Name: 制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学ぼう、光遺伝学的制御と遺伝子発現のライブモニタリングを用いて、C2C12細胞における振動情報の細胞間伝達を観察する方法です。Notchシグナル伝達経路を介した細胞コミュニケーションの動態を高精度に解析できます。

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この作品は、進化科学技術 (JPMJCR12W2 (R.K.))、革新的な地域 (文部省、文化、スポーツ、科学、および技術 (文部科学省)、日本の科学研究費補助金科学技術振興機構、さきがけ (人工知能)、コア研究によって支えられました。26119708 (人工知能) と 16 H 06480 (R.K.))、科学 () (日本学術振興会 (JSPS) 24240049 (R.K.))、研究、若手研究 (A) (日本学術振興会 15 H 05326 (人工知能)) と、新学術研究領域「蛍光ライブ イメージング」文部科学省、日本、そしてプラットフォームの動的アプローチの生活システムを文部科学省、日本から。

1. メダカ Tol2 システムによる安定したセルラインの世代
<ol><li>
トランスポザーゼ (メダカ Tol2) 発現ベクター (pCAGGS mT2TP) とともにメダカ Tol2 ベース光モジュールのプラスミッドのベクトル (図 1 a) を transfect C2C12 細胞に。すべての手順 10% 牛胎児血清 (FBS) と 5% CO2、そうでなければ示される存在下で 37 ° c (表 1)、ペニシリン ・ ストレプトマイシン DMEM 培と培養細胞で
	<ol>
<li>細胞カウンターと細胞をトリプシンと/12 ウェル プレートのウェル プレート 5 × 104 C2C12 細胞にトランスフェクション前日をカウントします。</li>
		<li>リポフェクション試薬を用いた transfect メダカ Tol2 ベース光遺伝学的ベクトル (pAI177 または pAI218)、薬物選択ベクトル (pAI170) の 0.125 μ g と 0.5 μ g pCAGGS mT2TP ベクトルの 0.375 μ g が共同。</li>
		<li>Trypsinize transfected セルやトランスフェクション後 1 日 100 mm 培養皿にそれらを板します。</li>
		<li>100 mg/mL hygromycin 添加培養液中に transfected セルの培養液を交換します。</li>
		<li>非 transfected セルを除去するために 3 日間の培養細胞。中型の変更は必要ないことに注意してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trypsinize transfected セルと選択のための蛍光タンパク質を発現する細胞の人口を浄化します。受信機電池 pAI177 を運ぶ、グリーン PE チャネル mCherry 陽性細胞の人口の浄化のために並べ替えのゲートを設定します。送信者感光性細胞 pAI218 を運ぶ、APC チャネル iRFP713 陽性細胞の人口の浄化のために並べ替えのゲートを設定します。</li>
	<li>(省略可能)限られた希釈または単一細胞の FACS によるソートなどの標準的な方法によって栄養系セル人口を確立します。</li>
</ol>2. 人口レベルで設計された細胞の写真感度の評価
注: この部分では、生化学的な試金、qPCR など西部にしみが付くことによって青色光照明に Dll1 ligand 蛋白質の動的誘導を確認するプロトコルについて説明します。
<ol><li>光誘起条件あるいは暗条件のためのインキュベーター光源の有無の 2 種類をそれぞれ設定します。青色 LED トランス-照明、図 1 bに示すように光メーターを使用しての光強度をセットアップします。プログラムのタイミングと、シングル ボード マイクロ コント ローラー照明 (図 1) のプログラム可能なスケジュールを可能に制御スクリプトをロードすることによって光照射の期間。</li>
	<li>細胞カウンターと細胞をトリプシンと pAI218 と 35 mm 径プラスチック文化料理 (光条件の以上 12 の料理、暗条件の 1 皿) に pAI170 を運ぶ板 1.0 x 105感光性送信者セルをカウントし、料理闇/光の条件のためのインキュベーターを区切ります。料理の設定後、セル lysates の収集まで閉鎖インキュベーターのドアを保ちます。</li>
	<li>めっき後, 1 日開始光照射 (電池は 80% 以上に期待されて合流)。望ましくない光刺激を避けるために光に細胞を公開しないでください。 注: 照明用スケジュールは、実験の目的によって異なります。注意持続的な照明条件 (e.g。 光強度 40 µmol/m2/s で 1 分持続時間と 10 分間隔) は十分な写真誘導とその強い光の簡単なチェックは細胞に有害であります。したがって、照明のための無害なパラメーターが選択されていることを確認します。</li>
	<li>メッキ後、約 2 日間を 30 分間隔で細胞ライセート準備します。氷に、さらなる分析のためのセル lysates の準備を開始、インキュベーターから料理を移動します。</li>
</ol>3. 動的送信者-受信者人口レベルの試金: 光電子増倍管による光刺激に応じて細胞応答のリアルタイム モニタ リング
<ol><li>Trypsinize し、標準的な方法で送信者と受信機のセルの数をカウントします。5送信者細胞 (比率 1:5) 104受信機と 1.25 x 10 x 2.5 の懸濁液を混合の 1 mL の容量を準備します。 注意: 2:1、1:1 または 1:2 送信者と受信者間の比も動作 1.5 x 10 の総細胞数5。10
</li>
	<li>板 1 mM ルシフェリンを含む培養液中で 24 ウェル ブラック プレートの各ウェルに細胞を混合します。</li>
	<li>ルシフェラーゼ アッセイ用のプレート リーダーの細胞を分析し、出力信号が記録システムのあまり高くはないことを確認します。 注: 出力信号は 1 x 106光子数/秒より高い場合は、彼らを飽和可能性があります。出力信号が 1 x 106光子数/秒よりも低い場合、最適な値にルシフェリンの濃度を低減します。</li>
	<li>記録システムのプレートを設定し、録画プログラム (図 1) を開始します。たとえば、記録を設定した後 18 時間で光照射を開始します。 注: トレンド除去信号平均化とサビツキー ・ ゴーレイ フィルター、移動などの時間フィルタ リングは、ウェーブ フォームの可視化に役立ちます、ピークが検出されました。</li>
</ol>4. 単一細胞レベル動的に送信者と受信者間の試金: リアルタイム光遺伝学的摂動の制御の下で単一細胞応答のイメージング
<ol><li>プレート 0.5 x 105受信機と 2.5 倍の 27 mm 径ガラス基 35 mm 直径の皿に 105送信者細胞。その混合の割合と総細胞数 (セル密度) が正しく調整されことを確認します。</li>
	<li>めっき後の 1 日は記録媒体の 2 mL の培地を交換 (- フェノールレッド フリー DMEM 培 5 %fbs、ペニシリン ・ ストレプトマイシンと 1 mM ルシフェリン)、し、顕微鏡のガラス ベース料理を設定。必要に応じて、PBS (-) で死んだ細胞の残骸を洗い流します。 注: それは暗い状態でこの手順を実行することが望ましいです。</li>
	<li>37 ° C、5% CO2環境チャンバーを搭載した倒立顕微鏡を設定します。</li>
	<li>冷却 CCD カメラを設定します。CCD センサーの温度が送信先の値 (通常は、-90 ° C) まで冷却されることを確認します。</li>
	<li>
288 以上と 5 分間隔で画像をキャプチャする自動獲得ソフトウェアで「多次元タイムラプス」ウィンドウ パラメーターを設定 (1 つ以上一晩記録) 回。
	<ol>
<li>「多次元タイムラプス」ウィンドウを開き発光チャンネルと遅い 50 kHz 読み出しモード プルダウン ・ メニューから選択 4 × 4 の 4 分露出でビニング設定。読み出しモードが弱く発光生物発光を検出する読み出しノイズを減らすために不可欠な 50 kHz の低速モードに設定されているを確認します。</li>
		<li>「多次元タイムラプス」ウィンドウを開き蛍光チャンネル、高速の 1 MHz 読み出しモードをプルダウン ・ メニューから選択 2 × 2 の 400 ms 露出とビニングします設定。読み出しモードは、蛍光イメージングに必要な時間を短縮する高速の 1 MHz モードに設定されていることを確認します。</li>
		<li>時間経過「取得」ボタンをクリックして録音を開始します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>コマ撮り映画からの発光チャンネルの単一セルのトレースを画像解析ソフトで、次のとおり抽出します。まず、発光と蛍光画像をスタックを画像解析ソフトに画像データをインポートしてください。発光イメージ (「SpikeNoise フィルター」として実装)、前と次のフレームの時間のなかにピクセル値を置き換える、一時的に隣接する画像のピクセルの強度を比較することにより宇宙線由来のホット ピクセルを削除します。これらの加工イメージを空間的に平滑化フィルターに適用し、各フレームから out-field ビューの背景のピクセル値を減算します。その後、「関心領域」を決定 (ROI) 各時点で蛍光画像をセルごとに発光画像に ROI を適用し、各 ROI の発光強度を測定。</li>
</ol>

<ol><li>Hubaud, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+dynamics+in+vertebrate+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signalling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).</li>
<li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).</li>
<li>Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock%3A+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).</li>
<li>Tsiairis, C., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Organization+of+Embryonic+Genetic+Oscillators+into+Spatiotemporal+Wave+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns.</a> Cell. 164, 656-667 (2016).</li>
<li>Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+and+the+synchronization+of+the+somite+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock.</a> Nature. 408, 475-479 (2000).</li>
<li>Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+imaging+of+the+impact+of+Notch+signaling+and+mitosis+on+segmentation+clock+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics.</a> Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).</li>
<li>Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+inhibition+by+Lunatic+Fringe+underlies+the+chick+Segmentation+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock.</a> Nature. 421, 275-278 (2003).</li>
<li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nat. Commun. 3, 1141(2012).</li>
<li>Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes Dev. 30, 102-116 (2016).</li>
<li>Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+perturbation+and+bioluminescence+imaging+to+analyze+cell-to-cell+transfer+of+oscillatory+information%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information.</a> Genes Dev. 31, 524-535 (2017).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).</li>
<li>Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).</li>
<li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnology. 10, 3(2010).</li>
<li>Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).</li>
<li>Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+collective+behavior+in+social+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The onset of collective behavior in social amoebae.</a> Science. 328, 1021-1025 (2010).</li>
<li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160, 381-392 (2015).</li>
</ol>

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我々 は 2-3 h の周期性と遺伝子発現ダイナミクスを制御する手法を示した。このタイム スケールはテトのシステムと元のライトン システムなどを含む他の従来のものよりもはるかに短い。ウルトラジアン リズムの時間スケールに到達するための重要なパラメーターは、光誘起分子製品、Mrna、タンパク質の半減です。これらの速度論的パラメーターは、セルタイプおよび種によって異なります。速度をチューニングするには、シーケンスおよびターゲット蛋白質の機能は変わりませんのでストレートな方法は、Hes1 3' UTR シーケンスを他の人と交換します。他 3' 望ましい拍動パターンに特に興味のセルを取得する UTRs を求めて、生細胞の誘導灯で dLuc の監視は良い出発点、審査と検証に使用します。
最もよく寄せられる質問の 1 つは光感受性細胞の毎日の処理についてです。Notch シグナルの動的な送信者と受信者間の試金、場合体制 (写真誘導 dLuc Dll1 セルおよび受信機細胞) は、細胞増殖を変更できず、すぐに休憩に戻るできないので部屋のライトの下で細胞の通路を毎日行うことができました暗い状態に細...

細胞間通信は、発達過程で胚のパターン形成に重要な役割を果たします。脊椎動物の胚は、体節と呼ばれる体節構造と身体前後軸に沿って分割クロック1と呼ばれる計時時計の制御の下で一時的な精度で形成されています。このプロセス中に、presomitic 中胚葉 (PSM) セルのグループは、定期的に同期的な方法で体節に変換されます。このプロセスは、同期振動遺伝子発現と位相で振動 PSM 細胞同じ距離。振動遺伝子発現の期間は、約 2、3 時間マウス、ゼブラフィッシュでは約 30 分です。PSM 細胞は同期の2,3を失う解離場合が、再集計が、彼らを自己組織化でき、回復、人口同調4細胞間結合が、同期のためのキーであることを示唆振動。
広範な努力では、デルタ Notch 経路のシグナル伝達分子がセグメンテーション時計遺伝子の同期した振動にしっかりと接続されていることを明らかにしました。薬理学的阻害剤や Notch シグナルの遺伝の突然変異は、発振器の人口を desynchronize します。ゼブラフィッシュ、Notch シグナル コンポーネント、DeltaC、DeltaD、Notch1a などの変異体は、非同期振動5,6を表示します。ひよこやマウス胚では、ノッチ リガンド デルタ 1 に似た (Dll1) だけでなく、ノッチ変調器狂気フリンジ (Lfng) が同期した振動7,8,9に必要です。しかし、それされているセルからセルに動的な情報転送のためのような分子の機能をテストすることは困難摂遺伝子調節動態の時空間解像度を調査するための不足のため、2-3 h (ウルトラディアン リズム) の時間スケールのプロセス。
最近、哺乳類細胞10の遺伝子の発現パターンを制御し、監視する統合的な手法を開発しました。この技術によりウルトラジアン リズムの時間スケールで定期的な照明、遺伝子式パルス誘導します。このプロトコルは、感光性細胞ラインを確立し、細胞間コミュニケーションの文脈で監視ライブ セル発光によるレポーター細胞の動的応答を観察する方法を表します。このメソッドは、他の多くのシグナル伝達経路の解析に適用されます。

<table><tbody><tr><td>FACS</td><td>ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー</td><td>FACSAriaII SORP</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>Andor</td><td>iKon M-934</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX-81 ZDC</td><td></td></tr><tr><td>PMT デバイス</td><td>中立電機</td><td>CL24B-LIC/B</td><td></td></tr><tr><td>青色LEDイルミネーター</td><td>OptoCode</td><td>LEDB-SBOXH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>08459-35</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>KRYSTAL24 (黒 24 ウェルプレート)</td> <td>ハイテク</td><td>303012</td><td></td></tr><tr><td>D-ルシフェリンカリウム塩、</td><td>ナカライ</td><td>、20028-24</td><td></td></tr><tr><td>、露出計</td>、<td>LI-COR、バイオサイエンス、</td><td>LI-250A</td><td></td></tr><tr><td>、抗HA-ペルオキシダーゼ抗体</td>、<td>ロシュ</td><td>クローン3F10</td><td></td></tr>、<tr><td>抗アクチンペルオキシダーゼ抗体</td><td>、ワコー</td><td>クローン2F3</td><td></td></tr></tbody></table>

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

セルは、一時的、変化する周囲のセルから様々 な要因によって影響を受けている環境に適切に対応する必要があります。ノッチ シグナル伝達経路は、胚の正常な発達に重要な役割を果たしている細胞間の通信にこのような重要な分子機械のひとつです。この経路を含むウルトラディアン リズムと振動情報のセルに転送が、振動遺伝子における多細胞間相互作用の影響を解明する分子生物学的手法の進歩にもかかわらずチャレンジしておりますダイナミクス。ここでは、光遺伝学的制御と正確な一時的な方法で遺伝子発現パターンのライブ監視を可能にするプロトコルを提案する.このメソッドは正常に、Notch シグナルの細胞内および細胞間の周期的な入力同調固有振動周波数と位相シフト単一セルの解像度であることを明らかにしました。この方法は、多細胞系における動的遺伝子発現プログラムの機能的意義をテストするためのユニークなプラットフォームを提供する、様々 なシグナル伝達経路の動的特徴の解析に適用されます。

我々 は、ライトン システム11,12, 2-3 h の周期性をもつ遺伝的発振器の研究の哺乳類細胞における光誘起遺伝子発現を可能にする適応。このシステムは 2 つの部分の構成: 写真誘導性の転写活性化因子 hGAVPO および興味の任意の遺伝子の転写をドライブする UA プロモーター カセット。光誘起遺伝子発現の拍動の速度を加速するには、UA プロモーター カセットのポリア シーケンスはマウス Hes1 3' UTR 20 分マウス線維芽細胞で mRNA の半減期を短くと取替えられました。
安定したセルラインを確立、メダカ Tol2 転移システムに基づいて cistronic トライ ベクトルだった使用13 (図 1 a)。メダカ...

ここでは、振動情報の光遺伝学的制御による細胞間伝達を分析および遺伝子発現のモニタリング ライブにプロトコルを提案する.この方法は、多細胞系における動的遺伝子発現プログラムの機能的意義をテストするためのユニークなプラットフォームを提供します。

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

この実験の全体的な目標は、光遺伝学的制御と遺伝子発現のライブモニタリングにより、振動情報の細胞間移動を観察することです。この方法は、Notchシグナル伝達経路を介して細胞が互いにどのように通信するか、特に細胞が振動情報を互いに伝達する方法に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝子発現動態を非常に高い精度で制御および監視できることです。その手順を実演するのは、この新技術を開発した私の研究室の研究員である磯村明弘です。Tol2ベースの光遺伝学的モジュールのプラスミドベクターをトランスポゼース発現ベクターとともにC2C12細胞にトランスフェクションするには、まずトリプシン化した細胞をセルカウンターでカウントします。トランスフェクションの1日前に、1ウェルあたり50, 000個のC2C12細胞を12ウェルプレートにプレートします。次に、0.375マイクログラムのTol2ベースの光遺伝ベクター、0.125マイクログラムの薬物選択ベクター、および0.5マイクログラムのトランスポゼース発現ベクターをリポフェクション試薬を使用して同時トランスフェクションします。トランスフェクションした細胞をトリプシン化し、トランスフェクションの1日後に100mm培養皿にプレートします。トランスフェクションした細胞の培地を、100ミリグラム/ミリリットルのハイグロマイシンを添加した培地に交換します。細胞を3日間培養して、トランスフェクションされていない細胞を排除します。なお、媒体の変更は不要です。次に、トランスフェクションされた細胞をトリプシン化し、テキストプロトコルに詳述されているように、レシーバー細胞と光感受性細胞を選別することにより、選択のために蛍光タンパク質を発現する細胞の集団を精製します。光源付きと光源なしの2種類のインキュベーターを設置し、光誘起状態と暗所状態に対応します。照度計を使用して、青色LEDトランスイルミネーターの光強度を設定します。ドアを閉めた後の光量を測定します。制御スクリプトをシングルボード・マイクロコントローラにロードして、照明のスケジュールをプログラム可能なものにすることで、光の照明のタイミングと時間をプログラムできます。トリプシン処理された細胞をセルカウンターで数え、直径35ミリメートルのプラスチック培養皿にpAI218とpAI170を運ぶ100、000枚の感光性送信者細胞をプレートします。暗い条件と明るい条件のために別々のインキュベーターに皿を置きます。ディッシュを設置した後、細胞が溶解物を収集するまで、インキュベーターのドアを閉めたままにしてください。めっきから1日半後、照明点灯開始。望ましくない光刺激を避けるために、細胞を制御されていない光にさらさないでください。したがって、ドアを開けずにこの手順を実行してください。ここでドアを開けるのはデモンストレーションのためだけであることに注意してください。めっき後約2日後、インキュベーターから30分間隔でサンプル皿を氷に移し、さらなる分析のための細胞溶解物の調製を開始します。PMTによる光刺激に対する細胞応答をリアルタイムにモニタリングするためには、まず標準的な方法で送信細胞と受信細胞の数をトリプシンしてカウントします。25, 000 個のレシーバーと 125, 000 個のセンダーセルの 1 ミリリットルの総容量懸濁液を準備します。24ウェルブラックプレートの各ウェルに混合細胞を1ミリモルルシフェリンを含む培地でプレート化します。プレートリーダーでルシフェラーゼアッセイ用の細胞を解析し、出力シグナルが記録システムに対して高すぎないことを確認します。次に、プレートを録音システムにセットし、録音プログラムを開始します。たとえば、録画を設定してから18時間後にライト照明を開始します。光遺伝学的摂動の制御下での単一細胞応答のリアルタイムイメージングのために、最初に50, 000レシーバーと250, 000の送信者細胞を直径27ミリメートルのガラスベース35ミリメートルの皿にプレートします。混合比と総セル数が正しく調整されていることを確認してください。めっきの1日後、記録媒体の2ミリリットルと媒体を交換します。ガラスベース皿を、摂氏37度、二酸化炭素5%の環境チャンバーを備えた倒立顕微鏡にセットします。冷却されたCCDカメラをセットアップします。CCDセンサーの温度が目的地の値まで冷却されていることを確認してください。自動取得ソフトウェアで多次元タイムラプスウィンドウのパラメータを設定し、5分間隔で288回以上の画像をキャプチャします。多次元タイムラプスウィンドウで、発光チャネルを選択します。読み出しモードが、弱く発光する生物発光を検出するための読み出しノイズを減らすために重要な低速50キロヘルツ読み出しモードに設定されていることを確認します。多次元タイムラプスウィンドウで、蛍光チャンネルを選択します。読み出しモードが高速1メガヘルツモードに設定されていることを確認して、蛍光イメージングに必要な時間を短縮します。最後に、400ミリ秒の露出で2×2のビニングを設定します。次に、ジャーナルタブを選択して、定期的なブルーライト照明で細胞を刺激するスケジュールを設定します。プラス ボタンをクリックして、新しい仕訳設定を追加します。ジャーナルボックスからジャーナルファイルを選択し、複数のタイムポイントを選択し、初期ポイントボックスとインターバルボックスに値を設定して、刺激をスケジュールします。指定されたジャーナル・ファイルに、照明、シャッターの開き、遅延、シャッターの閉、および遅延を選択するためのシーケンシャル・プロトコルが含まれていることを確認してください。次に、定期的なブルーライト照明で細胞を刺激するスケジュールを設定します。最後に、 取得 ボタン。最後に、テキストプロトコルに記載されているように、タイムラプス動画から発光チャネルの単一細胞トレースを抽出します。オプトジェネティックな送信者-受信者アッセイの代表的な結果を以下に示します。光誘導性送信者細胞は、予想通り、周期的な青色光照射の存在下でデルタリガンド発現の振動パターンを産生しました。レシーバー細胞を光感受性センダー細胞と共培養し、反復光照明に曝露すると、リアルタイムの生物発光記録システムが、さまざまな混合比の条件下でレシーバー細胞の周期的な応答を検出します。さらに、反復光照明によるタイムラプス顕微鏡法では、単一細胞レベルでの受信者細胞の同期応答も明らかになります。その開発後、この技術は、細胞生物学の分野の研究者が、遺伝子発現の動的情報が細胞間相互作用でどのように伝達されるかを探求する道を開きました。

an-optogenetic-method-to-control-analyze-gene-expression-patterns

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

遺伝学と光学系を組み合わせた神経科学のツールの最近の開発は、空間的および時間解像度の前例のないレベルの神経回路の活動を制御することができ、「光遺伝学」と呼ばれる。ここでは、前頭前皮質及びsubicular錐体ニューロンの遺伝的に定義されたサブセットのoptogenetic操作で、生体内の記録に統合するためのプロトコルを提供する。...

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法<em&gt;インビボ</em

Optogeneticsは、行動神経科学の実験で使用するための強力なツールとなっています。このプロトコルは、レーザーシステムの設計とセットアップのステップバイステップガイドを提供し、ほとんどのげっ歯類の行動試験パラダイムと互換性のある複数の同時in...

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

このプロトコルは、そのまま神経回路内で選択的な遺伝子の発現低下と特にシナプス研究を刺激するために光遺伝学と人工のマイクロ Rna を介した RNA...

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

特定の神経集団や脳領域の光遺伝学的操作により、自由に動く動物の高い時間的および空間的分解能で行動を修正することができる。慢性に埋め込まれた光ファイバーと組み合わせて異なる光遺伝学的ツールを使用することにより、さまざまな神経変調および行動検査を行うことができます。...

自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作

光応答性哺乳動物細胞を確実に制御するには、光遺伝学的方法の標準化が必要です。この目標に向けて、本研究では、ネガティブフィードバック光遺伝学遺伝子回路を用いた光誘導遺伝子発現の研究を標準化するための遺伝子回路構築、細胞工学、光遺伝学的装置操作、検証アッセイのパイプラインをケーススタディとして概説する。...

哺乳類細胞における安定した光遺伝学的遺伝子回路を確実にエンジニアリングおよび制御

小分子基質であるルシフェリンを酸化するルシフェラーゼ酵素によって放出される生物発光光は、光感覚タンパク質を活性化するために利用することができ、それによって光刺激に別の次元を加え、時間的および空間的スケールにわたって細胞内の多数の光媒介機能の操作を可能にする。...

生物発光光遺伝学2.0:生体内および生体内で光感覚タンパク質を活性化するための生物発光の利用

微生物代謝の光遺伝学的制御は、発酵プロセスに対する柔軟な動的制御を提供する。ここでのプロトコルは、異なる体積スケールでの化学およびタンパク質生産のための青色光調節発酵を設定する方法を示しています。...

微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵

このプロトコルでは、cAMPセンサーと光遺伝学的タンパク質であるbPAC-nLucをトランスフェクションして、その細胞内分布と光刺激に対する応答を正確に追跡します。ポイントスキャンシステムを使用してcAMP応答マップを作成する革新的なアプローチは、さまざまな分野の光遺伝学的タンパク質の研究を前進させる可能性を秘めています。...

光刺激グリッドを用いた光遺伝学的タンパク質の細胞分布のマッピング

シグナル伝達経路の光遺伝学的操作は、発生、再生、恒常性、および疾患においてシグナル伝達がどのように解読されるかを調べるための強力な戦略となり得ます。このプロトコルは早いゼブラフィッシュの胚の光酸素電圧感知の領域基づかせていた節および骨のmorphogenic蛋白質(BMP)のシグナリングの活性剤を使用するための実用的な指針を提供する。...

ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

このプロトコルは、タンパク質活性の可逆的な時空間制御のための設計された青色光活性化アロステリックスイッチ(LightR)ドメインの適用について説明しています。この研究では、Srcチロシンキナーゼをモデルとして利用し、光制御Src(LightR-Src)を開発および特性評価するための精巧なプロトコルを提供します。これは、酵素クラス間でのこのアプローチの多様性を示しています。...

光遺伝学的アロステリック制御によるタンパク質活性の時空間制御

本研究では、3DプリントされたLEDアレイを用いたハイスループット実験を行い、HEK293T細胞における光誘導性遺伝子発現を最適化する方法を紹介します。...

哺乳類の遺伝子発現を制御するための光誘導システムの迅速な最適化

学ぼう、光遺伝学的制御と遺伝子発現のライブモニタリングを用いて、C2C12細胞における振動情報の細胞間伝達を観察する方法です。Notchシグナル伝達経路を介した細胞コミュニケーションの動態を高精度に解析できます。

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

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