新される広範なラボマニュアルは、「光遺伝学的ケモスタットファイル」GitHub リポジトリ (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files)。これには、代表的な結果を生成するために使用されるマイクロ流体モールドの説明も含まれます。</td></tr><tr><td>Fritzing Design Viewer</td><td>Fritzing</td><td>NA</td> .<td>fzzタイプの回路基板デザインを表示および編集するための無料のオープンソースソフトウェアは、「http://fritzing.org/download/」</td></tr><tr><td>Arduino Uno R3 (Atmega328 - 組み立て済み)</td><td>Adafruit</td><td>50</td>マイクロコントローラで入手できます。 1つ<td>必要です。</td></tr><tr><td>Arduino Stackable Header Kit</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10007</td><td>PCBをマイクロコントローラに接続するためのメスピンヘッダ。 1個必要です。</td></tr><tr><td>調整可能な30W 110Vはんだごて - XY-258 110V</td><td>Adafruit</td><td>180</td><td>PCBへの電気接続用。 1個必要です。</td></tr><tr><td>はんだごてスタンド</td><td>Adafruit</td><td>150</td><td>基板への電気接続用。 1個必要です。</td></tr><tr><td>ミニはんだスプール - 60/40 鉛ロジンコアはんだ 0.031インチ直径 - 100g</td><td>Adafruit</td><td>145</td><td>PCBへの電気接続を行います。</td></tr><tr><td>0.1 &mu;Fコンデンサ</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-08375</td><td>PCBの電圧を安定させます。</td></tr><tr><td>10 &mu;Fコンデンサ</td><td>スパークファンエレクトロニクス</td><td>COM-00523</td><td>基板内の電圧を安定させます。</td></tr><tr><td>MAX7219CNG LEDマトリックス/桁ディスプレイドライバ - MAX7219</td><td>Maxim</td><td>MAX7219CNG</td><td>LEDドライバ 1個必要</td></tr><tr><td>8ピンICソケット</td><td>Mouser Electronics</td><td>575-144308</td><td>16が必要です。これらは、LEDマトリックスの上の培養容器を支えるために、互いに積み重</td></tr>ねられます。<tr><td>24ピンICソケット</td><td>Mouser Electronics</td><td>535-24-3518-10</td><td>オプション。これを使用して、MAXIM 7219CNGドライバをPCBに可逆的に取り付けます。</td></tr><tr><td>デジタルマルチメータ</td><td>Adafruit</td><td>2034</td><td>電子機器のトラブルシューティング用。 1 必須。</td></tr><tr><td>ブレークアウェイヘッダー - 40ピンオス(ロングセンタリング、PTH、0.1インチ)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT-12693</td><td>LEDマトリックスをプリント回路基板に接続するためのオスピンヘッダーです。端部はワイヤーカッターでトリミングできます。1セット必要です。&nbsp;</td></tr><tr><td>フラッシュダイアゴナルワイヤーカッター</td><td>Adafruit</td><td>152</td><td>長いピンヘッダーのトリミングと電源ケーブルの切断用。1個必要です。</td></tr><tr><td>プレミアムメス/メスジャンパーワイヤー - 40 x 12インチ(300mm)</td><td>ブレッド</td>ボードをLEDマトリックスに接続するためのAdafruit <td>793</td><td>ワイヤーリボン。オスピンヘッダーで端から端まで接続して長くすることができます。1 必須です。</td></tr><tr><td>ハーフサイズのブレッドボード</td><td>Adafruit</td><td>64</td><td>LEDマトリックスがこれに接続し、培養容器がその上に置かれます。</td></tr><tr><td>ミニチュア8x8青色LEDマトリックス</td><td>Adafruit956</td><td></td><td>光源。主波長は470nm(青)です。1 必須です。同じベンダーの代替ミニチュアLEDマトリックスは、624 nm(赤)、588 nm(黄)、525 nm(緑)、572 nm(黄緑)、および白の主波長で利用できます。</td></tr><tr><td>積み重ね可能なヘッダー-3ピン</td><td>SparkFun Electronics</td><td>13875</td><td>8が必要です。</td></tr><tr><td>抵抗器キット - 1/4W (合計 500)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10969</td><td>電子機器用。1 個必要です。</td></tr><tr><td>&nbsp;IRL520N MOSFET</td><td>International Rectifier</td><td>IRL520N</td><td>DC電流を制御するための電圧調整スイッチ。 4個必要。</td></tr><tr><td>フックアップ ワイヤ - アソートメント (ソリッド コア、22 AWG)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT 11367</td><td>電子機器用ワイヤ。1 個必要です。</td></tr><tr><td>5V 2A (2000mA) スイッチング電源 - UL規格</td><td>Adafruit</td><td>276</td><td>加熱パッドとArduino用の電源。</td></tr><tr><td>12 VDC 1000mA 安定化スイッチング電源アダプタ - UL 認定</td><td>Adafruit</td><td>798</td><td>蠕動ポンプ用。2 個必要。</td></tr><tr><td>電気加熱パッド - 10cm x 5cm</td><td>Adafruit</td><td>1481</td><td>バイオリアクターの加熱用。 1個必要です。</td></tr><tr><td>低流量可変流量蠕動ポンプ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-876-1</td><td>揚水媒体用。 1個必要</td></tr><tr><td>中流量可変流量蠕動ポンプ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-876-2</td><td>培養用ポンピング用。 1個必要。</td></tr><tr><td>9 VDC 1000mA安定化スイッチング電源アダプタ - UL認定</td><td>のAdafruit</td><td>63</td>マイクロコントローラ<td>電源用。注文1.</td></tr><tr><td>高温防水DS18B20 デジタル温度センサー + バイオ</td>リアクター用の<td>Adafruit</td><td>642</td><td>温度計を追加 1個必要です。</td></tr><tr><td>Micromanager</td><td>Micromanager</td><td>NA</td> 「<td>https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release」で入手可能な無料のオープンソース顕微鏡制御ソフトウェア</td></tr>「<tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td>NA</td>」 <td>「http://fiji.sc/」で入手可能な無料のオープンソース画像解析ソフトウェア</td></tr> <tr><td>Arduino 統合開発環境</td><td>Arduino</td><td>NA</td><td>無料のオープンソースIDEは「https://www.arduino.cc/en/Main/Software」で入手できますカスタム</td></tr><tr><td>コード</td><td></td><td>GitHubNA</td><td>カスタムマイクロコントローラーコードと「BioreactorController」プラグインは「光遺伝学的ケモスタットファイル」GitHub リポジトリ (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files)。</td></tr><tr><td>USB ケーブル A to B - 6 フィート</td><td>SparkFun Electronics</td><td>CAB-00512</td><td>マイコンへのデータのダウンロードに使用。 1 個必要です。</td></tr><tr><td>bioreactorTimecourse_example.csv</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>CSVファイルからLEDマトリクスの値を読み込むメリットは、画像解析結果に基づいてプラグインからプログラムを呼び出して値を更新し、その値をマイコンに再読み込みすることでフィードバック制御が可能になることです。「光遺伝学的ケモスタットファイル」GitHub リポジトリ (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files)。</td></tr><tr><td>Tota-frost gels(拡散紙)</td><td>B&Hバンド</td><td>&H # LOFSFTL MFR # T1-72</td><td>LEDマトリクス用。1が必要。</td></tr><tr><td>キッティングシート Crosslink 1/4x12x24in</td><td>Grainger, inc</td><td>20JL37</td><td>培養容器の囲い用のブラックフォーム。 4個必要です。</td></tr><tr><td>標準フォトダイオードパワーセンサ、Si、200 - 1100 nm、50 mW&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>光強度の測定用。 1個必要です。</td></tr><tr><td>ラベリングテープ</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015N</td><td>緩い部品のラベリングと固定用。1個必要です。</td></tr><tr><td>コンパクトパワー&エネルギーメーターコンソール、デジタル4インチLCD</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>光強度の測定用。 1個必要です。</td></tr><tr><td>100mL GL45ハイブリダイゼーションガラス瓶</td><td>ベルコガラス株式会社</td><td>(7910-40150)</td><td>バイオリアクター容器 1隻必要です。</td></tr><tr><td>6ポート組立</td><td>ベルコグラス社</td><td>カスタム&nbsp;</td><td>バイオリアクター容器用。チューブ仕様:.125インチOD x .055インチID.ポートA:キャップスラッグの上とチューブの底までの長さ1.0インチ。ポートB、C、E、F:キャップスラッグより上1.0インチ、下33mmの長さ。ポートD:キャップスラッグから1.0インチの長さ、65 mm&nbsp;下に長い。1 必須です。直径45mmのポリプロピレン製オープントップスクリューキャップと、キャップと容器の間の密閉性を確保するための白色シリコンガスケットが付属します。</td></tr><tr><td>スコッチマジックテープ3105、3/4 x 300インチ、</td><td>3つのAmazon</td><td>B0009F3P3U</td><td>クリアスコッチテープのパック。これは、他の多くのベンダーから入手できます。これは、培養容器のマーキングを覆うため、およびPDMSチャネルを備えたカバーガラスをアルミニウム支持フレームに固定するために使用されます。</td></tr><tr><td>1/16 "ID x 3/16 "OD x 1/16 "壁タイゴンサニタリーシリコーンチューブ</td><td>米国プラスチック株式会社</td><td>57288</td><td>チューブ ~25' 必要。</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Twistit ホワイトラバーストッパー、サイズ 10</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-62992-32</td><td>メディアフラスコストッパーと排水フラスコストッパー 2 個必要です。</td></tr><tr><td>2L 実験用フラスコ</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td>メディアフラスコと廃液フラスコ 2個必要です。</td></tr><tr><td>デイピンチコック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>5867</td><td>ピンチチューブ用</td></tr>。<tr><td>交換用チューブアセンブリ 1/16インチ ID</td><td>トレーサブル 製品</td><td>3372</td><td>チューブのセットが付属していますが、数週間使用すると摩耗します。</td></tr><tr><td>交換用チューブアセンブリ 1/50インチ ID</td><td>トレーサブル 製品</td><td>3371</td><td>ペリスタルティックポンプにはチューブのセットが付属していますが、数週間使用すると摩耗します。</td></tr><tr><td>ロックリング付きオスルアー x 1/16" ホースバーブ、ナイロン、25/個入り</td><td>コールパーマー</td><td>EW-45505-00</td><td>コネクター。~10ルアーが必要です。</td></tr><tr><td>ロックリング付きオスルアー x 1/8インチホースバーブ、ナイロン、25個入り</td><td>コールパーマー</td><td>EW-45505-04</td><td>コネクター。5個必要、チューブで埋めるためのゴム栓穴ごとに1つずつ。</td></tr><tr><td>メス ルアー x 1/16" ホース バーブ アダプター、ナイロン、25 個</td>入り <td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-00</td><td>コネクタ。必要なルアーは ~10 個です。</td></tr><tr><td>メスルアー×3/16インチホースバーブアダプター</td><td>コールパー</td><td>マーEW-45502-08</td><td>コネクター ~10ルアーが必要。</td></tr><tr><td>コールパーマールアーアクセサリー、メスルアーキャップ、ナイロン、25個入り</td><td>コールパーマー</td><td>SC-45502-28</td><td></td></tr><tr><td>コールパーマールアーアクセサリー、オス型ルアーロックプラグ、ナイロン、25個入り</td><td>コールパーマー</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr><tr><td>マイクロボアPTFEチューブ、0.022インチID x 0.042インチ外径、100フィート/ロール</td><td>コールパー</td><td>マーEW-06417-21</td><td>チューブ。</td></tr><tr><td>Masterflex プラチナ硬化シリコンチューブ、L/S 13、25 フィート</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-13</td><td>チューブ、~25' が必要です。</td></tr><tr><td>3/16 "ID x 1/4 "OD x 1/32 "壁タイゴンサニタリーシリコーンチューブ</td><td>米国プラスチック株式会社</td><td>57293</td><td>チューブ ~1' 必要。</td></tr><tr><td>真空フィルター</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td>・<td>イ974107</td><td>無菌濾材用のNalgene真空フィルター。</td></tr><tr><td>Aquel Oxy-Boost 200</td><td>Rena Aquatic Supply</td><td>AP200</td><td>デュアルダイアフラム流量調整式エアポンプ 曝気および混合用。 1個必要です。&nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 &mu;mポアシリンジフィルター</td><td>コーニングインターナショナル</td><td>431229</td><td>これにより、水槽ポンプからの空気が装置を汚染しないようにします。</td></tr> 1が必要です。<tr><td>Slygard 184 シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td>Slygard 184</td><td>マイクロ流体デバイス用。 1個必要です。</td></tr><tr><td>アメリカの安全かみそり GEM サイエンティフィック シングルエッジカミソリの刃</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>17989000</td><td>チューブとPDMSの切断用。</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHAWB100028 ALDRICH</td><td>マイクロ流体デバイスのパンチング入口/出口用 1個必要です。</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス 22x60-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>マイクロ流体デバイス用。 1個必要です。</td></tr><tr><td>正方形の窓を持つ長方形のアルミニウムフレーム</td><td>カスタム</td><td>カスタム</td><td>マイクロ流体チャネルをサポートします。外形寸法:3インチx 1.25インチ 内側の寸法(切り抜き部分):7/8インチx 7/8インチ 厚さ:~1/32インチ</td></tr></tbody></table>

微生物光遺伝学アプリケーションのための自動照明、培養、およびサンプリングシステムの設計と実装

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

光遺伝学システムは、細胞プロセスを変更するために特定の波長の光に反応して立体構造を変更遺伝的にコードされたタンパク質を利用します。光遺伝学システムのプログラムされた照明および刺激を組み込んだシステムを培養し、測定が必要です。我々が構築した光のプログラムされた用量で微生物細胞を照射し、自動的に取得し、流出液中の細胞の画像を分析するために、連続培養装置を使用するためのプロトコルを提示します。ケモスタット、この装置の動作は、増殖速度と細胞環境を厳密に制御することを可能にします。連続的な細胞培養の流出物は定期的にサンプリングし、細胞をマルチチャンネル顕微鏡によって画像化されます。蛍光強度および培養流出物から採取した細胞の細胞形態の動的応答が複数日にわたって測定されるように培養、サンプリング、画像化、および画像解析は完全に自動化されていますユーザーの入力なし。我々は、動的に転写を活性化する光遺伝学系で操作サッカロマイセス・セレビシエの株においてタンパク質産生を誘導することによって、この培養装置の有用性を実証します。

この装置は、CRY2 / CIB1タンパク質対30に基づいて、誘導光遺伝学転写系を介して青色光に応答して、黄色蛍光タンパク質（YFP）を発現するS.セレビシエの培養物を刺激するために使用しました。細胞は0.2±0.008の平均希釈率でリン酸限定培地でchemostatically成長させました。リン酸塩の制限は、一般に、成長速度を制御するためにS.セレビシエケモスタット実験で使用され、リン酸制限の効果は十分に特徴付けられています。 31、32は 、連続的に希釈された培養容器33の流出物は、倒立顕微鏡でマイクロ流体デバイスにサンプリングしました。 図8に示すように、画像が自動的に分析されました。個々の細胞は、バックグラウンドを差し引いた位相コントラスト画像とそのYFPのco...

我々は、倒立顕微鏡を用いて流出液中の微生物、定期的に画像を細胞の培養物を照明する光遺伝学システムを使用するための連続的な培養装置を設計しました。照明の動的応答は、数日間にわたって測定することができるように培養、サンプリング、画像化、および画像解析は完全に自動化されています。

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

この手順の全体的な目標は、光遺伝微生物の照明に対する応答を顕微鏡でリアルタイムかつ数日間にわたって自動的に測定できる連続培養容器を組み立てることです。この方法は、動的遺伝子発現が静的遺伝子発現とは異なる応答をどのように引き出すことができるかなど、細胞生物学および代謝工学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、連続培養により、数日間にわたって測定値を収集できることです。まず、デジタル温度計のグランドライン、データライン、および正電圧ラインをプリント回路基板にはんだ付けします。メスの 3 ピン ヘッダーから 1 つのピンを切り取り、残りの 2 つのピンをトリミングします。これをR2とラベル付けされた穴のペアにはんだ付けし、ピンヘッダーに4.7キロオームの抵抗を挿入して、はんだ付けされた2つのピンを接続します。次に、残りのコンポーネントを回路基板に接続します。回路基板をマイクロコントローラーにオーバーレイします。耐光エンクロージャーをセットアップし、付属のテキストプロトコルで説明されているようにすべてのソフトウェアをインストールします。まず、アルミポートの長い方の端をガスケットを通して培養容器に入れ、キャップをねじ込みます。1つの短いアルミニウムポートアウトレットを中径のシリコンチューブで覆います。メスのルアーロックを挿入し、次にオスのルアーロックプラグを接続して、蒸留端を塞ぎます。このアウトレットは補助的なものであり、使用されません。中径シリコンチューブの2つの短いセグメントをオスとメスのルアーロックで接続します。次に、一方の端を短いアルミポートコンセントに接続し、蒸留端を差し込みます。血管はこのチューブを通して接種されます。次に、2本のミディアムチューブをミディアム径のチューブとコネクターの端に接続します。一方の端を短いアルミニウムポートに接続し、もう一方の端を差し込みます。後で、これはメディアフラスコに接続されます。中径のシリコンチューブを最も長いアルミニウムポートに接続します。チューブは、メディアフラスコに届くように十分な長さにする必要があります。数インチの長さの別の短いセグメントを端まで接続し、メディアフラスコのゴム栓に挿入します。cl チューブ。後でクランプを解除すると、この接続により、培養物を混合、曝気し、入ってくる気泡によって陽圧に保つことができます。フラスコの底に達するのに十分な長さの中径チューブを、メディアが移送されるストッパーに挿入します。これに別の中径チューブを接続し、次に端に幅の広いチューブを接続します。蒸留端を差し込みます。ストッパーの3番目の穴を中径チューブの短いセグメントで埋め、他の2つの中径チューブセグメントに接続し、蒸留端で差し込みます。これは真空ポンプに接続され、後で水槽ポンプに接続されます。オスルアーロックを小径シリコンチューブのセグメントに挿入し、PTFEチューブをしっかりと挿入します。次に、メスのルアーロックを中径のチューブに取り付けます。メスロックをPTFEチューブに沿ってねじ込み、ロックともう一方を短いアルミニウムポートに接続します。培養容器内のPTFEチューブが、2番目に長いアルミニウムチューブの下、および底より上にぶら下がっていることを確認してください。必要に応じてトリミングします。メディアはここからイメージングチャネルまでサンプリングされ、細いチューブは中間ボリュームを最小限に抑えます。次に、露出した細いシリコンチューブを狭いチューブとコネクタに接続します。これに、狭径チューブの3つのセグメントとPTFEチューブの2つのセグメントを交互に接続します。これを中径のチューブを介して排水フラスコに接続します。次に、中径のシリコンチューブの一方の端を、流出フラスコのもう一方の端にあるアルミニウムポートの2番目に長いチューブに接続します。このアルミチューブが培養量を設定し、余分な培養物が廃液容器にあふれます。フラスコの蓋をアルミホイルで包み、アセンブリを摂氏121度、15PSIで30分間オートクレーブします。真空フィルターを100ミリリットルのボトルに取り付けます。ニップルカバーを取り外し、滅菌ピンセットで真空フィルターのニップルから白いプラグを取り外します。幅広のシリコンチューブをニップルに接続し、メディアフラスコのもう一方のフリーチューブを真空ポンプに接続し、メディアフラスコを培養容器に接続する3番目のチューブがクランプで閉じていることを確認します。フィルターにメディアを入れ、真空ポンプをオンにしてから、残りのメディアをろ過します。clamp 真空に接続されたミディアムシリコンチューブを停止し、真空ポンプをオフにします。真空ポンプに接続されたミディアムシリコンチューブの中間セグメントからルアーを取り外し、滅菌シリンジエアフィルターの青い端をこのチューブに挿入します。次に、幅の広いシリコンチューブをクランプし、オスのルアーを外します。培養容器のメディアインレットチューブのメスルアーからプラグを外します。これらのルアーを接続して、培地を培養容器に送り込むことができます。次に、100ミリリットルのボトルからフィルターを取り外し、ボトルキャップを取り付けます。このメディアを使用して、スターターカルチャーを準備します。連続培養アッセンブリーを顕微鏡の近くに設置し、培地フラスコを培養容器より高くし、廃液フラスコを培養容器より低くして逆流を防ぎます。メディアと廃液フラスコのゴム栓をしっかりとテープで留めます。次に、PTFEチューブの端をそれらを接続する細いシリコンチューブからプラグを抜き、これらの端を準備されたマイクロ流体デバイスの入口と出口に差し込みます。次に、シリンジエアフィルターの白い端を水槽ポンプに接続して、培地を培養容器に押し込みます。媒体が排水ポートのレベルに達したら、中媒体入口チューブとコネクタを低速蠕動ポンプに巻き付け、狭いサンプル出口チューブとコネクタを高速蠕動ポンプに巻き付けます。メディアフラスコと培養容器の間のエアチューブのクランプを解除して、メディアを曝気します。次に、加熱パッドと温度計を培養容器にテープで固定して、温度を制御できるようにします。培地チューブを培養容器の周りに巻き付けて、入る培地が容器と同じ温度になるようにします。次に、LEDマトリックス上の黒いフォームエンクロージャーに培養容器を挿入し、チューブが挟まれていないことを確認します。バイオリアクターコントローラープラグインを使用して、低速メディアポンプを30秒間隔の10分の1ずつオンに設定します。流量は非常に低くなりますが、蒸発速度よりも大きくなります。入ってくるエアチューブをメディアフラスコと培養容器の間に固定します。ピペットを使用して、スターター培養物から1ミリリットルを培養容器に接種します。次に、このチューブの蒸留端をクランプし、エアチューブのクランプを解除します。文化が一夜にして成長するのを待ちます。光が入らないようにエンクロージャーを覆います。翌日、バイオリアクターコントローラープラグインを使用して、目的の媒体とサンプリング流量に対応して、蠕動ポンプをより長い時間回転するように設定します。培養密度を一晩平衡化させます。翌日、ステージポジションリストとマイクロマネージャーを、マイクロ流体チャネルに送り込まれた細胞が焦点面にあるオーバーラップしない位置のセットで埋めます。次に、バイオリアクターコントローラープラグインを開きます。プロンプトから目的のLEDマトリックスの時間経過、イメージングチャネル、およびその他の実験設定を選択し、データの収集を開始します。この装置は、誘導性光遺伝学的転写システムを介して青色光に応答して黄色の蛍光タンパク質を発現する出芽酵母の培養を刺激するために使用されました。マイクロ流体チャネルのベースコントラストと蛍光画像を取得しました。位相差画像から細胞の輪郭を同定し、蛍光画像にマッピングし、蛍光画像をリアルタイムで記録しました。このヒートマップは、光遺伝系の活性化による黄色蛍光タンパク質産生による培養物の蛍光分布を示しています。約170, 000個の細胞の蛍光を、28のステージ位置から70時間以上にわたって取得した30, 000枚以上の画像から分析しました。この研究では、培養物をさまざまな強度の青色光に6時間間隔でさらし、その後6時間の完全な暗闇にさらしました。細胞は最初の測定前に光にさらされていたため、最初の暗期には蛍光強度が低下します。一度習得すると、このテクニックは、適切に実行されれば、3日間で8時間で行うことができます。この手順を試みるときは、滅菌技術を使用することが非常に重要です。この手順に続いて、リアルタイムフィードバック制御などの他の方法を使用して、タンパク質濃度を制御することができます。この技術により、光遺伝学的構築物を持つ生物を、プレートやバッチ培養を使用して可能なものよりも長い時間、長期間にわたって動的に研究することができます。このビデオを見れば、連続培養装置、ライト、顕微鏡を統合して、光遺伝学的微生物を刺激し、研究する方法を十分に理解できるはずです。

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