ヒト神経筋接合部の光遺伝学的モデルの工学と特徴付け

我々は、ヒト工学的骨格筋組織および光遺伝学的運動ニューロンを用いて神経筋接合機能を特徴付けるための、再現可能で自動化された、偏りのないイメージングシステムについて記載する。このシステムは、経時的な神経筋接続性の機能的定量化を可能にし、神経毒および重症筋無力症患者血清によって引き起こされる神経筋機能の低下を検出する。

このプロトコルは、神経筋病理を調査し、潜在的な治療法をテストするために使用できる機能的な3D in vitroヒト神経筋接合部を設計する方法を説明しています。この技術は、同時に光遺伝学的刺激とビデオ処理を使用する。これは、発達中および重症筋無力症患者からの神経毒や血清などの外的要因による神経筋接合機能の変化を定量化しています。

筋肉細胞と運動ニューロンをバイオリアクターに播種することを含むステップは、最初は困難な場合があります。コラーゲンゲル混合物を氷上に保持することは、ゲルが固化する前にすべての細胞を播種するのに利用可能な時間を延長するのに役立ちます。ポリジメチルシロキサンまたはPDMSの硬化剤混合物に10対1の塩基を混合することから始め、混合物を真空チャンバに入れる。

すべてのバルブを閉じ、真空をオンにして、気泡が残らなくなるまで少なくとも30分間混合物を脱気します。混合物を金型に注ぎ、真空チャンバ内の金型を1時間脱気してから、金型の上半分を正しい向きにして金型を閉じます。中央に六角形の鋼棒を置き、両側にクランプします。

次に、上部にPDMSを補充し、65°Cのオーブンで少なくとも4時間金型を硬化させます。金型が室温まで冷却されたら、プラットフォームを金型から取り外します。一方、ガラスカバーは1%非イオン性界面活性剤ポリオールを30分間滑り込ませ、カバースリップが重なってすべて適切にコーティングされていることを確認し、蒸留水でよくすすぎ、摂氏65度で一晩乾燥させます。

ガラスカバースリップとPDMSプラットフォームは、毎分6リットルの酸素で1〜2分間、プラズマクリーナーを使用して処理します。処理が完了したら、PDMSをカバースリップに少なくとも30秒間押し下げて、2つを接着します。コラーゲン1ミリリットル当たり3ミリグラムと可溶化基底膜マトリックスの4対1ミックスを調製し、次いで、この新しく調製したコラーゲン混合物中に筋芽細胞を再懸濁する。

次に、この細胞コラーゲン懸濁液をバイオリアクターの各筋肉チャンバーに15マイクロリットル加え、ピペットチップを使用して懸濁液を両方の柱に広げるようにします。細胞ゲル混合物を摂氏37度で30分間重合させ、次いで各バイオリアクターウェルに450マイクロリットルの筋緊張性増殖培地を充填する。運動ニューロン分化の11日目に、細胞および培地を50ミリリットルのチューブに移し、ニューロスフェアを5分間底に沈降させる。

上清を吸引し、脳由来神経栄養因子1ミリリットル当たり20ナノグラムおよびグリア細胞由来神経栄養因子1ミリリットル当たり10ナノグラムを添加した15ミリリットルの運動ニューロン浮遊培養培地に細胞を再懸濁する。分化プロトコールの14日目に、運動ニューロンをプラットフォームに播種する。コラーゲン1と可溶化基底膜マトリックス1ミリリットル当たり2ミリグラムの4対1ゲル混合物を調製する。

400ナノメートルの細胞ストレーナーを使用して大きなニューロスフェアを選択し、調製したゲル混合物に再懸濁します。リザーバおよびニューロスフェアウェルから媒体を慎重に吸引し、次いで15マイクロリットルのゲル混合物をニューロスフェアチャネルに加える。10マイクロリットルのピペットに10マイクロリットルのゲルをロードし、1つのニューロスフェアを選択します。

ニューロスフェアをニューロスフェアチャネルに沈着させ、それがチャンバー内にあることを確認し、ニューロスフェアが沈着したら残りのゲルを解放しながらゆっくりとピペットを上昇させる。ゲルを摂氏37度で30分間重合させ、次に450マイクロリットルのNbActiv4に、脳由来神経栄養因子1ミリリットルあたり20ナノグラムおよびグリア細胞由来神経栄養因子1ミリリットルあたり10ナノグラムを補充したリザーバに加える。イメージングには、科学的な相補型金属酸化物半導体カメラソフトウェアを備えた倒立蛍光顕微鏡を使用してください。

ビニングを2×2、露出を20ミリ秒、ローリングシャッターオン、読み出しレートを540メガヘルツ、ダイナミックレンジを12ビット、ゲイン1、センサーモードをオーバーラップに設定します。顕微鏡の2倍の対物レンズを使用して微小組織を画像化し、生細胞チャンバーを顕微鏡ステージに取り付けます。神経支配された骨格組織を含む関心領域を選択してファイルサイズと処理時間を最小限に抑え、サンプルとイメージング対物レンズの間に594ナノメートルのロングパス発光フィルターを配置して、カメラからの青色光パルスをフィルタリングします。

次に、4つのバイオリアクターを含む長方形の4ウェルプレートを生細胞チャンバーに配置し、ライブビューをクリックして画像を中央に配置し、所望のROIで焦点を合わせます。GitHubフォルダからカスタムマクロコードをダウンロードして、ステージ位置、Arduinoボード、ビデオ集録を制御し、出力ムービーを日アンダースコア組織グループアンダースコア組織名アンダースコア実験ドットND2として設定します。ステージ上で設定した目的の X 座標と Y 座標でマクロ コードを実行し、1 秒あたり 50 フレームで 1700 フレームの高速タイム ラプスを取得します。

イメージング後、培地を交換し、サンプルをインキュベーターに戻します。組織の疲労を避けるために、画像取得セッションの間に少なくとも24時間かかります。ムービー処理の場合は、GitHub フォルダからファイルをダウンロードし、カスタム MATLAB コードを使用してバッチ分析でビデオを処理します。

再帰的なOS分析スクリプトを開き、取得したすべてのビデオを同じフォルダに入れます。事前分析パラメーターを調整し、再帰的 OSAnalysis スクリプトを実行して、並列処理によってムービーを分析します。必要に応じて、ベースライン時間、ピークしきい値、最小分突出度、最小/最小幅などの分析後パラメータを調整します。

最後に、recursiveOSMovieを実行してビデオとグラフ出力を生成し、それぞれの収縮性トレースを持つ各組織のビデオファイルを生成します。このプロトコルは、約20,000個の筋芽細胞を含む長さ1ミリメートルの骨格筋組織をもたらすマイクロ流体デバイスと、約450個の筋芽細胞を含む長さ4ミリメートルの筋肉組織をもたらすオープンウェルバイオリアクターシステムという、異なるスケールを有する2つのシステムを用いて試験された。青色光による運動ニューロンの制御された刺激を可能にするために光学セットアップが構築され、NMJ機能はカスタムArduinoコードと組み合わせたカスタム顕微鏡マクロスクリプトを使用して上昇した。

このコードには、調整可能な調整可能なパラメータが含まれており、光パルスと収縮性ピークの開始との間の時間に基づいて収縮がトリガされるかどうかを判断します。このシステムは、組織作製の1週間後にトリガー応答の増加を示し、続いてさらに1週間安定した機能を示した組織におけるNMJ機能の改善を捉えた。α-バンガロトキシンは、NMJ機能の完全な破壊をもたらすすべての誘発および自発的収縮を停止し、組織の光刺激が機能的なNMJを必要とすることを実証した。

20%重症筋無力症血清で48時間処置した組織の分析は、健康なドナーからの血清で処置した対照組織と比較して機能低下を示した。血清を除去および洗い流してから48時間後、操作されたNMJsは機能の回復を示した。バッチ間の剛性の変動を避けるために、すべてのバイオリアクターが等しい時間オーブンにあることを確認してください。

また、必ず顕微鏡を用いて運動ニューロンの播種を確認してください。この手順に続いて、メタバロミクス、プロテオミクス、およびCRISPRスクリーニングを実行して、追加情報を収集し、罹患血清によって引き起こされる機構的変化をよりよく理解することができる。