超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

この方法は、自己免疫や感染など、さまざまな疾患環境におけるインターフェロン誘発応答の性質、調節、および生物学的影響に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、それ自体が社長の感度です。この技術は、これまでにない感度でサイトカインを定量化できるため、多くの疾患における患者管理を改善するバイオマーカー発見に大きな可能性を

このアプローチの主なステップは、自己免疫性ポリインドクリン系タイプ1の患者に関連する活動を中和することでした。まず、2億8,000万個の常磁性ビーズをマイクロチューブにロードし、その量に注意してください。次に、ビーズをパルス回転させ、チューブを磁気セパレーターに1分間置きます。

希釈剤溶液を取り外して廃棄し、ビーズを分離します。次に、ビーズをBWBで2回、BCBで2回洗います。洗浄するたびに、200マイクロリットルを追加し、チューブを5秒間ボルテックスします。

次に、磁気セパレーターを使用してビーズを溶液から分離します。1分間分離した後、希釈剤を廃棄します。次に、ビーズ体積あたり190マイクロリットルのBCBを追加します。

次に、チューブを短時間ボルテックスし、チューブをパルス回転させ、洗浄したビーズを氷の上に置きます。ビーズを活性化するには、1ミリリットルの冷たいBCBと10ミリグラムのEDCを組み合わせ、溶液が均一になるまでボルテックスします。EDCを使用すると、その固有の不安定性と公平性ソリューションにより、迅速かつ安全に作業できます。

次に、ビーズ懸濁液にビーズ容量あたり10マイクロリットルの冷たく希釈したEDCを加え、ビーズを短時間ボルテックスします。次に、ビーズを室温のシェーカーに30分間置きます。抗体をビーズに結合させるために、まずボルテックスとパルスが活性化されたビーズを回転させます。

次に、ビーズを磁気セパレーターに1分間入れ、BCB上清を捨てます。次に、チューブを磁石から取り外し、ビーズを200マイクロリットルのBCBで2回洗います。次に、渦巻き、パルススピン、およびビーズを磁気的に分離してバッファを除去します。

次に、200マイクロリットルの冷たい緩衝液交換抗体を活性化ビーズにすばやく加えます。溶液にビーズをボルテックスした後、懸濁液を室温シェーカーに1, 000 RPMで2時間置きます。まず、抗体でコーティングしたビーズ懸濁液にパルススピンを与え、次に磁気カラムを使用してバッファーを除去します。

次に、バッファー中のタンパク質の濃度を確認します。低容量の分光光度計を使用してください。この時点で、抗体はビーズに結合しており、ゼロを超える値はビーズが抗体で飽和していることを意味します。

次に、以前のすべての洗浄で行われたように、200マイクロリットルのBWBでビーズを洗浄します。次に、上清を新しいチューブに移し、タンパク質濃度を確認します。ビーズから放出されるタンパク質を定量化することで、抗体のカップリングを測定することができます。

その後、ビーズを再び200マイクロリットルのBWBで洗います。次に、200マイクロリットルのビーズブロッキングバッファーを追加し、チューブを5秒間ボルテックスし、室温のシェーカーに30分間移します。30分後、ビーズはブロックされます。

その後、200マイクロリットルのBWBで1回洗浄し、その後、200マイクロリットルのビーズ希釈液バッファーで2回洗浄します。次に、コーティングしてブロックしたビーズを、摂氏4度の200マイクロリットルのビーズ希釈液バッファーに保管します。ビデオのこのセクションでは、自家醸造構成で single molecule array analyzer ソフトウェアを使用してアッセイ条件を微調整する方法の戦略を提案します。

まず、捕捉抗体標識ビーズとビオチン化検出抗体のさまざまな組み合わせを、両方の抗体の組み合わせで試験します。次に、3つの異なる捕捉抗体濃度と2つの異なるビオチン化比の組み合わせを試験し、検出と捕捉抗体、またはその逆を行います。次に、検出レベルが最も低い組み合わせを選択し、それを以降の手順に使用します。

この場合、ビオチンと抗体の比率が30対1の場合、検出の限界が最適になります。次に、2 ステップ構成と 3 ステップ構成を比較します。3ステップ構成には、3つの異なるインキュベーションステップがあります。

1つは捕捉抗体、1つは検出抗体、そして最後に3つ目はSBG酵素標識用です。2ステップ構成では、捕捉と検出のインキュベーションが組み合わされています。選択した捕捉抗体と検出器抗体の濃度と配給量を、メーカーの指示に従って分析装置で事前に設定された2ステップおよび3ステップの構成で使用して、1分子アレイ分析装置を実行します。

次に、最高の感度を可能にする構成を選択し、将来のステップのために保持します。この場合、2ステップ構成では、すべてのテストポイントでわずかに高い感度が得られます。次に、検出器抗体とSBGの濃度を最適化します。

3つの異なる濃度の検出器抗体を、3つの異なる濃度のSBGで試験します。最高の感度が得られる濃度を選択し、将来のステップのためにそれらを保持してください。この場合、抗体1ミリリットルあたり0.3マイクログラムと150ピカモルのSBGは、偶然の中振幅でバックグラウンドレベルが低く、最適な検出レベルが得られます。

その他の最適化手順については、テキスト プロトコルを参照してください。そこには、アッセイの特異性と再現性を最適化するための手順と、タンパク質競合のためのアッセイがあります。インターフェロン-αの13のサブクラスを検出するために最適化されたアッセイを使用して、SLE患者、JDM患者、および健康なコントロールで血漿と血清を分析しました。

高レベルのインターフェロン-αタンパク質が両方の疾患コホートで検出されました。.点線は、これらの疾患におけるこのサイトカインの既知の役割にもかかわらず、これらの患者グループでインターフェロンαタンパク質を検出しない従来の市販のElizaの検出レベルを示しています。このビデオを見れば、選択した解析のための単一分子アレイアッセイの開発方法とバリデーション方法について十分に理解できるはずです。

この手順を試みる際には、細胞内で抗体を選択することを覚えておくことが重要です。開発以来、このアッセイは、多様な自己免疫疾患および感染症におけるインターフェロンαの役割をより良く特徴づけることを可能にしてきました。このアッセイは、新しい治療法に対する反応をモニターし、特定の自己免疫疾患の原因となる細胞アクターを特定するのにも役立っています。