微生物光遺伝学アプリケーションのための自動照明、培養、およびサンプリングシステムの設計と実装

この手順の全体的な目標は、光遺伝微生物の照明に対する応答を顕微鏡でリアルタイムかつ数日間にわたって自動的に測定できる連続培養容器を組み立てることです。この方法は、動的遺伝子発現が静的遺伝子発現とは異なる応答をどのように引き出すことができるかなど、細胞生物学および代謝工学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、連続培養により、数日間にわたって測定値を収集できることです。

まず、デジタル温度計のグランドライン、データライン、および正電圧ラインをプリント回路基板にはんだ付けします。メスの 3 ピン ヘッダーから 1 つのピンを切り取り、残りの 2 つのピンをトリミングします。これをR2とラベル付けされた穴のペアにはんだ付けし、ピンヘッダーに4.7キロオームの抵抗を挿入して、はんだ付けされた2つのピンを接続します。

次に、残りのコンポーネントを回路基板に接続します。回路基板をマイクロコントローラーにオーバーレイします。耐光エンクロージャーをセットアップし、付属のテキストプロトコルで説明されているようにすべてのソフトウェアをインストールします。

まず、アルミポートの長い方の端をガスケットを通して培養容器に入れ、キャップをねじ込みます。1つの短いアルミニウムポートアウトレットを中径のシリコンチューブで覆います。メスのルアーロックを挿入し、次にオスのルアーロックプラグを接続して、蒸留端を塞ぎます。

このアウトレットは補助的なものであり、使用されません。中径シリコンチューブの2つの短いセグメントをオスとメスのルアーロックで接続します。次に、一方の端を短いアルミポートコンセントに接続し、蒸留端を差し込みます。

血管はこのチューブを通して接種されます。次に、2本のミディアムチューブをミディアム径のチューブとコネクターの端に接続します。一方の端を短いアルミニウムポートに接続し、もう一方の端を差し込みます。

後で、これはメディアフラスコに接続されます。中径のシリコンチューブを最も長いアルミニウムポートに接続します。チューブは、メディアフラスコに届くように十分な長さにする必要があります。

数インチの長さの別の短いセグメントを端まで接続し、メディアフラスコのゴム栓に挿入します。cl チューブ。後でクランプを解除すると、この接続により、培養物を混合、曝気し、入ってくる気泡によって陽圧に保つことができます。

フラスコの底に達するのに十分な長さの中径チューブを、メディアが移送されるストッパーに挿入します。これに別の中径チューブを接続し、次に端に幅の広いチューブを接続します。蒸留端を差し込みます。

ストッパーの3番目の穴を中径チューブの短いセグメントで埋め、他の2つの中径チューブセグメントに接続し、蒸留端で差し込みます。これは真空ポンプに接続され、後で水槽ポンプに接続されます。オスルアーロックを小径シリコンチューブのセグメントに挿入し、PTFEチューブをしっかりと挿入します。

次に、メスのルアーロックを中径のチューブに取り付けます。メスロックをPTFEチューブに沿ってねじ込み、ロックともう一方を短いアルミニウムポートに接続します。培養容器内のPTFEチューブが、2番目に長いアルミニウムチューブの下、および底より上にぶら下がっていることを確認してください。

必要に応じてトリミングします。メディアはここからイメージングチャネルまでサンプリングされ、細いチューブは中間ボリュームを最小限に抑えます。次に、露出した細いシリコンチューブを狭いチューブとコネクタに接続します。

これに、狭径チューブの3つのセグメントとPTFEチューブの2つのセグメントを交互に接続します。これを中径のチューブを介して排水フラスコに接続します。次に、中径のシリコンチューブの一方の端を、流出フラスコのもう一方の端にあるアルミニウムポートの2番目に長いチューブに接続します。

このアルミチューブが培養量を設定し、余分な培養物が廃液容器にあふれます。フラスコの蓋をアルミホイルで包み、アセンブリを摂氏121度、15PSIで30分間オートクレーブします。真空フィルターを100ミリリットルのボトルに取り付けます。

ニップルカバーを取り外し、滅菌ピンセットで真空フィルターのニップルから白いプラグを取り外します。幅広のシリコンチューブをニップルに接続し、メディアフラスコのもう一方のフリーチューブを真空ポンプに接続し、メディアフラスコを培養容器に接続する3番目のチューブがクランプで閉じていることを確認します。フィルターにメディアを入れ、真空ポンプをオンにしてから、残りのメディアをろ過します。

clamp 真空に接続されたミディアムシリコンチューブを停止し、真空ポンプをオフにします。真空ポンプに接続されたミディアムシリコンチューブの中間セグメントからルアーを取り外し、滅菌シリンジエアフィルターの青い端をこのチューブに挿入します。次に、幅の広いシリコンチューブをクランプし、オスのルアーを外します。

培養容器のメディアインレットチューブのメスルアーからプラグを外します。これらのルアーを接続して、培地を培養容器に送り込むことができます。次に、100ミリリットルのボトルからフィルターを取り外し、ボトルキャップを取り付けます。

このメディアを使用して、スターターカルチャーを準備します。連続培養アッセンブリーを顕微鏡の近くに設置し、培地フラスコを培養容器より高くし、廃液フラスコを培養容器より低くして逆流を防ぎます。メディアと廃液フラスコのゴム栓をしっかりとテープで留めます。

次に、PTFEチューブの端をそれらを接続する細いシリコンチューブからプラグを抜き、これらの端を準備されたマイクロ流体デバイスの入口と出口に差し込みます。次に、シリンジエアフィルターの白い端を水槽ポンプに接続して、培地を培養容器に押し込みます。媒体が排水ポートのレベルに達したら、中媒体入口チューブとコネクタを低速蠕動ポンプに巻き付け、狭いサンプル出口チューブとコネクタを高速蠕動ポンプに巻き付けます。

メディアフラスコと培養容器の間のエアチューブのクランプを解除して、メディアを曝気します。次に、加熱パッドと温度計を培養容器にテープで固定して、温度を制御できるようにします。培地チューブを培養容器の周りに巻き付けて、入る培地が容器と同じ温度になるようにします。

次に、LEDマトリックス上の黒いフォームエンクロージャーに培養容器を挿入し、チューブが挟まれていないことを確認します。バイオリアクターコントローラープラグインを使用して、低速メディアポンプを30秒間隔の10分の1ずつオンに設定します。流量は非常に低くなりますが、蒸発速度よりも大きくなります。

入ってくるエアチューブをメディアフラスコと培養容器の間に固定します。ピペットを使用して、スターター培養物から1ミリリットルを培養容器に接種します。次に、このチューブの蒸留端をクランプし、エアチューブのクランプを解除します。

文化が一夜にして成長するのを待ちます。光が入らないようにエンクロージャーを覆います。翌日、バイオリアクターコントローラープラグインを使用して、目的の媒体とサンプリング流量に対応して、蠕動ポンプをより長い時間回転するように設定します。

培養密度を一晩平衡化させます。翌日、ステージポジションリストとマイクロマネージャーを、マイクロ流体チャネルに送り込まれた細胞が焦点面にあるオーバーラップしない位置のセットで埋めます。次に、バイオリアクターコントローラープラグインを開きます。

プロンプトから目的のLEDマトリックスの時間経過、イメージングチャネル、およびその他の実験設定を選択し、データの収集を開始します。この装置は、誘導性光遺伝学的転写システムを介して青色光に応答して黄色の蛍光タンパク質を発現する出芽酵母の培養を刺激するために使用されました。マイクロ流体チャネルのベースコントラストと蛍光画像を取得しました。

位相差画像から細胞の輪郭を同定し、蛍光画像にマッピングし、蛍光画像をリアルタイムで記録しました。このヒートマップは、光遺伝系の活性化による黄色蛍光タンパク質産生による培養物の蛍光分布を示しています。約170, 000個の細胞の蛍光を、28のステージ位置から70時間以上にわたって取得した30, 000枚以上の画像から分析しました。

この研究では、培養物をさまざまな強度の青色光に6時間間隔でさらし、その後6時間の完全な暗闇にさらしました。細胞は最初の測定前に光にさらされていたため、最初の暗期には蛍光強度が低下します。一度習得すると、このテクニックは、適切に実行されれば、3日間で8時間で行うことができます。

この手順を試みるときは、滅菌技術を使用することが非常に重要です。この手順に続いて、リアルタイムフィードバック制御などの他の方法を使用して、タンパク質濃度を制御することができます。この技術により、光遺伝学的構築物を持つ生物を、プレートやバッチ培養を使用して可能なものよりも長い時間、長期間にわたって動的に研究することができます。

このビデオを見れば、連続培養装置、ライト、顕微鏡を統合して、光遺伝学的微生物を刺激し、研究する方法を十分に理解できるはずです。