Name: 超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶ単一分子アレイデジタルELISA法による超高感度インターフェロン-α検出。ヒトサンプル中のIFN-α亜型を検出し、自己免疫疾患と感染症におけるバイオマーカー発見と患者管理改善に応用する。

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DD と YJC ANR からサポートを認める (プロジェクト IFNX ないです。CE17001002) と ImmunoQure AG モノクローナル抗体を提供するため。我々 は臨床サンプルを提供するためブリジット バーダー ムニエ、ナタリア Bellon、クリスティン Bodemer、アレックス Belot、イザベル Melki をピエール ・ カルティエをありがちましょう。YJC 認める欧州研究評議会 (GA 309449: フェローシップ YJC を)、および軸受け ANR-10-IAHU-01 参照「未来への投資」プログラムの下で国立研究所 (フランス) によって管理される国庫補助。

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ここで、開発と人間サンプル (表 1にまとめた手順) で IFN α タンパク質の直接定量再現性の高い、超高感度単一分子配列デジタル elisa 法の検証について述べる。アッセイの開発で最も重要な手順の 1 つは、抗体ペア16動態と正常な試金の鍵をされているエピトープ結合面で特性の選択です。同じエピトープをターゲットまたは立体障害が発生する一対のモノクローナル抗体の使用を避けることが重要です。ポリクローナル抗体は、このような制限を克服するために抗体を検出として使用できます。特定の手順で必要な感度が得られない場合にさらに最適化の可能性が考慮されなければなりません。これは蛋白質の種類などのパラメーターの変更、代替抗体ペアの使用を含めることができます (例えば BSA < カゼイン)、pH (6.0 8.5)、イオン強度、緩衝能力 (例えば塩化ナトリウム、リン酸塩濃度)、キャリア ビーズや界面活性剤の存在。パラメーターの広い範囲コン単一分子配列分析を開発するときに最適化。しかし、全体的に、高い信号: バック グラウンド比と最小限の Lod を与える条件が好ましいもの (図 1図 2、および図 3を参照)。
特異性に関する IFN α アッセイを示した他の Ifn の交差反応をテスト (β、γ、λ1、λ2、ω) (図 4 a) され、すべて 13 IFN α サブタイプ (図 4 b) の検出が可能。しかし、アッセイは、IFN α 2 サブタイプ、(図 4 bおよび補足の表 4) に低い親和性を示した。興味深いことに、IFN-α 2 (a、b、c) の別のクラスの別の感度も観察、個別製造手順や異なるアミノ酸配列に起因する可能性がありますされた IFN α 2 のサブタイプが異なるコマーシャルから得られました。サプライヤー。この唯一の例外には、IFN α のすべての種は、非常に似た応答を与えた。抗 IFN-α (図 6および表 6 の補足) 信号を廃止する、クローンによる試料の前処理によってさらにアッセイの特異性を示した。
この技術の主な利点の 1 つは興味の任意の試料が対象となる16にすることができます潜在的です。さらに、異なる生物学的標本をテストできます、血清、プラズマ、脳脊髄液、細胞溶解液、培養上清中31息さえ32など。通常、プラズマの 1:3 希釈が単一分子配列アナライザーの潜在的な目詰まりを避けるために行われます。しかし、興味の analyte が関連する生物学的サンプルでは非常に低濃度で存在できる、サンプル濃度が高い可能性があります (アッセイ感度) によって必要な33。34良い感度を維持しながら多重化の可能性がある、それはより挑戦的なプロセスと同じ実験内 6 タンパク質がまだ35を開発するより大きい測定のための試金。
検出し、サイトカインとそのような低濃度で他の生物学的関連性の高い蛋白質を定量化する機能は、アプリケーション33,36の全く新しい範囲を開きます。多数のタンパク質が今まで最高の Elisa37の検出限界以下であった非常に低濃度でも効果を及ぼすことが知られています。他イムノアッセイ技術は、従来の ELISA19上の利点を提供して、ここことを示す単一分子配列デジタル ELISA における低濃度サイトカインの超高感度検出のための再現性と堅牢なプラットフォーム人間のサンプル。そのため、この技術は、バイオ マーカー探索と病気の広い範囲の患者管理の向上のための巨大な潜在性を提供しています。

型 Ifn、抗ウイルス免疫応答を調整する際に中心的な役割を担うサイトカインの家族。彼らが初めて発見されたアイザックスと Lindenmann 60 年前 (13 の IFN-α サブタイプおよび IFN β 1) 14 さまざまなサブクラスをポリペプチドのこの異種族に装備1,2そしてそれは今知られています。私 Ifn はウイルス感染との隙間に欠かせないが、また様々 な人間の病気の状態、若年性皮膚筋炎 (JDM) である自己免疫疾患全身性エリテマトーデス (SLE) などの病理に関与している種類と種類私は interferonopathies 構成型 IFN 誘導されたシグナリング私の病理3,4,5,6、7の結果します。
勉強タイプ I IFN 蛋白生体試料中レベル挑戦されているその最初の識別から、「妨害物質」として1,2。現在、サンドイッチ酵素免疫測定法 (ELISA) は、最も広く使用されている IFN-α タンパク質の検出法です。にもかかわらず、特定、シンプルで、急速な私に限られた感度など IFN Elisa 現在重要な制限事項を入力します。また、IFN α サブタイプのすべての測定では、検出能力と感度複数のアッセイの使用が必要です。別のサブタイプの IFN-α を検出する市販 Elisa、その感度は限られて (1.95 pg/mL、12.5 pg/mL、および 12.5 pg/mL、それぞれ) をしばしば不十分である生体試料の IFN-α タンパク質を検出します。この制限を克服するために定量化するアッセイを開発されているいくつかの生物学的プロキシ タイプ I IFN 誘導遺伝子の発現や機能の活動8,9,10、11,を測定することによって12,13,14. それにもかかわらず、これらの試金は IFN α タンパク質の直接測定を提供しています。
本研究では単一分子配列デジタル ELISA 技術は IFN α タンパク質分子の検出のための試金を開発に使用しました。デジタル ELISA が従来の ELISA と同じ基本的な化学を利用して、ただし、反応が 50,000 個々 46 サイズ用いた井戸15,16を含む配列で起こる。単一タンパク質分子は抗体をコーティングした常磁性ビーズによってキャプチャされ、ビオチン標識検出の抗体、酵素共役、ストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼ (SBG) のバインド順にラベル付け。その後、ビーズ蛍光酵素基質、ら-β-D-ガラクトピラノシド (RGP)、分子配列を中断しています。ボリュームを減少させることによって反応 2, 000, 000 回17、蛍光シグナルの高い局所濃度を達成、各分子が確実にできるようになりました信号を生成する、実現可能になる単一分子数が18を測定します。本質的に単一の分子配列は単一の immunocomplexes をカウントし、酵素ビーズ (AEB) ごとの平均数を決定することができます。タンパク質濃度と immunocomplexed ビーズとビーズの現在の合計数の比と直接相関があるタンパク質分子の定量化/デジタル化ができるように信号が検出されたマイクロウェルをカウント用いたサイズの部屋。
・ ヨンら。19の異なるプラットフォーム間で測定精度、感度、およびデータの相関性を比較する目的で 9 つの異なる技術と 4 つのサイトカインの免疫を使用して広範なクロス プラットフォームの評価研究を行います。研究の主要な調査結果の 1 つは単一分子配列および分子免疫をカウントがサブ pg/mL の濃度範囲内の血清中サイトカインの検出の最高感度を表示されることでした。単一分子配列のデジタル ELISA サイトカインのアッセイは、Crohn 病20、interferonopathy および自動免疫患者7IFN α TNF α, il-6 の役割を研究に使用されている、異なるファーストクリーニング C X のフォームを変更慢性肝炎とシタグリプチン21,22を受け取る健康なドナーのモチーフ ケモカイン 10 (CXCL10)。他のアプリケーションには、糖尿病網膜症23; 患者ロドプシンの測定ニューロ フィラメントの血清/血漿計測による脳の病態の研究光の24とアミロイド β 1-42 ペプチド25多発性硬化症、アルツハイマー病のコンテキストでそれぞれ。HIV ウイルスの貯蔵所26, 特性評価など改良された病原体検出のための DNA27とマイクロ Rna の28の検出、単一分子配列の試金を使用もできます。単一分子アレイ技術の主な利点は、抗体ペアが使用可能な場合、関心の任意の試料に対してアッセイを開発できる、汎用性の高いこの。さらに、自作アッセイ キットが市販するプロトコルは以下の変更された形態の詳細な新しいアッセイの開発が可能します。
ここでは、単一分子配列分析のための開発と検証の手順の詳細な説明は、IFN α タンパク質検出感度が強化されたでその結果が提示されます。単一分子配列の試金のための抗体は特異性の高い (と種特異性が関連する場合と見なされます) の関連蛋白質との交差反応を避ける必要があります。理想的には、10-9 M より小さい KDが付いている抗体を選択必要があります。高い親和性により、高い信号の生産との強い結合です。抗体抗原の結合の動態もでK 重要な高速、オフ遅い K 抗原抗体複雑なアセンブリが支持されます。高感度単一分子配列のアッセイを取得のチャンスを高める良いパフォーマンスは、1 100 pg/mL の検出 (LOD) の制限の古典的な ELISA 抗体ペアから始まります。チャンと同僚は、分析感度18を予測する方程式のセットを提案してすべて 1 つのステップで起こる生体分子の相互作用の詳細な速度論的研究を実行しました。彼らはデジタル ELISA 抗体親和性の広い範囲内で有効であることが表示されますその単一分子配列を示した (KD 〜 10−11 - 10− 9 M) と同様、信号の生成はそのような抗体の率に依存して。
高い親和性を利用するには、抗体自己免疫性 polyendocrinopathy 症候群の患者から分離された抗体の利用をしましたが 1/自己免疫 polyendocrinopathy カンジダ症-外胚葉性ジストロフィー (APS1/APECED)29を入力します。理由はまだ理解されていないが、アイレ欠損患者の大多数が高親和全 IFN α サブタイプ29抗体のコア セットを開発し、我々 は相補的な結合親和性の 2 つの抗インターフェロン α 抗体クローンを選択別の IFN α サブタイプ IC50値によって推定されるようです。これらのユニークな高親和性抗体と単一分子アレイ ・ テクノロジーの組み合わせは、attomolar (fg/mL) 濃度で IFN α の直接定量を有効にします。このような超高感度の IFN-α 蛋白質の検出は、自然、規制および異なった病気設定でインターフェロン誘起反応の生物学的影響のより良い理解に貢献します。

<table><tbody><tr><td>抗体 A(8H1クローン)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>市販品発売なし</td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alpha;抗体B(12H5クローン)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>市販品発売なし</td></tr><tr><td>抗体 EBI-1クローン</td><td>eBioscience</td><td>BMS216C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alpha;抗体BMS216BKクローン</td><td>eBioscience</td><td>BMS216BK</td><td>ELISAキットではなく、バルクABS</td></tr><tr><td>IFNおよびα。2c</td><td>eBioscience</td><td>BMS305</td><td>OK</td></tr><tr><td>IFN & α;I (17)</td><td>PBL</td><td>11150-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & α;2a</td><td>PBL</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & アルファ;2a</td><td>PeproTech</td><td>IFN & alpha は利用でき</td><td></td>なくなりました</tr><tr><td>。2b</td><td>PBL</td><td>11105-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & アルファ;1</td><td>PBL</td><td>11175-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & アルファ;4a(M1)</td><td>PBL</td><td>11177-1</td><td></td></tr><tr><td>IFNおよびα;4b (a4)</td><td>PBL</td><td>11180-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & α;B2 (a8)</td><td>PBL</td><td>11115-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & アルファ;C(a10)</td><td>PBL</td><td>11120-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN&アルファ;D(a1)</td><td>PBL</td><td>11125-1</td><td></td></tr><tr><td>IFNおよびα;G (a5)</td><td>PBL</td><td>11135-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & α;F(a21)</td><td>PBL</td><td>11130-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN&アルファ;H2 (a14)</td><td>PBL</td><td>11145-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & α;J1 (a7)</td><td>PBL</td><td>11160-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & α;K (a6)</td><td>PBL</td><td>11165-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & α;WA (a16)</td><td>PBL</td><td>11190-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & ラムダ;1</td><td>PeproTech</td><td>300-02L</td><td></td></tr><tr><td>IFN & ラムダ;2</td><td>ペプロテック</td><td>300-02K</td><td></td></tr><tr><td>IFN & オメガ;</td><td>PeproTech</td><td>300-02J</td><td></td></tr><tr><td>IFN &ベータ;</td><td>PeproTech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>IFN &ガンマ;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>アンチIFN-&alpha;ELISA</td><td>PBL</td><td>41115.1</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>ISRE-Reporter</td><td>Qiagen</td><td>CCS-008L</td><td></td></tr><tr><td>Fu-GENE HD トランスフェクション試薬</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter assay</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substitute</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計 NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>販売終了</td><td></td></tr><tr><td>Amicon micocentrifuge チューブ - 0.5mL filtres</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC505096</td><td></td></tr><tr><td>Bead Conjugation Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>別途注文できません</td></tr><tr><td>非エンコード常磁性ビーズ</td><td>Quanterix</td><td>101360</td><td></td></tr><tr><td>ビーズウォッシュバッファー</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>単品注文不可</td></tr><tr><td>EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>11844071</td><td></td></tr><tr><td>ビーズブロッキングバッファー</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>単品注文不可</td></tr><tr><td>ビーズ希釈バッファー</td><td>Quanterix</td><td>101362</td><td></td></tr><tr><td>検出器とサンプル希釈液</td><td>Quanterix</td><td>101359</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化反応バッファー</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>単品注文不可</td></tr><tr><td>NHS-PEG4-ビオチン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11891195</td><td></td></tr><tr><td>diH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7mL 微量遠心チューブ用遠心分離機(Heraens Fresco 21 遠心分離機)</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002478</td><td></td></tr><tr><td>標準ラボ用ボルテックスミキサー (MS2 ミニシェーカー)</td><td>IKA</td><td>MS2</td><td></td></tr><tr><td>ピペット (10, 20, 200 and 1000 &mu;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tips(10、20、200、1000 &mu;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7mL微量遠心チューブ</td> 1.7mL微量遠心チューブに対応する<td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁気セパレーター(Life Technologies DynaMag-2)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>ミニ卓上遠心分離機(Galaxy MinisStar)</td><td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr>ミキサー<tr><td>/シェーカー(Eppendorf Thermomixer Comfort)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single molecule Array (Simoa) 試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBG, ビーズ&検出器 バーコードラベル</td><td>Quanterix</td><td>101652</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 試薬ボトル</td><td>Quanterix</td><td>102411</td><td></td></tr><tr><td>Simoa 試料 96ウェルプレート</td><td>Quanterix</td><td>101457</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Discs</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td>100001</tr><tr><td>Simoa 2.0 導電性のヒント</td><td>Quanterix</td><td>101726</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Cuvettes</td><td>Quanterix</td><td>100803</td><td></td></tr><tr><td>Simoa SBG 試薬</td><td>Quanterix</td><td>102295</td><td></td></tr><tr><td>Simoa RGP 試薬</td><td>Quanterix</td><td>101736</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 1</td><td>Quanterix</td><td>100486</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 2</td><td>Quanterix</td><td>100487</td><td></td></tr><tr><td>シーリングオイル</td><td>Quanterix</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simoa HD-1 Analyzer</td><td>Quanterix</td><td>100032</td><td></td></tr><tr><td>Technologies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1分子アレイ (Simoa)</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1分子計数Erenna Immunoassay Systems</td><td>Singluex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

このプロトコルの主な目的は、開発とインターフェロン (IFN) の検証を記述することです-α 分子配列デジタル酵素結合抗体法 (ELISA) 試金。このシステムは、前例のない感度とは交差しなかった IFN の他の種の人間の IFN-α タンパク質の定量を可能。 にします。
プロトコルの最初のキーのステップは、キャプチャ抗体の共役続く常磁性ビーズおよび検出の抗体のビオチン化抗体ペアの選択です。次のこの手順では、最適感度を達成するまで、試験構成、検出抗体濃度バッファー組成などさまざまなパラメーターを変更できます。最後に、結果の信頼性を確保するため特異性と法の再現性を評価します。ここでは、0.69 fg/ml の自己免疫の polyendocrinopathy を引き起こす自己免疫レギュレータ (アイレ) 蛋白質のシュミレーション変異患者から分離した高親和性抗体を使用して検出限界と IFN α 分子配列アッセイを開発しました。症候群の種類 1/自己免疫 polyendocrinopathy-カンジダ症-外胚葉性ジストロフィー (APS1/APECED)。重要なは、これらの抗体は、すべて 13 IFN α サブタイプの検出を有効にします。
この新しい手法により、検出および IFN α タンパク質の定量 attomolar 濃度で生体試料中初めて。このようなツールは人間の健康と病気の状態、このサイトカインのレベルの監視に便利ですになりますほとんど特に感染症、自己免疫疾患、および autoinflammation。

要約すると、0.69 fg/mL、キャプチャ ビーズを使用した 2 段構成の検出限界とパン IFN-α 分子配列試金コーティング 0.3 mg/ml 抗 IFN-α、抗体および抗 IFN-α B 検出抗体ビオチン化ビオチン: 抗体の比で30 が開発されました。ビオチン標識検出の抗体と SBG に使用濃度が 0.3 μ g/mL と 150 分、それぞれ。この非常に特定のアッセイはすべて 13 IFN α サブタイプを検出と Ifn の他のタイプとクロスも反応しません。したがって、IFN α のそれぞれの個々 の種の定量化可能なはなく、それらのすべては検出することができます、IFN α 13 のさまざまなサブクラスを含むため濃度値を一緒に与えて測定します。
この新しく開発されたアッセイの潜在的な診断価値を探索するには、プラズマと健全な個人からの血清の IFN-α タンパク質を測定し、SLE や JDM から患者からのサンプルと比較して.図 7に示すように、IFN α タンパク質の高レベルが健常者と比較して両方の疾患コホートで検出されました。点線は、従来市販 elisa 法は、これらの表現型を持つこのサイトカインの知られている連合にもかかわらずこれらの患者のグループでこのアプローチ IFN α タンパク質が検出がないを示しますの LOD を示します。さらに、1-10 fg/mL アッセイの非常に敏感な性質を確認する間検出可能なレベルと、アッセイの広いダイナミック レンジを示す大きさの 5 のログを上書き IFN α を定量化することができます。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> 図 7: プラズマと患者コホートからの血清の IFN-α タンパク質の定量化します。この図は、Roderoらから変更されています。2017。 健常者からプラズマ (n = 20) と SLE 患者 (n = 72) と JDM (n = 43) パン インターフェロン分子配列分析とテストされました。一方通行 ANOVA テスト (クラスカル-ウォリス) とダンの多重比較のグループ間のテストを使用して分析を行った。中央が描かれています。点線を示します参照人間抗 IFN-α ELISA の LOD (1.95 pg/mL = 1950 fg/mL)。<a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ステップ</td>
			<td>上の考慮事項</td>
			<td>参照</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. 抗体ペアの選択</td>
			<td>ターゲットの異なるエピトープ</td>
			<td rowspan="3">テーブル 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>親和性が高い</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kの高速/低速 Kオフ
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. 抗体ペア向き</td>
			<td rowspan="3">最低検出限界条件を選択します。</td>
			<td rowspan="3">図 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. 抗体濃度をキャプチャします。</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. ビオチン: 検出器抗体比</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 と 3 ステップの構成</td>
			<td>最高の信号: バック グラウンド比の条件を選択します。</td>
			<td>図 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. 検出器抗体濃度</td>
			<td rowspan="2">最低検出限界条件を選択します。</td>
			<td rowspan="2">図 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. SBG 濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. 特異性</td>
			<td>交差反応性を評価します。</td>
			<td rowspan="2">図 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. 感度</td>
			<td>(該当する場合) のサブタイプの認識を評価します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. 再現性</td>
			<td>試金の変動を評価します。</td>
			<td>図 5</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 開発および単一分子配列分析の最適化手順の概要です。この表は、開発と再現性の評価まで抗体ペアの最初の選択からの単一分子配列分析の最適化のために必要な異なる手順をまとめたものです。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>抗原</td>
			<td>8 H 1 (A)</td>
			<td>12 H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51.3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64.7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0.63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0.83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0.71</td>
			<td>43.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0.77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: パン α 抗体選択します。IC50 (ng/mL) を用いてインターフェロン刺激応答要素 (資料)-ルシフェラーゼ中和アッセイ。IFN α サブタイプのすべてに単一分子配列試金で使用される抗体の IC50 値を表に示します。10,000 HEK 293 MSR 細胞白半部 96 ウェル プレートでシード, 50 ng 予事業ホタル ルシフェラーゼ レポーターと製造元の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いる Renilla ルシフェラーゼ構成逆 transfected。ルシフェラーゼ発現コンストラクトは、内部正規化コントロールとして提供しています。加湿雰囲気で 5% CO2 0.5% 牛胎児血清 37 ° C で、1 mM ピルビン酸ナトリウム 0.1 mM 必須でないアミノ酸を添加した減少血清培地で一晩培養細胞。一晩インキュベートした後細胞が遺伝子組換えヒト IFN-α 反 IFN α モノクローナル抗体またはコントロール 37 ° C で 1 時間虫されていた igg 抗体の有無の混合物を含む培地で 24 時間刺激されました。刺激の 24 h 後デュアル ルシフェラーゼ レポーター アッセイは、製造元の指示に従って行われました。«-» 未定します。Sifalimumab は、IFN α サブタイプの大半を中和して完全ひと免疫グロブリン G1 κ モノクローナル抗体Rontalizumab は、IFN α に対するヒト化モノクローナル抗体です。マイヤーら2016 と Roderoらから適応2017。
補足表 1: 抗体の向きの選択キャプチャ抗体濃度ビーズ、ビオチン化比率。検出抗体 (A) と副として捕獲抗体と抗 IFN-α B 反 IFN α A を使用して、2 つの可能な異なる構成がテストされましたバーサ (B)。インターフェロン-2 c は、抗原として使用されました。異なる捕獲抗体濃度としてビオチン: 抗体 (B:A) 比は、どちらの構成もテストされました。飽和 (Sat)。LOD 計算に使用されたオレンジ: AEB 値これらの濃度は、底堅く推移して AEB の値として空白と考えられていた。LOD 求めた意味空白 + 3SD です<a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。</a> 。
補足テーブル 2: 2 対 3 ステップ構成のテスト。2 と 3 のステップ構成は、抗原としてインターフェロン-2 c を使用して評価されました。AEB 値だけでなく、シグナル/バック グラウンド配給 (S/B) とおり両方の条件です。<a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足テーブル 3: 検出器と SBG 濃度の最適化。Sbg 社の 3 つの異なる濃度とともにビオチン検出抗体 (0.1、0.3、0.6 μ g/mL) の 3 つの異なる濃度 (250、150、50 分) 評価しました。AEB 値の 9 つのテスト条件のとおりです。LOD 計算に使用されたオレンジ: AEB 値これらの濃度は、底堅く推移して AEB の値として空白と考えられていた。LOD 求めた意味空白 + 3SD です<a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。</a> 。
補足表 4: 最適化されたインターフェロン分子配列アッセイの感度と特異性。ビーズの値ごとの平均の酵素は、IFN β、IFN λ1、IFN λ2、インターフェロン-ω、IFN-γ 遺伝子組換えタンパク質がテストしたとき (A)、16 サブタイプの IFN-α (B) と共に表示されます。«-» 未定します。<a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足表 5: 最適化されたインターフェロン分子配列分析の再現性です。すべての 3 つの独立した実行の平均 AEB 値は、10.000 fg/mL の濃度表示されます。«-» 未定します。飽和 (Sat)。<a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足テーブル 6: 蛋白質の競争の試金。ビーズの値ごとの平均の酵素のテストのすべての条件のとおりです。重複の測定を行った。<a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

ここで開発および単一分子配列デジタル ELISA 法、人間のサンプルですべての IFN-α サブタイプの超高感度検出を可能にする検証を記述するプロトコルを提案する.

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

この方法は、自己免疫や感染など、さまざまな疾患環境におけるインターフェロン誘発応答の性質、調節、および生物学的影響に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、それ自体が社長の感度です。この技術は、これまでにない感度でサイトカインを定量化できるため、多くの疾患における患者管理を改善するバイオマーカー発見に大きな可能性を秘めています。このアプローチの主なステップは、自己免疫性ポリインドクリン系タイプ1の患者に関連する活動を中和することでした。まず、2億8,000万個の常磁性ビーズをマイクロチューブにロードし、その量に注意してください。次に、ビーズをパルス回転させ、チューブを磁気セパレーターに1分間置きます。希釈剤溶液を取り外して廃棄し、ビーズを分離します。次に、ビーズをBWBで2回、BCBで2回洗います。洗浄するたびに、200マイクロリットルを追加し、チューブを5秒間ボルテックスします。次に、磁気セパレーターを使用してビーズを溶液から分離します。1分間分離した後、希釈剤を廃棄します。次に、ビーズ体積あたり190マイクロリットルのBCBを追加します。次に、チューブを短時間ボルテックスし、チューブをパルス回転させ、洗浄したビーズを氷の上に置きます。ビーズを活性化するには、1ミリリットルの冷たいBCBと10ミリグラムのEDCを組み合わせ、溶液が均一になるまでボルテックスします。EDCを使用すると、その固有の不安定性と公平性ソリューションにより、迅速かつ安全に作業できます。次に、ビーズ懸濁液にビーズ容量あたり10マイクロリットルの冷たく希釈したEDCを加え、ビーズを短時間ボルテックスします。次に、ビーズを室温のシェーカーに30分間置きます。抗体をビーズに結合させるために、まずボルテックスとパルスが活性化されたビーズを回転させます。次に、ビーズを磁気セパレーターに1分間入れ、BCB上清を捨てます。次に、チューブを磁石から取り外し、ビーズを200マイクロリットルのBCBで2回洗います。次に、渦巻き、パルススピン、およびビーズを磁気的に分離してバッファを除去します。次に、200マイクロリットルの冷たい緩衝液交換抗体を活性化ビーズにすばやく加えます。溶液にビーズをボルテックスした後、懸濁液を室温シェーカーに1, 000 RPMで2時間置きます。まず、抗体でコーティングしたビーズ懸濁液にパルススピンを与え、次に磁気カラムを使用してバッファーを除去します。次に、バッファー中のタンパク質の濃度を確認します。低容量の分光光度計を使用してください。この時点で、抗体はビーズに結合しており、ゼロを超える値はビーズが抗体で飽和していることを意味します。次に、以前のすべての洗浄で行われたように、200マイクロリットルのBWBでビーズを洗浄します。次に、上清を新しいチューブに移し、タンパク質濃度を確認します。ビーズから放出されるタンパク質を定量化することで、抗体のカップリングを測定することができます。その後、ビーズを再び200マイクロリットルのBWBで洗います。次に、200マイクロリットルのビーズブロッキングバッファーを追加し、チューブを5秒間ボルテックスし、室温のシェーカーに30分間移します。30分後、ビーズはブロックされます。その後、200マイクロリットルのBWBで1回洗浄し、その後、200マイクロリットルのビーズ希釈液バッファーで2回洗浄します。次に、コーティングしてブロックしたビーズを、摂氏4度の200マイクロリットルのビーズ希釈液バッファーに保管します。ビデオのこのセクションでは、自家醸造構成で single molecule array analyzer ソフトウェアを使用してアッセイ条件を微調整する方法の戦略を提案します。まず、捕捉抗体標識ビーズとビオチン化検出抗体のさまざまな組み合わせを、両方の抗体の組み合わせで試験します。次に、3つの異なる捕捉抗体濃度と2つの異なるビオチン化比の組み合わせを試験し、検出と捕捉抗体、またはその逆を行います。次に、検出レベルが最も低い組み合わせを選択し、それを以降の手順に使用します。この場合、ビオチンと抗体の比率が30対1の場合、検出の限界が最適になります。次に、2 ステップ構成と 3 ステップ構成を比較します。3ステップ構成には、3つの異なるインキュベーションステップがあります。1つは捕捉抗体、1つは検出抗体、そして最後に3つ目はSBG酵素標識用です。2ステップ構成では、捕捉と検出のインキュベーションが組み合わされています。選択した捕捉抗体と検出器抗体の濃度と配給量を、メーカーの指示に従って分析装置で事前に設定された2ステップおよび3ステップの構成で使用して、1分子アレイ分析装置を実行します。次に、最高の感度を可能にする構成を選択し、将来のステップのために保持します。この場合、2ステップ構成では、すべてのテストポイントでわずかに高い感度が得られます。次に、検出器抗体とSBGの濃度を最適化します。3つの異なる濃度の検出器抗体を、3つの異なる濃度のSBGで試験します。最高の感度が得られる濃度を選択し、将来のステップのためにそれらを保持してください。この場合、抗体1ミリリットルあたり0.3マイクログラムと150ピカモルのSBGは、偶然の中振幅でバックグラウンドレベルが低く、最適な検出レベルが得られます。その他の最適化手順については、テキスト プロトコルを参照してください。そこには、アッセイの特異性と再現性を最適化するための手順と、タンパク質競合のためのアッセイがあります。インターフェロン-αの13のサブクラスを検出するために最適化されたアッセイを使用して、SLE患者、JDM患者、および健康なコントロールで血漿と血清を分析しました。高レベルのインターフェロン-αタンパク質が両方の疾患コホートで検出されました。.点線は、これらの疾患におけるこのサイトカインの既知の役割にもかかわらず、これらの患者グループでインターフェロンαタンパク質を検出しない従来の市販のElizaの検出レベルを示しています。このビデオを見れば、選択した解析のための単一分子アレイアッセイの開発方法とバリデーション方法について十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、細胞内で抗体を選択することを覚えておくことが重要です。開発以来、このアッセイは、多様な自己免疫疾患および感染症におけるインターフェロンαの役割をより良く特徴づけることを可能にしてきました。このアッセイは、新しい治療法に対する反応をモニターし、特定の自己免疫疾患の原因となる細胞アクターを特定するのにも役立っています。

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定量的な、高スループット、リアルタイム、及びSiO上にラベルフリー生体分子の検出（DNA、タンパク質など）...

干渉反射イメージングセンサー（IRIS）を用いた生体分子の検出

この方法は、高感度で感染マウスの気管支肺胞洗浄（BAL）液中のH1N1を検出するための赤外線染料ベースのイメージングシステムの使用方法について説明します。試験材料の&lt;10μlの体積を必要とし、複数の病原体の同時スクリーニングのための可能性を秘めている、または384ウェルプレート -...

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

ヒトパピローマウイルスなどの局所感染を引き起こす病原体のT細胞エピトープを特性解析することは、血中に存在するT細胞数が限られているため困難です。本手法では、ごく少数の細胞から希少なT細胞を単離し、その特性を解析する方法について説明します。...

ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

ルミネックス社のXMAPのミクロスフィア技術を使用して、我々は様々な実験動物種のserosurveillanceの多重蛍光イムノアッセイ（MFIA）を開発しました。 MFIAは、抗原、組織制御や免疫グロブリンが共有結合し、色分けされたポリスチレン微小球にリンクされているサスペンションマイクロアレイである。...

多重化された蛍光イムノアッセイテスト方法とトラブルシューティング

このビデオは、マウスの脾臓におけるin...

マウスリンパ器官におけるインターフェロン-ガンマ分泌物の同定のためのアッセイ

このビデオは、HEK-Blueインターフェロンα/βレポーター細胞を使用して、HIV-1感染CD4+...

分泌胚性アルカリホスファターゼレポーターアッセイを用いた生理活性型I型インターフェロンの定量(英語)

このプロトコルは、I型およびIII型のIFN発現シグネチャーを分析するためのハイスループットqRT-PCRアッセイについて説明しています。このアッセイでは、これらの遺伝子の非常に類似した転写産物間の一塩基対の違いを区別します。バッチアッセンブリーとロボットピペッティングにより、アッセイは一貫性と再現性があります。...

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

印刷された糖鎖マイクロアレイ戦略を使用して、従来の96ウェルプレートアッセイを小型化し、インフルエンザAウイルスのヘマグルチニンの結合性とシアル酸含有受容体の特異性を分析しました。...

インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの結合力および特異性を評価するための小型糖鎖マイクロアレイアッセイ

現在では、複雑なサンプル準備と高価な計測器が必要し、低リソース環境では使用しにくいジカ、チクングニア ウイルスおよびデング...

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

このレポートでは、自動スライドステーナーでのマルチプレックス免疫蛍光(mIF)アッセイの自動化プロトコルについて説明します。これは、標準的なハイスループット組織オートステイナーおよびホールスライド蛍光イメージャーでの空間プロテオミクスの高い再現性を実証しており、トランスレーショナルリサーチにおける多数の組織スライドにわたるカスタムmIFアッセイに最適です。...

トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

学ぶ単一分子アレイデジタルELISA法による超高感度インターフェロン-α検出。ヒトサンプル中のIFN-α亜型を検出し、自己免疫疾患と感染症におけるバイオマーカー発見と患者管理改善に応用する。

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

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