Name: ヒト神経筋接合部の光遺伝学的モデルの工学と特徴付け (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学ぶ光遺伝学的刺激と動画処理を用いたヒト神経筋接合部の機能的定量評価法。神経毒や重症筋無力症患者血清による機能低下を検出し、神経筋疾患の病態解明と治療薬開発に応用可能です。

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我々は、NIH[助成金番号EB025765及びEB027062]、国防総省[受賞番号W81XWH-18-1-0095]及びUCSFヘルス・イノベーション・バイ・エンジニアリング(HIVEフェローシップ)による資金支援に感謝する。コロンビア大学幹細胞コアの細胞リプログラミングに関する支援と指導に感謝します。

この研究のためのすべての細胞株は、コロンビア大学、ニューヨーク州、米国の制度的ガイドラインに準拠して作成され、使用された。
1. バイオリアクターの準備
<ol><li>バイオリアクター金型を作る<ol>
<li>補足CADファイルからバイオ リアクターCADファイル をダウンロードするか、カスタム独自の設計を作成します。</li>
		<li>CAM ソフトウェアを使用して、3D モデルから CNC ツールパスを生成します。</li>
		<li>CNCフライス盤を使用してアセタール金型を加工します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>バイオリアクターの製作<ol>
<li>ポリジメチルシロキサンの10:1のベースと硬化剤の混合物(PDMS、4つのプラットフォーム/金型あたり77gの混合物)を混合する。</li>
		<li>混合物を真空チャンバーに入れ、すべてのバルブを閉じ、真空をオンにして、気泡が残らなくなるまで混合物を少なくとも30分間脱気する。混合物を金型に注ぎ、真空チャンバ内の金型を1時間脱気する。</li>
		<li>金型の上半分を正しい向きにして金型を閉じます。スチール製の六角形の棒を中央に置き、両側にクランプします。</li>
		<li>上部をPDMSで補充します。</li>
		<li>金型を65°Cのオーブンで少なくとも4時間硬化させます。</li>
		<li>室温まで冷却した後、プラットフォームを金型から取り外します。</li>
		<li>1時間のサイクルの食器用石鹸、400mLの100%イソプロパノール、および蒸留水を使用して、超音波浴中で装置を洗浄する。</li>
		<li>65°Cで一晩乾燥させる。</li>
		<li>ガラスカバースリップを1%非イオン性界面活性剤ポリオールに30分間浸し、カバースリップがすべて適切にコーティングされるように重ならないことを確認します。</li>
		<li>蒸留水でよくすすぎ、65°Cで一晩乾燥させます。</li>
		<li>6 L/分の酸素を含む高い場所でプラズマクリーナーを1〜2分間使用して、ガラスカバースリップとPDMSプラットフォームを処理します。治療が完了したら、PDMSをカバースリップに少なくとも30秒間押し下げて、2つを接着します。</li>
		<li>セルを追加する前に、接着したデバイスをオートクレーブします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 光刺激セットアップの構築
<ol><li>30 mm ケージ キューブ システムを使用して、中央に 573 nm ダイクロイックミラーを取り付けます。赤色の 627 nm LED と 594 nm ロングパス励起フィルターを結合し、LED を鏡に向けるように立方体の上側に取り付けます。次に、 図3Aの回路図に示すように、546nmのショートパス励起フィルタを備えた青色の488nmのLEDを立方体の隣接側に取り付け、LEDをミラーに向けます。</li>
	<li>リング作動式アイリスダイヤフラムをケージキューブの底部に取り付けて、照明領域のサイズを制御します。</li>
	<li>T-Cube LEDドライバで各LEDに電力を供給し、ArduinoのUno Rev3ボードを介して制御します。LEDドライバのサイド入力を電源プラグに接続し、中央出力をArduinoに接続し、サイド出力をLEDに直接接続します。</li>
	<li>Arduino宇野をUSBケーブルでPCに接続します。</li>
	<li>GitHub リンク(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis)からファイルをダウンロードします。</li>
	<li>GitHubフォルダから「Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino」ファイルを開きます。</li>
	<li>開始パラメータを設定する: ステップ = 30;開始周波数 = 0.5;終了周波数 = 3;パルス長 = 100。</li>
	<li>ピン出力 4 が青色 LED ドライバに割り当てられ、ピン出力 2 が赤色 LED ドライバに割り当てられていることを確認します。LEDドライバの中央のワイヤがグランドとそれぞれのピン出力に接続されていることを確認します。</li>
	<li>"Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" プログラムをコンパイルして Arduino にロードします。</li>
	<li>各LEDドライバを対応するチャネルに接続します。</li>
</ol>細胞培養セットアップ(-21-0日目)
<ol><li>初代骨格筋細胞<ol>
<li>筋緊張性増殖培地(+サプリメント)を用いて、一次骨格筋芽細胞(クックミオサイトから得られた)を最大6継代まで解凍し、展開する。細胞を37°Cおよび5%CO2に設定したインキュベーター内で維持する。</li>
		<li>メディアは 2 日ごとに交換します。</li>
		<li>細胞が約60%コンフルエントになったら、0.05%トリプシン-EDTA(1x、37°Cで5分間)を用いてそれらを継代する。解離した細胞を収集し、トリプシンを中和するために新鮮な培地を加える。</li>
		<li>細胞を300 x g でスピンダウンし、細胞ペレットの上の上清を吸引します。</li>
		<li>細胞をMGMで再懸濁し、三重層フラスコあたり60mLで1:3にシードする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ChR2-hiPSC 注:この研究のためのすべての細胞株は、コロンビア大学、ニューヨーク州、米国の機関ガイドラインに準拠して作成され、使用されました。このプロトコールでは、ChR2発現hiPSCを前述の方法18を使用してCRISPR-Cas9ゲノム編集を介して生成しましたが、任意の安定な光遺伝学的細胞株(レンチウイルス、ピギーバックなど)を同じ方法で使用できます。iPS細胞および運動ニューロンの両方において発現される構成的プロモーター(CAG)を選択した。この細胞は、以前の刊行物18、19に記されているように、健康な核型を有することが見出された。<ol>
<li>6ウェルプレートをDMEM/F12(1:80)で希釈した1mL/ウェルの可溶化基底膜マトリックスでコーティングし、プレートを室温で1時間インキュベートする。</li>
		<li>2 mLのフィーダーフリー細胞培養培地(iPSC培地)でコーティングした6ウェルプレート上の種iPSCを、1日おきに2 mLの培地を交換し、5〜7日ごとに継代する。細胞を37°Cおよび5%CO2に設定したインキュベーター内に維持する。</li>
		<li>継代<ol>
<li>1mLの酵素非含有幹細胞放出試薬と共に4分間インキュベートし、広いチップP1000ピペットで機械的に剪断することにより、幹細胞を解離させる。</li>
			<li>iPSC培地中に1:24または1:48の比率で細胞を2mL/ウェルのY-27632二塩酸塩2μMとともにコーティングされた6ウェルプレート上にシードします。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>骨格筋組織播種(-3日目)
<ol><li>自動セルカウンターを使用して、30 x 106 筋芽細胞を単離してカウントします。</li>
	<li>筋芽細胞を、3mg/mLコラーゲンIと可溶化した基底膜マトリックスの4:1混合物に再懸濁する(800μLのコラーゲン混合物+200μLの基底膜マトリックスを最終容量1mLに達する)。コラーゲン成分については、付随する中和剤(中和剤に対するコラーゲンの9:1混合物)を加え、混合物を1x PBSで希釈して800μLの体積を達成する。</li>
	<li>バイオリアクターの各筋肉チャンバーに15 μLの細胞コラーゲン懸濁液を加え、ピペットチップを使用して懸濁液を両方のピラーに広げるようにします(図2)。</li>
	<li>細胞とゲルの混合物を37°Cで30分間重合させ、次に各バイオリアクターウェルに450μLの筋緊張性増殖培地を充填する。</li>
	<li>3日後(ゲルが圧縮されたら)、筋管分化を開始する。</li>
</ol>5.筋管分化(0-14日目)
<ol><li>組織を450μLの融合誘導培地(FS、表1)に7日間切り替え、 1日おきに培地を交換することにより、筋管注入を開始する。 注:両方の細胞型の分化スケジュールの最後に運動ニューロンを播種するために、hiPSCからの運動ニューロン分化と同じ日に筋管分化を開始してみてください。</li>
	<li>7日目に培地を450 μLの成熟培地Iaに変更する(MMIa、 表1)。</li>
	<li>9日目に、450 μLの成熟培地Ibに変更する(MMIb、 表1)。</li>
	<li>11日目に、培地を450 μLのNbActiv4に変更します。運動ニューロンが播種されるまで2日ごとに培地を交換し続ける(ステップ7)。</li>
</ol>6. 元ニューロン分化(0~14日目)
注:我々の運動ニューロン分化プロトコルは、Maury et al8から適応された。
<ol><li>0日目に、4 x106 ChR2-hiPSCsを、15 mLの運動ニューロン浮遊培養培地(MSCM、 表1)を含む超低付着シャーレに移す。MSCMを3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542水和物および5 μM Y-27632二塩酸塩で補います。</li>
	<li>2日目に、37 μM 可逆ストレーナーでニューロスフェア(NS)を単離し、3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542水和物、および0.1 μM レチノイン酸を含む15 mLのMSCMに再プレートします。NSは、2日目以降に顕微鏡を使用せずにペトリ皿に見えるはずです。</li>
	<li>4日目に、細胞と培地を50mLチューブに移し、ニューロスフェアが底に沈降するのを待ちます(5分)。上清を吸引し、0.5 μM SAG、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431541、および0.1 μM レチノイン酸を添加した 15 mL の MSCM に細胞を再懸濁します。</li>
	<li>7 日目に、ステップ 6.3 を繰り返します。しかし、0.5 μM SAGおよび0.1μMレチノイン酸を添加した15 mLのMSCMに細胞を再懸濁する。</li>
	<li>9 日目に、手順 6.3 を繰り返します。しかし、10μM DAPTを添加した15mLのMSCMに細胞を再懸濁する。</li>
	<li>11 日目に、手順 6.3 を繰り返します。しかし、20ng/mLのBDNFおよび10ng/mLのGDNFを添加した15mLのMSCMに細胞を再懸濁する。</li>
	<li>14日目に、運動ニューロンをプラットフォームに播種する。</li>
</ol>7. バイオリアクターに運動ニューロン凝集体を播種する(14日目)
<ol><li>2 mg/mL のコラーゲン I とマトリゲルの 4:1 ゲル混合物を調製します (800 μL のコラーゲン混合物 + 200 μL のマトリゲルで最終容量が 1 mL に達するまで)。コラーゲン成分については、付属の中和剤(中和剤にコラーゲンを9:1ミックス)を加え、混合物を1x PBSで希釈して、最終容量800μLにします。</li>
	<li>400 nmの細胞ストレーナーを使用して大きなニューロスフェアを選択し、それらをゲル混合物に再懸濁します。</li>
	<li>リザーバから媒体を吸引し、神経圏ウェルから慎重に吸引します(図2)。</li>
	<li>15μLのゲル混合物をニューロスフェアチャネルに加える。</li>
	<li>10 μLのピペットに10 μLのゲルをロードし、1つのニューロスフェアを選択します。</li>
	<li>NSをニューロスフェアチャネルに沈着させ、NSがチャンバー内にあることを確認する。NSが沈着したら、残りのゲルを解放しながらゆっくりとピペットを持ち上げます。NSが正しく堆積したかどうかわからない場合は、顕微鏡を使用してNSの位置を確認してください。</li>
	<li>ゲルを37°Cで30分間重合させる。</li>
	<li>20 ng/mL BDNF および 10 ng/mL GDNF を添加した NbActiv4 を 450 μL リザーバーに加えます。</li>
	<li>NSから筋肉組織への軸索成長を可能にするために、1日おきに培地を交換する。</li>
</ol>8. NMJ機能の同時光刺激とビデオ録画(24日目以上)
<ol><li>イメージングには、科学的な相補型金属酸化膜半導体(sCMOS)カメラを備えた倒立蛍光顕微鏡を使用してください。</li>
	<li>カメラソフトウェアのビニングを2x2、露出を20ミリ秒、ローリングシャッターON、読み出しレートを540MHz、ダイナミックレンジ:12ビット&ゲイン1、センサーモード:オーバーラップに設定します。</li>
	<li>顕微鏡で2倍の対物レンズを使用して、微小組織を画像化します。</li>
	<li>生細胞チャンバー(37°C、5%CO2)を顕微鏡ステージに取り付けます。</li>
	<li>神経支配された骨格組織組織を含む関心領域(ROI)を選択して、ファイルサイズと処理時間を最小限に抑えます。</li>
	<li>サンプルとイメージング対物レンズの間に594nmのロングパス発光フィルターを配置して、カメラからの青色光パルスをフィルタリングします。</li>
	<li>4つのバイオリアクター(24組織)を含む長方形の4ウェルプレートを生細胞チャンバーに入れる。</li>
	<li>[ ライブ ビュー] をクリックします。画像を中央に配置し、目的のROIに焦点を合わせます。</li>
	<li>GitHub フォルダー (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) からカスタムマクロコードをアップロードして、ステージの位置、Arduinoボード、およびビデオ集録を制御します。</li>
	<li>出力ムービーを day_tissue group_tissue name_experiment.nd2 に設定します。</li>
	<li>ステージ上で設定した目的のX、Y座標でマクロコードを実行し、50フレーム/秒で1700フレームの高速タイムラプスを取得します。</li>
	<li>イメージング後に培地を交換し、サンプルをインキュベーターに戻します。組織の疲労を避けるために、画像取得セッションの間に少なくとも24時間かかります。</li>
</ol>9. バッチ処理と分析(24日目以降)
<ol><li>動画処理<ol>
<li>カスタムMATLABコードを使用して、バッチ分析でビデオを処理します。ファイルは GitHub フォルダ (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) からダウンロードできます。これらの機能を表 2 にリストし、説明します。 注: このコードは、.nd2 および .czi 形式と互換性があります。MATLABでアクティブ化するには並列処理が必要であり、バイオフォーマットパッケージが必要です。</li>
		<li>再帰的OSAnalysis スクリプトを実行して、並列処理によってムービーを分析します。取得したすべてのビデオを同じフォルダに保存し、コードの実行時にそのフォルダを選択します。</li>
		<li>必要に応じて、解析後のパラメータを調整します。<ol>
<li>記録の開始時に自発的な収縮が拾われた場合は、 baselineTime (オプション 1) を変更します。これは0を超える最初の読み取り方法を示し、補正するためにフレームをシフトする必要があります。</li>
			<li>収縮が登録されていない場合は、 peakThreshold (オプション 2) を変更します。このコードは、デフォルトで最高ピークの 25% を超える収縮を検出し、この値を変更できるようにします。</li>
			<li>minMinProminence と minMinWidth を変更して、各ピークの開始を検出するときの感度を調整します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ビデオとグラフの出力を生成します。<ol>
<li>recursiveOSMovieを実行して、それぞれの収縮性トレースを持つ各組織のビデオファイルを生成します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. NMJ関数の摂動(24日目以降)
<ol><li>20 ng/mL BDNF および 10 ng/mL GDNF を添加した NbActiv4 基礎培地に外部エフェクターを添加して、治療培地を調製します。<ol>
<li>MG血清実験のために、NbActiv4 + BDNF + GDNF中の20%MG患者血清を使用する。</li>
		<li>BTX 実験には、NbActiv4 + BDNF + GDNF で 5 μg/mL の BTX を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ3.2を使用して刺激/画像化する。をクリックしてベースラインを記録します。</li>
	<li>組織内の培地を治療培地(450 μL/組織)と交換します。</li>
	<li>所望の時間(患者血清の場合は48時間、BTXの場合は20時間)インキュベートする。</li>
	<li>ステップ3.2を使用して再び刺激/イメージします。治療後の機能を記録する。</li>
	<li>治療培地を除去し、組織を所望の時間(血清除去後48時間)休ませる 注:組織の疲労を避けるために、刺激とイメージングの間に少なくとも24時間かかります</li>
</ol>

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著者らは利益相反がないと宣言しています。

このシステムは、光遺伝学とビデオ処理を組み合わせて、NMJ機能の自動的かつ偏りのない評価を可能にする、設計された3Dヒト組織モデルです。標準化されたプロトコールを用いて、生理学的発達中のNMJ機能の変化を測定し、神経毒曝露および重症筋無力症患者血清などの病状の有害な影響を特徴付ける能力を実証した。
以前の研究は、MG患者血清を用いた骨格筋管との共培養において、光遺伝学的hPSC由来運動ニューロンを有するMGをモデル化する能力を報告している22。しかし、システムは2Dにあり、ランダムな場所で収縮を記録したため、再現性が制限され、モデルの定量的能力が低下しました。2Dシステムと比較して、私たちのシステムの最大の利点の1つは、MNとSkMsの間の細胞的および形態学的発達をより正確に促進する3D環境をエミュレートできることです。組織がその本来の生理学のように振る舞うために必要な生体力学的手がかりが、3Dシステムにおいて優れて模倣されていることを裏付ける大きな証拠がある13,14,15,16<su...

神経筋接合部(NMJ)は、運動ニューロン(MN)と骨格筋細胞(SkM)との間の化学シナプスであり、筋肉の収縮を可能にする。神経毒α - バンガロトキシン(BTX)などの毒素、または重症筋無力症(MG)のような神経筋疾患(NMD)は、NMJの変性および筋肉制御の低下をもたらし得る1。バイオエンジニアリングされたヒト組織モデルは、ヒトNMJの機能的および生理学的メカニズムをよりよく再現し、動物モデルよりも大きな翻訳可能性を提供する。
動物モデルはNMJの形成と機能の理解を進めてきたが、ヒトと動物のシナプスの間には、ヒトへの結果の翻訳を制限し、NMJのインビボ特性評価を困難にする有意な違いがある2,3,4。研究では、マウスとヒトのNMJの間に明確な生理学的違いが示されています。マウスは、ヒトNMJと比較してNMJが大きく、活性ゾーン密度が小さくなっています4。さらに、動物モデルで実施された薬物研究は、ヒト臨床試験で見出された効果を必ずしも反映しているとは限らない。操作されたヒト組織モデルは、NMJの健全な発達および神経筋疾患の病理を研究する機会を提供し、薬物スクリーニングを可能にする。ヒト人工多能性幹細胞(hiPSCs)5は、骨格筋細胞6,7および運動ニューロン8,9を含む様々な細胞型に分化させることができる。hiPSCは患者細胞から容易に生成することができ、患者固有の組織モデルを通じて、より良い疾患モデリング10および薬物スクリーニング11,12を可能にする。
SkMsとMNの2次元(2D)単層共培養は、生理学的NMJの形態、表現型、組織、および機能的挙動を欠いている。 NMJは2D培養においてランダムに形成され、分析のための運動ユニットの単離を阻害し、正確な機能測定を制限し、反復的で体系的な実験のためのそれらの使用を妨げる13.NMJの3次元(3D)組織モデルは、これらの制限の多くを克服し、生理学的NMJの形態学的および機能的特徴を反復する7、14、15、16、17。このモデルを使用して、2つの組織タイプを別々に開発し、軸索成長を導くことによって統合し、2D培養システムと比較してより組織化されたNMJを発達させることを可能にする。
我々の以前の研究は、光遺伝学と組織工学を組み合わせることで、NMJ機能の正確な非侵襲的刺激および評価を可能にすることを実証した18,19。遺伝子工学を通じて、光感受性タンパク質をhiPSCのゲノムに組み込むことができます。青色光に応答して開くイオンチャネルであるチャネルロドプシン-2(ChR2)をニューロンなどの興奮性細胞の膜に統合することで、細胞活性化に対する非接触時空間制御が可能になる20、21、22。ChR2を担持するhiPSCは、青色光に敏感な光遺伝学的運動ニューロンに分化することができ、ニューロンを刺激する典型的な侵襲的電極の必要性を排除し、電極23による筋細胞の望ましくない刺激を回避する。このシステムは、光遺伝学的運動ニューロンを使用して、非光遺伝学的骨格筋細胞の収縮を刺激する。ビデオ取得と制御された青色光照明を組み合わせることで、共培養組織を同時に刺激し、NMJ機能のために記録することができます。
MGは、ニコチン性アセチルコリン受容体(AChR)を標的とする自己抗体によって引き起こされ、NMJ機能の低下および筋力低下をもたらす24。これは、提示された症状、電気診断、および血清学的血液検査による自己抗体の検出に基づいて診断される。しかし、MGに関与するすべての自己抗体が同定されているわけではなく、一部の血清陰性患者はMGと診断されているが、認識された抗体はない25,26。我々のシステムは、MG患者からの血清の添加前後のNMJの繰り返しの機能評価を可能にし、MG抗体によって引き起こされる機能的および生化学的変化に関する非常に貴重な洞察を提供する18。当社のプロトコルは、NMJ病理の診断と調査、および潜在的な治療法の試験に使用できる機能的ヒトNMJの3Dインビトロモデルを作成する方法を示しています。我々は、マイクロ流体デバイスとより大きなオープンウェルバイオリアクタープラットフォームの2つのプラットフォームでシステムの汎用性を実証しています。

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SkMDC</td><td>Cook Myosite</td><td>P01059-14M</td><td></td></tr><tr><td>培地およびサプリメント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12634-020</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン溶液</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>G-5サプリメント (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>Insulin, Recombinant Human</td><td>Millipore Sigma</td><td>91077C-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>MyoTonic Growth Media Kit</td><td>Cook Myosite</td><td>MK-4444</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NbActiv4 500 mL</td><td>BrainBits LLC</td><td>Nb4-500</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Medium ThermoFisher Scientific</td><td>A13710-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mm ケージキューブシステム</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4</td><td></td></tr><tr><td>37 & micro;m リバーシブルストレーナー、大型</td><td>幹細胞技術</td><td>27250</td><td></td></tr><tr><td>546 nm ショートパス励起フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF01-546/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>573 nm ダイクロイックミラー</td><td>Semrock</td><td>FF573-Di01&ndash;25x36</td><td></td></tr><tr><td>594 nmロングパス発光フィルター</td><td>Semrock</td><td>BLP01-594R-25</td><td></td></tr><tr><td>594 nmロングパス励起フィルター</td><td>Semrock</td><td>BLP01-594R-25</td><td></td></tr><tr><td>SinkPAD-II 10mmスクエアベース上の青色(470nm)反逆型LED - 65 lm @ 700mA</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>SP-05-B4</td><td></td></tr><tr><td>Carclo 29.8&deg;つや消し 10 mm 円形ビーム光学 - 統合脚</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>10413</td><td></td></tr><tr><td>Corning 60 mm 超低アタッチメント カルチャー ディッシュ</td><td>Corning</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>ヒートシンク</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>LPD-19-10B</td><td></td></tr><tr><td>Optics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 400 & micro;m、25パック、滅菌</td><td>PluriSelect</td><td>43-50400-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 500 &micro;m、25パック、滅菌済み</td><td>PluriSelect</td><td>43-50500-03</td><td></td></tr><tr><td>赤 (627nm) 反逆型LED SinkPAD-II 10mmスクエアベース - 65 lm @ 700mA</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>SP-05-R5</td><td></td></tr><tr><td>リング作動式虹彩ダイアフラム</td><td>ThorLabs SM1D12D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-Cube LEDドライバー</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B, KPS101</td><td></td></tr><tr><td>Molds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>雌ねじ六角スタンドオフ、&nbsp;3 1/2 "10-32、部分的にねじ込まれた1 / 2 "</td><td>McMaster</td><td>91920A046</td><td></td></tr><tr><td>ロープロファイル&nbsp;Cクランプ</td><td>マクマスター</td><td>1705A12</td><td></td></tr><tr><td>成長因子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 3&prime;,5&prime;-環状一リン酸</td><td>ミリポア Sigma</td><td>A9501-1G</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021、10 mg</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>DAPT 10 mg</td><td>R&D Systems</td><td>2634/10</td><td></td></tr><tr><td>ヒト CNTF、研究グレード、5 &micro;g</td><td>ミルテニルバイオテック</td><td>130-096-336</td><td></td></tr><tr><td>ヒトビトロネクチンタンパク質、CF</td><td>R&D Systems</td><td>2349-VN-100</td><td></td></tr><tr><td>ヒトビトロネクチンタンパク質、CF</td><td>R&D Systems</td><td>2349-VN-100</td><td></td></tr><tr><td>IGF1 組換えヒトタンパク質</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0078</td><td></td></tr><tr><td>ラミニンマウスタンパク質、天然</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト Agrin タンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>6624-AG-050</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト GDNF タンパク質、CF 50ug</td><td>R&D Systems</td><td>212-GD-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトニューロトロフィン 3&nbsp;100 ug</td><td>細胞科学</td><td>CRN500D</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトニューロトロフィン-4</td><td>細胞科学</td><td>CRN501B</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト ソニック ヘッジホッグ/SHH (C24II) N-ターミナス</td><td>R&D Systems</td><td>1845-SH-100</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト/マウス/ラット BDNF 50 ug</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>レチノイン酸、50 mg</td><td>ミリポアシグマ</td><td>R2625-50</td><td></td></tr><tr><td>SAG スムージング アゴニスト</td><td>ミリポア シグマ</td><td>566660</td><td></td></tr><tr><td>SB431542 10 mg</td><td>幹細胞技術</td><td>72234</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS LDN-193189</td><td>ミルテニル バイオテック</td><td>130-103-925</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血漿からのビトロネクチン</td><td>ミリポア Sigma</td><td>V8379-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二塩酸塩</td><td>トクリス</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&-アクチニン mAb (マウス IgG1)</td> <td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>コリン アセチルトランスフェラーゼ (ChAT) (ヤギ)</td> ミリ<td>ポア</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>デスミン mAb (マウス IgG1)</td><td>ダコ</td><td>M076029-2</td><td></td></tr><tr><td>ミオシン重鎖 (MHC) (マウス IgG2b)</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno R3</td><td>Arduino</td><td>A000066</td><td></td></tr><tr><td>自動ステージ</td><td>応用科学機器</td><td>MS- 2000 XYZ</td><td></td></tr><tr><td>エキスパンドプラズマクリーナー</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001&nbsp;(115V)</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Countess 全自動セルカウンター</td><td>Marshal Scientific</td><td>I-CACC</td><td></td></tr><tr><td>IX-81 倒立蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX-ILL100LH</td><td></td></tr><tr><td>シリーズ ステージトップインキュベーターシステム</td><td>Tokai Hit STX</td><td>TOKAI-HIT-STXG</td><td></td></tr><tr><td>Zyla 4.2 sCOMS Camera</td><td>Andor Technology</td><td>ZYLA-4.2P-CL10</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino ソフトウェア (IDE)</td><td>Arduino</td><td>IDE 1.8.19</td><td></td></tr><tr><td>Mastercam</td><td>Mastercam</td><td>Mastercam for Solidworks</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Matlab</td><td>R2021b</td><td></td></tr><tr><td>NIS elements</td><td>Nikon</td><td>Basic Research</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks 3D CAD</td><td>Solidworks Solidworks</td><td>Standard</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト神経筋接合部の光遺伝学的モデルの工学と特徴付け

Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction

重症筋無力症(MG)などの多くの神経筋疾患は、神経筋接合部(NMJ)の機能不全と関連しており、動物とヒトの生理学的差異のために動物モデルで特徴付けることは困難である。組織工学は、NMJ病理の診断と調査、および潜在的な治療法の試験に使用できる機能的ヒトNMJの in vitro モデルを提供する機会を提供します。誘導多能性幹細胞(iPSC)に光遺伝学的タンパク質を組み込むことで、特定の波長の光で刺激できるニューロンを作製しました。NMJが健康で機能的である場合、運動ニューロンからの神経化学的シグナルは筋肉収縮をもたらす。光遺伝学と微細加工を組織工学と統合することにより、ビデオ解析を使用してNMJ機能を特徴付けるための偏りのない自動化された方法論を確立しました。NMJ形成、同時ビデオ録画による光刺激、および組織収縮性のビデオ分析のために標準化されたプロトコルが開発された。骨格筋収縮を誘導するための光による光遺伝学的運動ニューロンの刺激は、ヒトNMJ生理学を反復し、時間の経過とともに様々な入力に応答してNMJの反復機能測定を可能にする。我々は、このプラットフォームの能力が時間の経過とともに神経筋接続性の機能的改善を示し、NMJ機能に対する患者のMG抗体または神経毒の有害な影響を特徴付ける能力を実証します。

神経筋接合部は、光遺伝学的hiPSC由来運動ニューロンを非光遺伝学的骨格筋組織と共培養することによって生成された。ヒト原発性骨格筋芽細胞(SkM)をプラットフォームに播種し、2週間のプロトコールを用いて多核筋管に分化させた。光遺伝学的運動ニューロンを別々に分化させたが、筋管分化と並行して、次いでプラットフォームに播種した(図1)。組織は、MN播種後7〜12日目に青色光刺激に応答して収縮し始め、NMJの発達および成熟が成功したことを示している。NMJは、運動ニューロン播種後最大40日間培養、刺激、および画像化することができるが、最適な時点は16〜19日目に生じる。光遺伝学的タンパク質の分化および存在の形態学的および生化学的検証は、補足図1に示されており、以前の研究18,19で検証されている。
プロトコルが異なる培養系に容易に適応...

我々は、ヒト工学的骨格筋組織および光遺伝学的運動ニューロンを用いて神経筋接合機能を特徴付けるための、再現可能で自動化された、偏りのないイメージングシステムについて記載する。このシステムは、経時的な神経筋接続性の機能的定量化を可能にし、神経毒および重症筋無力症患者血清によって引き起こされる神経筋機能の低下を検出する。

Many neuromuscular diseases, such as myasthenia gravis (MG), are associated with dysfunction of the neuromuscular junction (NMJ), which is difficult to ...

このプロトコルは、神経筋病理を調査し、潜在的な治療法をテストするために使用できる機能的な3D in vitroヒト神経筋接合部を設計する方法を説明しています。この技術は、同時に光遺伝学的刺激とビデオ処理を使用する。これは、発達中および重症筋無力症患者からの神経毒や血清などの外的要因による神経筋接合機能の変化を定量化しています。筋肉細胞と運動ニューロンをバイオリアクターに播種することを含むステップは、最初は困難な場合があります。コラーゲンゲル混合物を氷上に保持することは、ゲルが固化する前にすべての細胞を播種するのに利用可能な時間を延長するのに役立ちます。ポリジメチルシロキサンまたはPDMSの硬化剤混合物に10対1の塩基を混合することから始め、混合物を真空チャンバに入れる。すべてのバルブを閉じ、真空をオンにして、気泡が残らなくなるまで少なくとも30分間混合物を脱気します。混合物を金型に注ぎ、真空チャンバ内の金型を1時間脱気してから、金型の上半分を正しい向きにして金型を閉じます。中央に六角形の鋼棒を置き、両側にクランプします。次に、上部にPDMSを補充し、65°Cのオーブンで少なくとも4時間金型を硬化させます。金型が室温まで冷却されたら、プラットフォームを金型から取り外します。一方、ガラスカバーは1%非イオン性界面活性剤ポリオールを30分間滑り込ませ、カバースリップが重なってすべて適切にコーティングされていることを確認し、蒸留水でよくすすぎ、摂氏65度で一晩乾燥させます。ガラスカバースリップとPDMSプラットフォームは、毎分6リットルの酸素で1〜2分間、プラズマクリーナーを使用して処理します。処理が完了したら、PDMSをカバースリップに少なくとも30秒間押し下げて、2つを接着します。コラーゲン1ミリリットル当たり3ミリグラムと可溶化基底膜マトリックスの4対1ミックスを調製し、次いで、この新しく調製したコラーゲン混合物中に筋芽細胞を再懸濁する。次に、この細胞コラーゲン懸濁液をバイオリアクターの各筋肉チャンバーに15マイクロリットル加え、ピペットチップを使用して懸濁液を両方の柱に広げるようにします。細胞ゲル混合物を摂氏37度で30分間重合させ、次いで各バイオリアクターウェルに450マイクロリットルの筋緊張性増殖培地を充填する。運動ニューロン分化の11日目に、細胞および培地を50ミリリットルのチューブに移し、ニューロスフェアを5分間底に沈降させる。上清を吸引し、脳由来神経栄養因子1ミリリットル当たり20ナノグラムおよびグリア細胞由来神経栄養因子1ミリリットル当たり10ナノグラムを添加した15ミリリットルの運動ニューロン浮遊培養培地に細胞を再懸濁する。分化プロトコールの14日目に、運動ニューロンをプラットフォームに播種する。コラーゲン1と可溶化基底膜マトリックス1ミリリットル当たり2ミリグラムの4対1ゲル混合物を調製する。400ナノメートルの細胞ストレーナーを使用して大きなニューロスフェアを選択し、調製したゲル混合物に再懸濁します。リザーバおよびニューロスフェアウェルから媒体を慎重に吸引し、次いで15マイクロリットルのゲル混合物をニューロスフェアチャネルに加える。10マイクロリットルのピペットに10マイクロリットルのゲルをロードし、1つのニューロスフェアを選択します。ニューロスフェアをニューロスフェアチャネルに沈着させ、それがチャンバー内にあることを確認し、ニューロスフェアが沈着したら残りのゲルを解放しながらゆっくりとピペットを上昇させる。ゲルを摂氏37度で30分間重合させ、次に450マイクロリットルのNbActiv4に、脳由来神経栄養因子1ミリリットルあたり20ナノグラムおよびグリア細胞由来神経栄養因子1ミリリットルあたり10ナノグラムを補充したリザーバに加える。イメージングには、科学的な相補型金属酸化物半導体カメラソフトウェアを備えた倒立蛍光顕微鏡を使用してください。ビニングを2×2、露出を20ミリ秒、ローリングシャッターオン、読み出しレートを540メガヘルツ、ダイナミックレンジを12ビット、ゲイン1、センサーモードをオーバーラップに設定します。顕微鏡の2倍の対物レンズを使用して微小組織を画像化し、生細胞チャンバーを顕微鏡ステージに取り付けます。神経支配された骨格組織を含む関心領域を選択してファイルサイズと処理時間を最小限に抑え、サンプルとイメージング対物レンズの間に594ナノメートルのロングパス発光フィルターを配置して、カメラからの青色光パルスをフィルタリングします。次に、4つのバイオリアクターを含む長方形の4ウェルプレートを生細胞チャンバーに配置し、ライブビューをクリックして画像を中央に配置し、所望のROIで焦点を合わせます。GitHubフォルダからカスタムマクロコードをダウンロードして、ステージ位置、Arduinoボード、ビデオ集録を制御し、出力ムービーを日アンダースコア組織グループアンダースコア組織名アンダースコア実験ドットND2として設定します。ステージ上で設定した目的の X 座標と Y 座標でマクロ コードを実行し、1 秒あたり 50 フレームで 1700 フレームの高速タイム ラプスを取得します。イメージング後、培地を交換し、サンプルをインキュベーターに戻します。組織の疲労を避けるために、画像取得セッションの間に少なくとも24時間かかります。ムービー処理の場合は、GitHub フォルダからファイルをダウンロードし、カスタム MATLAB コードを使用してバッチ分析でビデオを処理します。再帰的なOS分析スクリプトを開き、取得したすべてのビデオを同じフォルダに入れます。事前分析パラメーターを調整し、再帰的 OSAnalysis スクリプトを実行して、並列処理によってムービーを分析します。必要に応じて、ベースライン時間、ピークしきい値、最小分突出度、最小/最小幅などの分析後パラメータを調整します。最後に、recursiveOSMovieを実行してビデオとグラフ出力を生成し、それぞれの収縮性トレースを持つ各組織のビデオファイルを生成します。このプロトコルは、約20,000個の筋芽細胞を含む長さ1ミリメートルの骨格筋組織をもたらすマイクロ流体デバイスと、約450個の筋芽細胞を含む長さ4ミリメートルの筋肉組織をもたらすオープンウェルバイオリアクターシステムという、異なるスケールを有する2つのシステムを用いて試験された。青色光による運動ニューロンの制御された刺激を可能にするために光学セットアップが構築され、NMJ機能はカスタムArduinoコードと組み合わせたカスタム顕微鏡マクロスクリプトを使用して上昇した。このコードには、調整可能な調整可能なパラメータが含まれており、光パルスと収縮性ピークの開始との間の時間に基づいて収縮がトリガされるかどうかを判断します。このシステムは、組織作製の1週間後にトリガー応答の増加を示し、続いてさらに1週間安定した機能を示した組織におけるNMJ機能の改善を捉えた。α-バンガロトキシンは、NMJ機能の完全な破壊をもたらすすべての誘発および自発的収縮を停止し、組織の光刺激が機能的なNMJを必要とすることを実証した。20%重症筋無力症血清で48時間処置した組織の分析は、健康なドナーからの血清で処置した対照組織と比較して機能低下を示した。血清を除去および洗い流してから48時間後、操作されたNMJsは機能の回復を示した。バッチ間の剛性の変動を避けるために、すべてのバイオリアクターが等しい時間オーブンにあることを確認してください。また、必ず顕微鏡を用いて運動ニューロンの播種を確認してください。この手順に続いて、メタバロミクス、プロテオミクス、およびCRISPRスクリーニングを実行して、追加情報を収集し、罹患血清によって引き起こされる機構的変化をよりよく理解することができる。

engineering-characterization-an-optogenetic-model-human-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

マイクロ流体デバイスを使用して神経筋接合部の形成を実演しています。神経前駆細胞と筋前駆細胞は、デバイス内の異なるウェルに播種され、それぞれ運動ニューロンと筋管に成熟するまで放置されます。体積と化学的勾配の生成は、活動的な神経筋接合部の発達につながります。...

マイクロ流体デバイスを用いた神経筋接合部の生成

このビデオでは、機能的な神経筋接合部を評価する方法を示します。筋肉組織と運動ニューロンを含むバイオリアクターと蛍光顕微鏡法を用いて、ニューロン内の光感受性チャネルを刺激して電気信号を生成し、筋線維の収縮を引き起こします。...

同時光刺激とビデオ録画による機能的神経筋接合部の評価

出典: Marinello, M., et al.共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組合せによるマウスの神経筋接合部の特性評価J. Vis.

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部の特性評価

神経筋接合部 (NMJ) の機能評価は、筋肉と神経の間の通信に不可欠な情報を提供できます。ここで使用して 2 つの異なる筋神経剤、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔 NMJ...

神経筋接合部機能を測定

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)からインビトロNJを生成するプロトコルを提供します。この方法は、成熟した形態と機能を有するMJを1ヶ月で単一のウェルで誘導することができる。結果として生じるNmJは、関連する疾患のモデル化、病理学的メカニズムの研究、または治療のための薬物化合物のスクリーニングに使用される可能性がある。...

ヒト人工多能性幹細胞から誘導されるインビトロ神経筋接合

神経筋接合成分を正確に検出する能力は、病理学的または発達的プロセスのために、そのアーキテクチャの変更を評価する上で非常に重要です。ここでは、定量的測定を行うために使用できる全マウント神経筋接合部の高品質画像を得るための簡単な方法の完全な説明を提示する。...

全山神経筋接合部の免疫蛍光解析と形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖

ヒトが誘導した多能性幹細胞由来の運動ニューロンを、機能的に活性な神経筋接合の形成をもたらすヒトの一次メソアンジオ芽細胞由来筋膜と共培養することにより、市販の微小流体デバイスにおけるヒト運動ユニットを生成する方法を説明する。...

マイクロ流体デバイスにおける機能性神経筋接合を有するヒト運動ユニットの生成

このプロトコルは、SMAおよびColQ関連のCMSのマウスモデルの病理学的変化を定量化するために使用される共焦点顕微鏡とSTED顕微鏡の組み合わせによる神経筋接合部の形態測定分析の方法を説明しています。...

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション

このプロトコールは、異なるバイオマーカー、すなわち、ニューロフィラメント200、小胞アセチルコリントランスポーター、α-バンガロトキシン、およびS100を有する蛍光免疫組織化学を用いて、ラット内側腓腹筋におけるシナプス前末端、シナプス後部受容体、およびシナプス周囲シュワン細胞間の空間的相関を調べる方法を示す。...

ラット内側腓腹筋における神経筋接合部の形態学的特徴の可視化

この研究では、げっ歯類モデルにおける神経筋接合部(NMJ)伝達の in vivo 測定を可能にする洗練された単繊維筋電図(SFEMG)プロトコルを示します。ラット腓腹筋のNMJ伝達変動と機能不全を定量化できるように、SFEMG技術への段階的なアプローチが説明されています。...

げっ歯類モデルにおける神経筋接合部伝達を評価するための刺激単繊維筋電図法 (SFEMG)

ここでは、頭蓋長耳挙筋 (LAL) の in vivo...

頭蓋挙筋長耳骨格筋の In vivo エレクトロポレーションと短期再神経支配の組み合わせ

学ぶ光遺伝学的刺激と動画処理を用いたヒト神経筋接合部の機能的定量評価法。神経毒や重症筋無力症患者血清による機能低下を検出し、神経筋疾患の病態解明と治療薬開発に応用可能です。

ヒト神経筋接合部の光遺伝学的モデルの工学と特徴付け

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